ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على المشاكل الرئيسية في مجالات علم الفيروسات وعلم الأحياء الدقيقة المتعلقة بتعداد البكتيريا من العينات المعقدة والتشخيص والعلاجات القائمة على البكتيريا. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تمكن من القياس الكمي الفعال والدقيق للوقت لعدد كبير من العينات من تجارب عرض phage biopanning غير مجدية مع المقايسات التقليدية. ومن خلال هذا الإجراء سيكون رشمي موهانتي وجاسم ليال، طالبان في الدراسات العليا من مختبري.
بعد تصميم التمهيديات وخلق تركيز المخزون، والحصول على الحمض النووي T7 phage المرجعية بتركيز 0.1 ميكروغرام لكل ميكرولتر. باستخدام الماء فائق الخطورة ، تمييع هذا الحمض النووي بمقدار عشرة أضعاف ، من مليون رسم femtogram لكل ميكرولتر إلى واحد femtograms لكل ميكرولتر في أنابيب PCR 0.2 ملليلتر. إعداد 20 ميكرولترات من كل تركيز، مع التأكد من تغيير نصائح الماصات ودوامة الأنابيب بين كل مرحلة من مراحل التخفيف.
ثم تحويل تركيز الحمض النووي المرجعي T7 phage من femtograms لكل ميكرولتر إلى نسخ الجينوم لكل ميكرولتر. أولاً، الماصات 200 ميكرولترات من عينة استنساخ Phage T7 في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير 1.5 ملليلتر لكل عينة من العينات المطلوبة 10. إضافة اثنين microliters من DNase واحد لكل أنبوب.
اِكُنَي الأنابيب و احتضنها عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في حمام جاف ساخن. ثم احتضان في 100 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في حمام جاف ساخن. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب التي تحتوي على phages المعالجة حراريا في 18، 534 مرات ز لمدة 10 ثانية.
ضع الأنابيب المُهزَّة على خلاط دوامة تم ضبطه في وضع التنشيط باللمس لمدة 10 ثوانٍ لخلط الففاجات. تدور مرة أخرى في 18، 534 مرات ز لمدة 10 ثانية. بعد ذلك، اترك العينات على مقاعد البدلاء في المختبر حوالي ساعة واحدة لتبريدها إلى درجة حرارة الغرفة.
إعداد بريميكس qPCR ل10 عينات الفراج ذات 10 بيهية من تركيز غير معروف وسبع عينات من التركيزات القياسية في ثلاثية. نتج عنه premix ل51 عينة تحتوي على 255 ميكرولترات من مزيج سيد qPCR ، 51 ميكرولترات من الزهرات الأولية و 102 ميكرولترات من الماء. Aliquot ثمانية ميكرولترات من مزيج PCR المعدة في 51 بئرا من لوحة qPCR 96 جيدا.
يضاف التالي اثنين من ميكرولترات من عينات T7 phage المعالجة حراريًا لكل من هذه الآبار، وصرفها تحت سطح ما قبل الوميض qPCR. باستخدام فيلم لاصق، ختم لوحة. التفاف لوحة في رقائق الألومنيوم للحد من تبييض الصور fluorescence ومن ثم المضي قدما لتشغيل لوحة على معدات qPCR.
قم بإعداد شروط ركوب الدراجات وذوبان إعدادات المنحنى كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد تشغيل qPCR ، يتم تحليل مؤامرة التضخيم ، مؤامرة منحنى الذوبان ، والمؤامرة متعددة المكونات من البيانات الخام. وتشير مؤامرة التضخيم إلى ما إذا كان تضخيم PCR لكل عينة ناجحاً أم لا.
وتمثل المؤامرة المتعددة المكونات تضخيم وتسوس الإشارة الفلورية طوال دورات التضخيم. في حين يتم استخدام مؤامرة منحنى الذوبان للتحقق من خصوصية التمهيديات، لأن كل منتج PCR لديه درجة حرارة ذوبان فريدة واحدة. ثم يتم إنشاء المنحنى القياسي من الحمض النووي المرجعي.
هنا يتم حساب كفاءة التضخيم لتكون 92.4٪ بيانات ممثل من دراسة qPCR ثم مقارنة إلى نفس phage التي تم تحديدها كميا من قبل اختبار لوحة طبقة مزدوجة في مجموعة اختبارها من 10 إلى 10 مليون نسخة الجينوم لكل ميكرولتر. كما رأينا هنا، وعدد من phages في كمية qPCR أعلى مما كانت عليه في مقايسة البلاك. ويعتبر تكرار طريقة qPCR كما يمثلها معامل التباين أن لها قيم تتراوح بين 2.85 إلى 27.2٪أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن هناك اعتبارات عديدة في تطوير واستخدام qPCR لتحديد حجم الفواغات بدقة، بما في ذلك العلاج الدقيق وإعداد العينات ومعايرة المعدات ذات الصلة.
باتباع هذه الطريقة، يمكن تنفيذ تقنيات أخرى من أجل تعداد جزيئات phage في مجموعة متنوعة من التطبيقات المدرجة في vivo biopanning، تحضير الحمض النووي مكتبة phage وجيل الجيل التالي الكشف عن phage في العينات البيئية المعقدة. لا تنس أن الفاج تعتبر مخاطر بيولوجية في المختبر وينبغي دائما ارتداء الاحتياطات مثل معدات الحماية الشخصية، بما في ذلك القفازات ومعاطف المختبر، أثناء إجراء العملية.
