The authors thank Miss Ching-Chun Lin and Miss Diana Lin of the Core Facility of the Institute of Cellular and Organismic Biology (ICOB) of Academia Sinica for offering their expertise on peptide synthesis and DNA sequencing, respectively. This study was supported by Academia Sinica.

1. إعداد وحيدة النسيلة الأجسام المضادة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة RG-M56 الماوس وحيدة النسيلة خلايا هجين 2 في المصل خالية المتوسطة في قوارير 175T في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 الملحق. جمع طاف عند لون المتوسطة يتحول إلى اللون الأصفر بعد خمسة أيام من الحضانة. ملاحظة: كانت خلايا ورم هجين مثقف في المتوسط ​​خالية من المصل لتجنب تلوث الأجسام المضادة من المصل البقري الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لطاف في 4500 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية، وتجاهل بيليه الحطام الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 مل من بروتين G الاغاروز (كما زودت الطين 50٪) إلى عمود 5 مل وتتوازن مع 10 مجلدات الراتنج (10 مل) من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل 200 مل من طاف الأجسام المضادة (الخطوة 1.2) على عمود وتجاهل المار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 مل من الجليد الباردة PBS إلى العمود لأنه يغسل. كرر مرتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 مل من 50 ملي الجلايسين، ودرجة الحموضة 2.7 إلى العمود إلى أزل الأجسام المضادة بروتين G المصاحب. العقيدlect 900 كسور ميكرولتر في أنبوب microcentrifuge تحتوي على 100 ميكرولتر من 10X العازلة تحييد (1 M تريس، 1.5 M كلوريد الصوديوم، و 1 ملي EDTA، ودرجة الحموضة 8.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين الجسم المضاد النقي في 50٪ الجلسرين مع 0.03٪ نان 3 في -20 درجة مئوية. </li></ol> 2. البناء والتعبير عن تسلسليا اقتطاع البروتينات المؤتلف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد PCR خليط التفاعل: 5 ميكرولتر من العازلة 10X PFU، 0.2 ملم من كل dNTP، 0.2 ميكرومتر التمهيدي إلى الأمام 3 و 0.2 ميكرومتر التمهيدي العكسي 3، 2 ملي MgSO 4، 1 نانوغرام من pET20b-1A59 3 DNA البلازميد، و 2.5 U ( وحدة) من البلمرة PFU الحمض النووي. إضافة ده 2 O إلى الحجم النهائي من 50 ميكرولتر. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات تشغيل في cycler الحرارية التلقائي باستخدام المعلمات التالية: دورة 1 (94 درجة مئوية لمدة 5 دقائق)؛ دورات 2-36 (94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 63 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و 72 درجة مئوية لمدة 60 ثانية). ودورة 37 (72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) المنتجات باستخدام تنقية عدة PCR 5 لتسهيل ما يلي انزيم الهضم قيود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هضم شظايا تضخيم الحمض النووي PCR مع تجربة الاقتراب من الموت أنا وXho أنا أنزيمات التقييد وligate كل هذه الشظايا الحمض النووي في تجربة الاقتراب من الموت أنا وXho I-المشقوق انزيم PET-20B (+) ناقلات. تحويل ثوابت في كولاي DH-5α المختصة خلايا 6. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير خليط الهضم العازلة في الهضم (20 ملي تريس، خلات، 10 ملي المغنيسيوم (CH 3 COO) 2، 50 ملم KCH 3 COO، و 1 ملي DTT، ودرجة الحموضة 7.9) مع 1 ميكروغرام من تضخيم الحمض النووي PCR أو PET-20B (+) الحمض النووي ناقلات، و2 U من تجربة الاقتراب من الموت أنا وتقييد Xho أنا الانزيمات في الحجم النهائي من 20 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزج الخليط الهضم بلطف وتدور بسرعة إلى أسفل. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة في حمام جافة لضمان القطع الكامل للقيود الجلوسوفاق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج تقييد هضم انزيم شظايا الحمض النووي باستخدام تنقية عدة PCR 5 لتسهيل بناء البلازميد التالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير خليط ربط العازلة في ربط (66 ملي تريس، 5 ملي MgCl 2، 1 ملم ATP و 5 ملي DTT، ودرجة الحموضة 7.5) مع 100 نانوغرام من مهضوم، تضخيم الحمض النووي PCR، 10 نانوغرام من مهضوم PET-20B (+) الحمض النووي ناقلات، و 5 يغاز U من T4 الحمض النووي في الحجم النهائي من 10 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزج الخليط ربط بلطف وتدور بسرعة إلى أسفل. احتضان عند 16 درجة مئوية لمدة 18 ساعة في حمام مائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 10 ميكرولتر من العينات ربط إلى 100 ميكرولتر من الخلايا DH-5α الحكومية المختصة وتخلط بلطف قبل وضع أنبوب microcentrifuge على الجليد لمدة 30 دقيقة. وضع أنبوب microcentrifuge في حمام الجافة في 42 درجة مئوية لمدة 90 ق للحث على الصدمة الحرارية 7. على الفور نقل أنبوب على الجليد لمدة 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 900 ميكرولتر من لوريا، Bertani (LB) مرق (1٪ Bacto تريبتون، 0.5٪ Bacto الخميرة المقتطفر، و 0.5٪ كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.0) لأنبوب. احتضان عند 37 درجة مئوية مع 150 دورة في الدقيقة تهتز لمدة 45 دقيقة. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 4000 ز س لمدة 10 دقيقة وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend وبيليه مع 50 ميكرولتر من مرق LB ونشر كل تحول على لوحات LB استعد مسبقا تحتوي على 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط مستعمرة واحدة باستخدام تلميح 200 ميكرولتر ووضعه في 3 مل من مرق LB تحتوي على 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين في توج فضفاضة 15 مل أنبوب. احتضان عند 37 درجة مئوية مع 150 دورة في الدقيقة تهتز لمدة 12 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج DNA البلازميد 8 من كل ثقافة وتسلسل ذلك باستخدام المروج T7 وT7 التمهيدي فاصل لتأكيد تسلسل 9. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تأكيد تسلسل، وتحويل 10 نانوغرام من الحمض النووي من هذه الحيوانات الأليفة 20B (+) البلازميدات مع أطوال YGNNV جين البروتين معطف متفاوتة في BL-21 (DE3) سلالة كولاي من قبلناجي طريقة للحرارة صدمة 7. اتبع الخطوات 2.3.6-2.3.8 لتنفيذ التحويل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل مستعمرة واحدة من كل تتحول كولاي BL-21 خلية في 3 مل من مرق LB تحتوي على 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين في توج فضفاضة 15 مل أنبوب. احتضان الثقافة في 37 درجة مئوية مع 150 دورة في الدقيقة تهتز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبريد الثقافة إلى 25 درجة مئوية عند OD 600 من ثقافة حوالي 0.6 وإضافة IPTG إلى تركيز النهائي من 0.4 ملم للحث على التعبير عن بروتين المؤتلف. احتضان الثقافة ل4 ساعات اضافية في 25 درجة مئوية مع 200 دورة في الدقيقة تهتز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 1 مل من ثقافة إلى أنبوب microcentrifuge. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 12000 x ج لمدة 1 دقيقة وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend وبيليه الخلية في 100 ميكرولتر من العازلة تمسخ (8 M اليوريا و 20 ملي فوسفات الصوديوم، وكلوريد الصوديوم 0.5 M، ودرجة الحموضة 7.4) من قبل pipetting صعودا وهبوطا مع micropipette. مزيج من قبل vortexing قوية. ملاحظة: سول عينةالآن يجب أن يكون utions شبه شفافة، لزجة قليلا، وعلى استعداد لتهجين فحص نقطة وصمة عار. </li></ol> 3. تصميم وتجميع من الببتيدات تداخل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصميم وتركيب 3 مسلسل الببتيدات 20 مير التي تتداخل مع بعضها مع خليفتها بنسبة 10 بقايا أأ من المنطقة 195-338 أأ من البروتين معطف YGNNV لتضييق المنطقة حاتمة من RG-M56 ماب بواسطة النشاف نقطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصميم وتركيب الببتيدات 3 ثلاث 8-مير (195 VNVSVLCR 202، 197 VSVLCRWS 204، و 199 VLCRWSVR 206) مع وجود تداخل من 6 بقايا أأ على الببتيد الاصطناعية المقبل لتضييق المنطقة حاتمة من 195-206 أأ من قبل النشاف نقطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصميم وتركيب 3 7-مير (196 NVSVLCR 202 و 195 VNVSVLC 201)، 6-مير (195 VNVSVL 200، 196 NVSVLC 201، و 197 VSVLCR 202)، و 5 مير الببتيدات (195 VNVSV 199، 196 NVSVL 200، 197 VSVLC 201، و 198 SVLCR 202) مع وجود تداخل بين 6 و 5 و 4 بقايا أأ، على التوالي، على الببتيدات المجاورة لها للحد من المنطقة حاتمة بواسطة النشاف نقطة. </li></ol> 4. نقطة وصمة عار التهجين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل كل الببتيد توليفها في سلفوكسيد ثنائي ميثيل ([دمس]) إلى تركيز النهائي من 10 ملغ / مل. ملاحظة: للتغلب على الذوبان متنوعة من الببتيدات الاصطناعية، يجب أن يتم حل جميع الببتيدات الاصطناعية في DMSO. DMSO هو مذيب جيد لإذابة تماما الببتيدات مسعور أو ماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقع الغشاء البولي فينيل الفلوريد (PVDF) مع الميثانول لمدة 2 دقيقة. ملاحظة: غشاء PVDF هو ما يصل الى مقاومة للDMSO 100٪؛ البعض الآخر قد لا تكون كذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتوازن غشاء PVDF مع العازلة تعديل Towbin (25 ملي تريس، 192 الجلايسين ملم، و 0.1٪ SDS، ودرجة الحموضة 8.3) ل2 دقيقة. ملاحظة: 10-20٪ (ت / ت) من الميثانول يمكن أن تضاف إلى عازلة Towbin تعديلها لتحسين نتائج نقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف قطعة من الورق اللوني مع العازلة Towbin تعديلها. وضع غشاء PVDF على ورقة اللوني. انتظر حتى اختفى عازلة Towbin معدلة من سطح الغشاء PVDF قبل المتابعة إلى الخطوة التالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 ميكرولتر من كل عينة الببتيد إلى الغشاء مع طرف 10 ميكرولتر. الهواء الجاف الغشاء PVDF على ورقة اللوني لمدة 10 دقيقة. إضافة كل عينة الببتيد ببطء وتدريجيا على الغشاء لتجنب الكثير من نشرها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منع غشاء العازلة في TBST (0.05٪ (ت / ت) توين-20، و 20 ملي تريس، و 150 ملي مول كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.4) مع الحليب الخالي 5٪ لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الهز لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة RG-M56 ماب في التخفيف النهائي من 1: 1000 العازلة في TBST مع الحليب الخالي من 5٪ إلى الغشاء. احتضان الغشاء في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع الهز لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأجسام المضادة لذلكlution. غسل غشاء العازلة في TBST لمدة 5 دقائق مع اهتزاز لطيف. كرر مرتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الضد الثانوية (الماعز المضادة للمفتش الماوس، FC، مترافق الفوسفاتيز القلوية) في التخفيف النهائي من 1: 5000 العازلة في TBST مع الحليب الخالي من 5٪ إلى الغشاء. احتضان الغشاء في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع الهز لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل حل الأجسام المضادة. غسل غشاء العازلة في TBST لمدة 5 دقائق مع اهتزاز لطيف. كرر الخطوة غسل مرتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطوير الغشاء مع الحل الركيزة BCIP / NBT في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة في الظلام. وقف النامية عن طريق غسل غشاء مع [ده 2 O عندما تظهر إشارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الهواء الجاف الغشاء والتقاط صورة نقطة وصمة عار باستخدام نظام الصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس كثافة كل وصمة عار نقطة باستخدام صورة برامج التحليل 3. </li></ol> 5. الضوئي ألانين وتبديل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصميم وتركيب 3 ألانين وميثيالببتيدات استبدال onine. استبدال كل بقايا أأ مع ألانين لالببتيد 8 مير 195 VNVSVLCR 202 وتوليف الببتيد 195 ANVSVLCR 202، 195 VAVSVLCR 202، 195 VNASVLCR 202، 195 VNVAVLCR 202، 195 VNVSALCR 202، 195 VNVSVACR 202، 195 VNVSVLAR 202، و 195 VNVSVLCA 202 . استبدال أأ بقايا يسين 200 إلى ميثيونين لإنشاء SJNNV الوراثي حاتمة الببتيد 195 VNVSVMCR 202. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع القسم 4 لأداء المسح ألانين والطفرات استبدال دوت التنشيف. </li></ol>

<ol>
	<li>Milstein, C., Kohler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+variations+of+myelomatous+cells+(proceedings).">Clonal variations of myelomatous cells (proceedings).</a> Minerva Med. 68 (50), 3453 (1977).</li><li>Lai, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+neutralization+by+monoclonal+antibodies+against+yellow+grouper+nervous+necrosis+virus+(YGNNV)+and+immunolocalization+of+virus+infection+in+yellow+grouper+Epinephelus+awoara+(Temminck+&amp;+Schlegel).">In vitro neutralization by monoclonal antibodies against yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) and immunolocalization of virus infection in yellow grouper Epinephelus awoara (Temminck &amp; Schlegel).</a> J Fish Dis. 24 (4), 237-244 (2001).</li><li>Chen, C. W., Wu, M. S., Huang, Y. J., Cheng, C. A., Chang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+Linear+B-Cell+Epitope+of+Betanodavirus+Coat+Protein+by+RG-M18+Neutralizing+mAB+Inhibits+Giant+Grouper+Nervous+Necrosis+Virus+(GGNNV)+Infection.">Recognition of Linear B-Cell Epitope of Betanodavirus Coat Protein by RG-M18 Neutralizing mAB Inhibits Giant Grouper Nervous Necrosis Virus (GGNNV) Infection.</a> PLoS One. 10 (5), 0126121 (2015).</li><li>Lai, Y. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+yellow+grouper+nervous+necrosis+virus+(YGNNV)+in+a+new+nodavirus-susceptible+cell+line+from+yellow+grouper,+Epinephelus+awoara+(Temminck+&amp;+Schlegel),+brain+tissue.">Propagation of yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) in a new nodavirus-susceptible cell line from yellow grouper, Epinephelus awoara (Temminck &amp; Schlegel), brain tissue.</a> J Fish Dis. 24 (5), 299-309 (2001).</li><li>Lougee, E., Morjaria, S., Shaw, O., Collins, R., Vaughan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+HLA+typing+designed+for+solid+organ+transplantation:+epityping+and+its+application+to+the+HLA-A+locus.">A new approach to HLA typing designed for solid organ transplantation: epityping and its application to the HLA-A locus.</a> Int J Immunogenet. 40 (6), 445-452 (2013).</li><li>Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+gateway+system+for+double+shRNA+expression+and+Cre/lox+based+gene+expression.">Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression.</a> BMC Biotechnol. 11, 24 (2011).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method.">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> J Vis Exp. (6), e253 (2007).</li><li>Pronobis, M. I., Deuitch, N., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Miraprep:+A+Protocol+that+Uses+a+Miniprep+Kit+and+Provides+Maxiprep+Yields.">The Miraprep: A Protocol that Uses a Miniprep Kit and Provides Maxiprep Yields.</a> PLoS One. 11 (8), e0160509 (2016).</li><li>Metzker, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+technologies+in+DNA+sequencing.">Emerging technologies in DNA sequencing.</a> Genome Res. 15 (12), 1767-1776 (2005).</li><li>Chiu, C. C., John, J. A., Hseu, T. H., Chang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+ayu+(Plecoglossus+altivelis)+Pit-1+in+Escherichia+coli:+its+purification+and+immunohistochemical+detection+using+monoclonal+antibody.">Expression of ayu (Plecoglossus altivelis) Pit-1 in Escherichia coli: its purification and immunohistochemical detection using monoclonal antibody.</a> Protein Expr Purif. 24 (2), 292-301 (2002).</li><li>Atassi, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenic+structures+of+proteins.+Their+determination+has+revealed+important+aspects+of+immune+recognition+and+generated+strategies+for+synthetic+mimicking+of+protein+binding+sites.">Antigenic structures of proteins. Their determination has revealed important aspects of immune recognition and generated strategies for synthetic mimicking of protein binding sites.</a> Eur J Biochem. 145 (1), 1-20 (1984).</li><li>Opuni, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+epitope+mapping.">Mass spectrometric epitope mapping.</a> Mass Spectrom Rev. , (2016).</li><li>Chang, C. Y., Chiu, C. C., Christopher John, J. A., Liao, I. C., Lea&#241;o, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Aquaculture of Groupers. , 207-224 (2008).</li><li>Conti-Tronconi, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-bungarotoxin+and+the+competing+antibody+WF6+interact+with+different+amino+acids+within+the+same+cholinergic+subsite.">Alpha-bungarotoxin and the competing antibody WF6 interact with different amino acids within the same cholinergic subsite.</a> Biochemistry. 30 (10), 2575-2584 (1991).</li><li>Briggs, S., Price, M. R., Tendler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+specificity+of+antibody+recognition+of+carcinoma-associated+epithelial+mucins:+antibody+binding+to+synthetic+peptide+epitopes.">Fine specificity of antibody recognition of carcinoma-associated epithelial mucins: antibody binding to synthetic peptide epitopes.</a> Eur J Cancer. 29 (2), 230-237 (1993).</li><li>Chen, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+Structures+of+a+Piscine+Betanodavirus:+Mechanisms+of+Capsid+Assembly+and+Viral+Infection.">Crystal Structures of a Piscine Betanodavirus: Mechanisms of Capsid Assembly and Viral Infection.</a> PLoS Pathog. 11 (10), e1005203 (2015).</li><li>Badani, H., Garry, R. F., Wimley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+entry+inhibitors+of+enveloped+viruses:+The+importance+of+interfacial+hydrophobicity.">Peptide entry inhibitors of enveloped viruses: The importance of interfacial hydrophobicity.</a> Biochim Biophys Acta. , (2014).</li><li>Qureshi, N. M., Coy, D. H., Garry, R. F., Henderson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+putative+cellular+receptor+for+HIV-1+transmembrane+glycoprotein+using+synthetic+peptides.">Characterization of a putative cellular receptor for HIV-1 transmembrane glycoprotein using synthetic peptides.</a> AIDS. 4 (6), 553-558 (1990).</li></ol>

The authors have no conflicts of interest related to this report.

يوفر هذا البروتوكول تقنية سريعة ومباشرة لتحديد حاتمة الخطية المعترف بها ماب. مع الأخذ بعين الاعتبار تكلفة تركيب الببتيد وكفاءة الإنتاج من الببتيدات وتوليفها، تم تخفيض المنطقة مولدة للبروتين معطف الفيروس عن طريق التعبير عن البروتينات المؤتلف اقتطاع متسلسل قبل تحلي...

في الجهاز المناعي، وإعادة التركيب من شرائح V و D و J يسمح لأجسام مضادة لخلق اختلافات هائلة من المناطق التكامل تحديد (تقارير الإنجاز الموحدة) للربط إلى مختلف المستضدات لحماية المضيف من العدوى المسببة للأمراض. الدفاع تحييد الأجسام المضادة ضد المستضدات يعتمد على التكامل المكاني بين تقارير الإنجاز الموحدة من الأجسام المضادة والحواتم من المستضدات. ولذلك، فإن فهم هذا التفاعل الجزيئي مساعدة تصميم لقاح وقائي والتنمية الببتيد المخدرات العلاجية. ومع ذلك، قد تتأثر هذا التفاعل تحييد كل من المجالات مولدة متعددة من مستضد واحد واحد وتقارير الإنجاز الموحدة متعددة من الأجسام المضادة، والتي بالتالي جعل عملية تحديد حاتمة أكثر تعقيدا. لحسن الحظ، وتطوير تكنولوجيا هجين، التي تدمج الخلايا المنتجة للأجسام المضادة الفردية مع خلايا المايلوما، يسمح لدفعة تقسيم باستمرار من الخلايا ثانية<html> الأجسام المضادة المحددة شبكة شعيرية واحد، والمعروفة باسم الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (ماب) 1. خلايا هجين تنتج هذه النقية، MABS عالية تقارب ربط إلى مجال الأنتيجين واحد لمستضد معين. مع العلاقة بين مستضد الضد المعمول بها، العديد من الطرق، بما في ذلك المسح الببتيد، ويمكن استخدامها لتحديد حاتمة من مستضد باستخدام ماب المقابلة. جعلت التطورات الحديثة في تكنولوجيا الببتيد الاصطناعية تقنية الببتيد المسح الضوئي أكثر سهولة وأكثر ملاءمة لأداء. لفترة وجيزة، ويتم إنتاج مجموعة من تداخل الببتيدات الاصطناعية وفقا لتسلسل المستضد الهدف وترتبط إلى الغشاء الصلبة المعتمدة لماب التهجين. الببتيد المسح يوفر ليس فقط وسيلة بسيطة لتعيين الأجسام المضادة المنطقة ملزم، ولكن أيضا يسهل الأحماض الأمينية (أأ) الطفرات من خلال مسح بقايا أو استبدال لتقييم تفاعل ملزم بين كل بقايا أأ من الببتيد حاتمة وتقارير الإنجاز الموحدة من الأجسام المضادة. معشوقة = &quot;jove_content&quot;&gt; هنا، توضح الدراسة بروتوكول لتحديد كفاءة حاتمة خطية من البروتين معطف الهامور الأصفر فيروس نخر العصبي (YGNNV) باستخدام ماب تحييد 2، 3، 4. ويتضمن البروتوكول ماب إعداد والبناء والتعبير عن البروتينات المؤتلف اقتطاع متسلسل، الاصطناعية تصميم الببتيد متداخلة، تهجين نقطة وصمة عار، مسح ألانين، والطفرات تبديل. ونظرا لارتفاع تكلفة تركيب الببتيد، تم تعديل خطوة من اقتطاع متسلسل البروتينات المؤتلف من البروتين الهدف المنشود، وضاقت المنطقة المستضدات إلى حوالي 100-200 بقايا أأ قبل إجراء الببتيد مجموعة تحليل نقطة وصمة عار الاصطناعية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hybrid-SFM medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12045-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbeccos&#39;s Phophate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21600-069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pfu DNA Polymerase&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>EP0502&#160;</td>
			<td>Including buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10799009001</td>
			<td>Including buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NdeI&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0111S</td>
			<td>Including buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td>Including buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-20b(+) vector</td>
			<td>Novagen, Merck Millipore</td>
			<td>69739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli DH-5&#945; competent cell</td>
			<td>RBC Bioscience</td>
			<td>RH617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli BL-21(DE3) competent cell</td>
			<td>RBC Bioscience</td>
			<td>RH217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0339-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth&#160;</td>
			<td>Invitrongen</td>
			<td>12780-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropylthio-&#946;-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>MDBio, Inc.</td>
			<td>101-367-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>106009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20)</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>X251-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0167-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Affymetrix, USB</td>
			<td>75825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0241-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0105-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0854-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEL937001PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG, Fc fragment antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-055-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P (Polyvinylidene fluoride, PVDF)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Agarose Fast Flow</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>16-266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVP BioSpectrum 600 Image System</td>
			<td>UVP</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisionWorks LS Analysis Software Ver 6.8</td>
			<td>UVP</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyCycler thermal cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1709713</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

peptide scanning-assisted identification of a monoclonal antibody-recognized linear b-cell epitope

تحديد حاتمة مولدة من قبل النظام المناعي يسمح لفهم آلية الحماية من الأجسام المضادة التي قد تسهل تطوير اللقاحات والعقاقير الببتيد. الببتيد المسح هي طريقة بسيطة وفعالة تعين مباشر حاتمة الخطية المعترف بها من قبل الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (ماب). هنا، والكتاب تقدم منهجية تقرير حاتمة التي تنطوي على البروتينات اقتطاع متسلسل المؤتلف، تصميم الببتيد الاصطناعية، وتهجين نقطة وصمة عار للاعتراف الأنتيجين من فيروس العصبي نخر بروتين معطف باستخدام ماب تحييد. وتعتمد هذه التقنية على تهجين نقطة وصمة عار من الببتيدات الاصطناعية وMABS على (PVDF) غشاء فلوريد البولي. يمكن تضييق المنطقة مولدة الحد الأدنى من البروتين الفيروسي معطف معترف بها من قبل RG-M56 ماب أسفل خطوة بخطوة قلص رسم الخرائط الببتيد على 6 مير الببتيد حاتمة. وبالإضافة إلى ذلك، مسح ألانين الطفرات وبقايا الفرعيةstitution لا يمكن أن يؤديها لتوصيف أهمية ربط كل بقايا الأحماض الأمينية التي تشكل حاتمة. تم العثور على بقايا المرافقة الموقع حاتمة للعب أدوارا حاسمة في تنظيم الببتيد التشكل. ويمكن استخدام الببتيد حاتمة التي تم تحديدها لتشكيل بلورات من المجمعات الببتيد الأجسام المضادة حاتمة لدراسة حيود الأشعة السينية والمنافسة وظيفية، أو العلاجات.

وكان الهدف من هذه التجربة لتحديد حاتمة من خلال نقطة النشاف باستخدام ماب. لتضييق بسرعة وكفاءة أسفل منطقة مولدة معترف بها من قبل ماب، وأعرب عن كامل طول واقتطاع متسلسل YGNNV بروتينات الغلاف المؤتلف مع علامة الانصهار 6xHis في محطة سي من نظام التعبير كولاي<...

Watch this Scientific Journal Video about Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope at JoVE.com

Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope

Here, the authors present a simple and efficient protocol to define a linear antigenic epitope using a purified monoclonal antibody and peptide scanning through dot-blot hybridization. The identified epitope can then be used in therapeutic and diagnostic applications.

تحديد حاتمة الخطي B-خلية المعترف بها الأجسام المضادة وحيدة النسيلة-الببتيد الضوئي بمساعدة

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that ...

peptide-scanning-assisted-identification-monoclonal-antibody

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.3K Views.  Academia Sinica. Here, the authors present a simple and efficient protocol to define a linear antigenic epitope using a purified monoclonal antibody and peptide scanning through dot-blot hybridization. The identified epitope can then be used in therapeutic and diagnostic applications.

Video: Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

A basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an ability to identify T cells based on their T cell antigen receptor (TCR) specificity. Many indirect methods are available in which a bulk population of T cells is stimulated in vitro with a specific antigen and epitope-specific T cells are identified through the measurement of a functional response such as proliferation, cytokine production, or expression of activation markers1. However, these methods only identify epitope-specific T cells exhibiting one of many possible functions, and they are not sensitive enough to detect epitope-specific T cells at naive precursor frequencies. A popular alternative is the TCR transgenic adoptive transfer model, in which monoclonal T cells from a TCR transgenic mouse are seeded into histocompatible hosts to create a large precursor population of epitope-specific T cells that can be easily tracked with the use of a congenic marker antibody2,3. While powerful, this method suffers from experimental artifacts associated with the unphysiological frequency of T cells with specificity for a single epitope4,5. Moreover, this system cannot be used to investigate the functional heterogeneity of epitope-specific T cell clones within a polyclonal population.
	The ideal way to study adaptive immunity should involve the direct detection of epitope-specific T cells from the endogenous T cell repertoire using a method that distinguishes TCR specificity solely by its binding to cognate peptide:MHC (pMHC) complexes. The use of pMHC tetramers and flow cytometry accomplishes this6, but is limited to the detection of high frequency populations of epitope-specific T cells only found following antigen-induced clonal expansion. In this protocol, we describe a method that coordinates the use of pMHC tetramers and magnetic cell enrichment technology to enable detection of extremely low frequency epitope-specific T cells from mouse lymphoid tissues3,7. With this technique, one can comprehensively track entire epitope-specific populations of endogenous T cells in mice at all stages of the immune response.

This protocol describes the use of peptide:MHC tetramers and magnetic microbeads to isolate low frequency populations of epitope-specific T cells and analyze them by flow cytometry. This method enables the direct study of endogenous T cell populations of interest from in vivo experimental systems.

الببتيد: MHC Tetramer القائم على إثراء خلايا T حاتمة محددة

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners

Specific short peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1 Nef, not only retain their biological function, but can also competitively inhibit the function of the full-length protein. A set of 20 Nef scanning peptides, 20 amino acids in length with each overlapping 10 amino acids of its neighbor, were used to identify motifs in Nef responsible for its induction of apoptosis. Peptides containing these apoptotic motifs induced apoptosis at levels comparable to the full-length Nef protein. A second peptide, derived from the Secretion Modification Region (SMR) of Nef, retained the ability to interact with cellular proteins involved in Nef's secretion in exosomes (exNef). This SMRwt peptide was used as the "bait" protein in co-immunoprecipitation experiments to isolate cellular proteins that bind specifically to Nef's SMR motif. Protein transfection and antibody inhibition was used to physically disrupt the interaction between Nef and mortalin, one of the isolated SMR-binding proteins, and the effect was measured with a fluorescent-based exNef secretion assay. The SMRwt peptide's ability to outcompete full-length Nef for cellular proteins that bind the SMR motif, make it the first inhibitor of exNef secretion. Thus, by employing the techniques described here, which utilize the unique properties of specific short peptides derived from motifs found in full-length proteins, one may accelerate the identification of functional motifs in proteins and the development of peptide-based inhibitors of pathogenic functions.

Techniques to dissect the mechanisms underlying the secretion of HIV-1 Nef in exosomes are described. Specific short peptides derived from Nef and protein transfection were exploited to determine the structure, function, and binding partners of Nef&#x2019;s Secretion Modification Region. These procedures have general relevance in many mechanistic studies.

تحديد القائمة على الببتيد من الزخارف وظيفية وشركائها التجليد

Specific short  peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1  Nef, not only retain their biological function, but can ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

عزل مجموعات فرعية B-الخلية السلائف من دم الحبل السري

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

العزلة، تحديد الهوية، وتنقية خلايا الفئران التوتة طلائي

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.

An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.

جيل من الفئران وحيدة النسيلة الأجسام المضادة بواسطة تقنية هجين

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface glycoproteins of the virus. The generation of escape variants is a powerful method in elucidating how viruses escape immune detection and in identifying critical residues required for antibody binding. Here, we describe a protocol on how to generate influenza A virus escape variants by utilizing human or murine monoclonal antibodies (mAbs) directed against the viral hemagglutinin (HA). With the use of our technique, we previously characterized critical residues required for the binding of antibodies targeting either the head or stalk of the novel avian H7N9 HA. The protocol can be easily adapted for other virus systems. Analyses of escape variants are important for modeling antigenic drift, determining single nucleotide polymorphisms (SNPs) conferring resistance and virus fitness, and in the designing of vaccines and/or therapeutics.

We describe a method by which we identify critical residues required for the binding of human or murine monoclonal antibodies that target the viral hemagglutinin of influenza A viruses. The protocol can be adapted to other virus surface glycoproteins and their corresponding neutralizing antibodies.

جيل متغيرات الهروب من تحييد الأجسام المضادة فيروس الإنفلونزا

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.

تنقية الحمض النووي الفيروسي للتعرف على البروتينات الفيروسية والخلوية المرتبطة بها

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Overlapping Peptide Library to Map Qa-1 Epitopes in a Protein

Qa-1 (HLA-E in human) belongs to a group of non-classical major histocompatibility complex 1b (MHC-Ib) molecules. Recent data suggest that Qa-1 molecules play important roles in surveying cells for structural and functional integrity, inducing immune regulation, and limiting immune responses to viral infections. Additionally, functional augmentation of Qa-1-restricted CD8+ T cells through epitope immunization has shown therapeutic effects in several autoimmune disease animal models, e.g. experimental allergic encephalomyelitis, collagen-induced arthritis, and non-obese diabetes. Therefore, there is an urgent need for a method that can efficiently and quickly identify functional Qa-1 epitopes in a protein. Here, we describe a protocol that utilizes Qa-1-restricted CD8+ T cell lines specific for an overlapping peptide (OLP) library for determining Qa-1 epitopes in a protein. This OLP library contains 15-mer overlapping peptides that cover the whole length of a protein, and adjacent peptides overlap by 11 amino acids. Using this protocol, we recently identified a 9-mer Qa-1 epitope in myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG). This newly mapped MOG Qa-1 epitope was shown to induce epitope-specific, Qa-1-restricted CD8+ T cells that enhanced myelin-specific immune regulation. Therefore, this protocol is useful for future investigation of novel targets and functions of Qa-1-restricted CD8+ T cells.

Qa-1 (HLA-E in human) belongs to a group of non-classical major histocompatibility complex 1b molecules. Immunization with Qa-1-binding epitopes has been shown to augment tissue-specific immune regulation and ameliorate several autoimmune diseases. Herein we describe an overlapping peptide library strategy for the identification of Qa-1 epitopes in a protein.

مكتبة الببتيد المتداخلة لتعيين سؤال وجواب-1 [ابيتوبس] في بروتين

Qa-1 (HLA-E in human) belongs to a group of non-classical major histocompatibility complex 1b (MHC-Ib) molecules. Recent data suggest that Qa-1 molecules ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for drug discovery, therapeutic target identification, and developing of diagnostics. Here, we present a protocol to discover specific Zika virus (ZIKV) diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. A human serum sample validated for ZIKV infection was incubated with a high-density peptide microarray containing the entire ZIKV protein translated into 3,423 unique 15 linear amino acid (aa) residues with a 14-aa residue overlap printed in duplicate. Staining with different secondary antibodies within the same array, we detected peptides that bind to Immunoglobulin M (IgM) and Immunoglobulin G (IgG) antibodies present in serum. These peptides were selected for further validation experiments. In this protocol, we describe the strategy followed to design, process, and analyze a high-density peptide microarray.

In this protocol, we describe a technique to discover Zika virus specific diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. This protocol can readly be adapted for other emerging infectious diseases.

اكتشاف حانمه تشخيصية محددة الفيروس Zika

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional Chinese medicine and food safety/toxicology. Many of the classical analysis techniques require expensive equipment and/or expertise. Notably, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) have become an emerging method for the analysis of foods and natural products. This method is based on antibody-mediated detection of the target components. However, as many of the bioactive components in natural products are small (&lt;1,000 Da) and do not induce an immune response, creating monoclonal antibodies (mAbs) against them is often difficult. In this protocol, we provide a detailed explanation of the steps required to generate mAbs against target molecules as well as those needed to create the associated indirect competitive (ic)ELISA for the rapid analysis of the compound in multiple samples. The procedure describes the synthesis of the artificial antigen (i.e., the hapten-carrier conjugate), immunization, cell fusion, monoclonal hybridoma preparation, characterization of the mAb, and the ELISA-based application of the mAb. The hapten-carrier conjugate was synthesized by the sodium periodate method and evaluated by MALDI-TOF-MS. After immunization, splenocytes were isolated from the immunized mouse with the highest antibody titer and fused with the hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT)-sensitive mouse myeloma cell line Sp2/0 -Ag14 using a polyethylene glycol (PEG)-based method. The hybridomas secreting mAbs reactive to the target antigen were screened by icELISA for specificity and cross-reactivity. Furthermore, the limiting dilution method was applied to prepare monoclonal hybridomas. The final mAbs were further characterized by icELISA and then utilized in an ELISA-based application for the rapid and convenient detection of the example hapten (naringin (NAR)) in natural products.

This article provides a detailed protocol for the preparation and evaluation of monoclonal antibodies against natural products for use in various immunoassays. This procedure includes immunization, cell fusion, indirect competitive ELISA for positive clone screening, and monoclonal hybridoma preparation. The specifications for antibody characterization using MALDI-TOF-MS and ELISA analyses are also provided.

جيل من الأجسام المضادة ضد المنتجات الطبيعية

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...