فإن الكتاب أود أن أشكر اندريه هان والين لورانس للمساعدة التقنية، وأعضاء المختبر جنكينز للمساعدة في تطوير هذا البروتوكول.

1. عزل الخلايا من الأنسجة اللمفاوية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من الجليد الباردة cEHAA (+ 10٪ EHAA FBS، القلم / بكتيريا، جنتاميسين، 2 مم L-الجلوتامين، 55 مم 2-المركابتويثانول) أو غيرها من الخلايا T المتوسطة ما يعادلها، إلى صحن الثقافة 60 مم يحتوي على مربع صغير من 100 شبكة النايلون ميكرومتر ومكان على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الماوس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الطحال والغدد الليمفاوية ما يصل يمكن الوصول إليها بسهولة ممكن. ينبغي أن تشمل هذه على الأقل، الإبطين الأربية، العضدية، والعقد اللمفاوية العنقية، والمساريقي. وضعها على رأس شبكة النايلون في طبق الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الأعلى المسطح من 1،5 أنبوب مغلق microfuge مل، الهريس بلطف الأنسجة اللمفاوية خلال شبكة من النايلون لتحرير الخلايا الليمفاوية. إضافة 1 مل من آخر cEHAA والماصة صعودا وهبوطا للعمل الخلايا في التعليق. نقل الخلايا من خلال قطعة أخرى من النايلون وضعت على شبكة أعلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل مادة البولي بروبيلين. شطف الأطباق وشبكة مع آخر 1 مل من الجليد الباردة cEHAA، صأولينغ وحدات التخزين في أنبوب واحد. تكرار لتحقيق التعليق الخلية النهائي حجم 4 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الباردة العازلة فارز (PBS + 2٪ FBS، أزيد 0.05٪) إلى الحجم النهائي من 15 مل والطرد المركزي في أنبوب لمدة 5 دقائق في 300 XG، 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بعناية طاف، والتأكد من عدم ترك أي قطرات من السائل على جانبي الأنبوب. إعادة تعليق بيليه خلية في كتلة FC (فارز عازلة + 2.4G2 الضد) إلى وحدة تخزين النهائي يساوي تقريبا ضعف من بيليه نفسه. على سبيل المثال، الطحال والغدد الليمفاوية على فأرة الحاسوب ساذجة تنتج عادة بيليه خلية من حوالي 100 ميكرولتر. في هذه الحالة، إضافة 100 ميكرولتر من كتلة التيسير لتبرزي حجم إلى 200 ميكرولتر. إذا كان درجة كبيرة من التثاقل خلية حدث، وإزالة بعناية تتجمع الخلايا في هذه المرحلة مع طرف الماصة. </li></ol> 2. Tetramer تلوين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة PE-APC-المسمى أو PMHC tetramer إلى تركيز النهائي من 10 نانومتر (أو تركيز الأمثل تجريبيا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ومزيج incubaالشركة المصرية للاتصالات لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (أو الوقت الأمثل تجريبيا ودرجة الحرارة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الباردة العازلة فارز إلى حجم 15 مل والطرد المركزي في أنبوب لمدة 5 دقائق في 300 XG، 4 ° C. الحفاظ على العينات على الجليد أو عند 4 ° C من الآن فصاعدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بعناية طاف، والتأكد من عدم ترك أي قطرات من السائل على جانبي الأنبوب. إعادة تعليق بيليه خلية في المخزن المؤقت فارز إلى الحجم النهائي من 200 ميكرولتر. لتخصيب tetramer مزدوجة، إعادة تعليق النهائية إلى وحدة تخزين من 150 ميكرولتر. </li></ol> 3. المغناطيسية التخصيب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر من microbeads Miltenyi مكافحة PE أو مكافحة APC. لتخصيب tetramer مزدوجة، إضافة 50 ميكرولتر من كل من. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط واحتضان لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الباردة العازلة فارز إلى حجم 15 مل والطرد المركزي في أنبوب لمدة 5 دقائق في 300 XG، 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أثناء انتظار، إعداد عمود LS Miltenyi المغناطيسي المغناطيس على MidiMACS أو QuadroMACS. وضع مفتوح البولي بروبلين 15 مل أنبوب الطرد المركزي علىرف مباشرة تحت العمود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أضف 3 مل من العازلة فارز إلى أعلى العمود، والسماح لها لاستنزاف في أنبوب 15 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع النايلون مساحة 100 ميكرومتر شبكة على رأس العمود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تنتهي من الخلايا الغزل ونضح بعناية طاف بيليه و resuspend في 3 مل من العازلة فارز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل التعليق الخلية من خلال شبكة من النايلون على الجزء العلوي من العمود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما توقف خلية استنزفت تماما في العمود، وشطف الأنبوب الأصلي مع آخر مل 3 من فارز العازلة ونقل المخزن المؤقت من خلال شبكة من النايلون في العمود، الشطف شبكة في هذه العملية. تجاهل شبكة النايلون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما استنزفت تماما عازلة في العمود، إضافة آخر مل 3 من المخزن المؤقت فارز إلى العمود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 10 لما مجموعه 3 مل يغسل X 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة عمود من المغناطيس ومكان أكثر من أنبوب جديد 15 مل الطرد المركزي البولي بروبلين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 مل من العازلة فارز لرانه العمود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج فورا الغواص في أعلى العمود في واحد وحركة مستمرة، ودفع المكبس على طول الطريق، مما اضطر العازلة من العمود في أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي أنابيب تحتوي على جزء محدد مزال وجزء غير منضم التدفق من خلال لمدة 5 دقائق في 300 XG، 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بعناية طاف من الكسر محدد، مع التأكد من عدم ترك أي قطرات من السائل على جانبي الأنبوب. إعادة تعليق بيليه خلية في المخزن المؤقت فارز إلى الحجم النهائي من 95 ميكرولتر بالضبط. نضح و resuspend الكسر غير منضم إلى الحجم النهائي من 2 مل. </li></ol> 4. تدفق الخلوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل جزء، وإزالة وإضافة 5 ميكرولتر إلى 200 ميكرولتر من الخرز العد (معدلة لتركيز مل / 200،000 في المخزن المؤقت فارز) في أنبوب مل 5 FACS. توضع جانبا في 4 لتحليل C ° في وقت لاحق. لتوفير الوقت، يمكن الخرز مسبقا aliquoted لأنابيب المسمى قبل بدء التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد صباحاأستر مزيج من الأجسام المضادة لعلامات وصمة عار على سطح الخلايا (الجدول 1). لتوفير الوقت، ويمكن أن يتم ذلك قبل بدء التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجزء محدد، إضافة جرعة من الأجسام المضادة كوكتيل مباشرة إلى ميكرولتر من 90 ~ الخلايا في الأنبوب. إذا هو المطلوب تحليل الكسر غير منضم، بتحويل 90 ميكرولتر من الخلايا إلى أنبوب 5 مل FACS وإضافة جرعة من الأجسام المضادة كوكتيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشكيل لجنة للضوابط التعويض أحادية اللون لتدفق عداد الكريات. لكل ملون تألقي لاستخدامها، مزيج 50 ميكرولتر من الخلايا بقايا جزء غير منضم في أنبوب مل 5 FACS مع 1 ميكرولتر من الأجسام المضادة لمكافحة CD4 مترافق إلى ملون تألقي المقابلة. تذكر لإنشاء عنصر تحكم غير ملوثين أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة واحتضان جميع العينات لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 مل من العازلة فارز لكل أنبوب الطرد المركزي ولمدة 5 دقائق في 300 XG، 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجزء محدد، نضح بعناية طاف و resuspend الخلايا في 200 ميكرولتر من BUF فارزFER. نقل الخلايا إلى microtube 1،2 مل FACS. شطف الأنبوب مع آخر ميكرولتر العازلة 200 من فارز والمسبح في نفس microtube. إذا كتل الخلايا واضحة، تمر الخلايا من خلال مرشح ميكرون 50. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجزء غير منضم وضوابط التعويض، أو صب نضح طاف و resuspend في فارز 2 مل العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد قياس التدفق الخلوي باستخدام عناصر التحكم التعويض أحادية اللون. حدد الجانب مبعثر ذات العرض (SSC-W) كمعلمة إضافية ليتم تسجيلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل عينات الملون باستخدام سلسلة من البوابات إدراج المتعاقبة CD4 + لتحديد أو CD8 + T الخلايا كما هو موضح في الشكلين 1 و 2. لكسور محدد، جمع خلايا أكبر عدد ممكن بحد أقصى 2،000،000 مجموع الأحداث. لكسور غير منضم، وجمع 1000000 مجموع الأحداث. الحفاظ على معدل الاستحواذ في 3000 أو أقل الأحداث في الثانية الواحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام إعدادات الجهاز نفسه، وتحليل عينات العد حبة. جمع 10000 مجموع الأحداث. &lt;/ لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ كافة البيانات في ملفات FCS. </li></ol> 5. تحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل FCS ملفات البيانات لعينات العد باستخدام حبة FlowJo البرمجيات. مبعثر مؤامرة قدمها FITC ووضع بوابة أرونج عد حبات (أنظر الشكلين 1 و 2). تحديد العدد الإجمالي للعد الخرز الكشف عن في كل عينة. طرح من إجمالي عدد الأحداث التي تم جمعها لتحديد عدد الخلايا التي تم جمعها من الأحداث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب العدد الإجمالي للجميع الخلايا في كل عينة باستخدام المعادلات المبينة في الإطار 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل FCS ملفات البيانات لعينات الملون جزء محدد وغير منضم. إعداد سلسلة من البوابات إدراج المتعاقبة لتحديد اللمفاوية +، لو الجانبية مبعثر العرض، تفريغ، CD3 +، + CD4 CD8 + أو، tetramer + الخلايا التائية في كل عينة كما هو موضح في الشكلين 1 و 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مضاعفة العدد الإجمالي للخلايا في العينة من الترددات لكل من بوابات إدراج تستخدم لتحديد CD4 + tetramer+ + CD8 أو tetramer + الخلايا لحساب العدد الإجمالي للخلايا T-حاتمة محددة (الإطار 1). </li></ol>

<ol>
	<li>Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+analysis+of+T-cell+immunity.">Laboratory analysis of T-cell immunity.</a> Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).</li><li>Kearney, E. R., Pape, K. A., Loh, D. Y., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+peptide-specific+T+cell+immunity+and+peripheral+tolerance+induction+in+vivo.">Visualization of peptide-specific T cell immunity and peripheral tolerance induction in vivo.</a> Immunity. 1, 327-339 (1994).</li><li>Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+epitope-specific+T+cells.">Tracking epitope-specific T cells.</a> Nat Protoc. 4, 565-581 (2009).</li><li>Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naive+and+memory+CD4++T+cell+survival+controlled+by+clonal+abundance.">Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance.</a> Science. 312, 114-116 (2006).</li><li>Marzo, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+T+cell+frequency+dictates+memory+CD8++T+cell+lineage+commitment.">Initial T cell frequency dictates memory CD8+ T cell lineage commitment.</a> Nat Immunol. 6, 793-799 (2005).</li><li>Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+the+repertoire:+broadening+the+scope+of+peptide-MHC+multimer+analysis.">Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis.</a> Nature reviews. Immunology. 11, 551-558 (2011).</li><li>Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naive+CD4(+)+T+cell+frequency+varies+for+different+epitopes+and+predicts+repertoire+diversity+and+response+magnitude.">Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude.</a> Immunity. 27, 203-213 (2007).</li><li>Seah, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+linear+range+for+accurately+quantifying+antigen-specific+T-cell+frequencies+by+tetramer+staining+during+natural+immune+responses.">The linear range for accurately quantifying antigen-specific T-cell frequencies by tetramer staining during natural immune responses.</a> European Journal of Immunology. 41, 1499-1500 (2011).</li><li>Obar, J. J., Khanna, K. M., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+naive+CD8++T+cell+precursor+frequency+regulates+primary+and+memory+responses+to+infection.">Endogenous naive CD8+ T cell precursor frequency regulates primary and memory responses to infection.</a> Immunity. 28, 859-869 (2008).</li><li>Daniels, M. A., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+for+CD8+in+T+cell+receptor+binding+and+activation+by+peptide/major+histocompatibility+complex+multimers.">Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers.</a> J Exp Med. 191, 335-346 (2000).</li><li>Pittet, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha+3+domain+mutants+of+peptide/MHC+class+I+multimers+allow+the+selective+isolation+of+high+avidity+tumor-reactive+CD8+T+cells.">Alpha 3 domain mutants of peptide/MHC class I multimers allow the selective isolation of high avidity tumor-reactive CD8 T cells.</a> Journal of Immunology. 171, 1844-1849 (2003).</li><li>Choi, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+avidity+antigen-specific+CTL+identified+by+CD8-independent+tetramer+staining.">High avidity antigen-specific CTL identified by CD8-independent tetramer staining.</a> Journal of Immunology. 171, 5116-5123 (2003).</li><li>Chu, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+selection+optimizes+the+number+and+function+of+MHCII-restricted+CD4++T+cell+clones+in+the+naive+polyclonal+repertoire.">Positive selection optimizes the number and function of MHCII-restricted CD4+ T cell clones in the naive polyclonal repertoire.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11241-11245 (2009).</li><li>Chu, H. H., Moon, J. J., Kruse, A. C., Pepper, M., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+Selection+and+Peptide+Chemistry+Determine+the+Size+of+Naive+Foreign+Peptide-MHC+Class+II-Specific+CD4++T+Cell+Populations.">Negative Selection and Peptide Chemistry Determine the Size of Naive Foreign Peptide-MHC Class II-Specific CD4+ T Cell Populations.</a> J Immunol. 185, 4705-4713 (2010).</li><li>Legoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+TCR+reactivity+and+HLA+phenotype+on+naive+CD8+T+cell+frequency+in+humans.">Impact of TCR reactivity and HLA phenotype on naive CD8 T cell frequency in humans.</a> J Immunol. 184, 6731-6738 (2010).</li><li>Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K., Hasan, M., Albert, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+human+antigen-specific+naive+CD8++T+cells+reveals+conserved+precursor+frequencies.">Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies.</a> Blood. 115, 3718-3725 (2010).</li><li>Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+of+Epitope-Specific+Naive+CD4++T+Cells+Correlates+with+Immunodominance+in+the+Human+Memory+Repertoire.">Frequency of Epitope-Specific Naive CD4+ T Cells Correlates with Immunodominance in the Human Memory Repertoire.</a> Journal of Immunology. 188, 2537-2544 (2012).</li><li>Jenkins, M. K., Chu, H. H., McLachlan, J. B., Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+composition+of+the+preimmune+repertoire+of+T+cells+specific+for+Peptide-major+histocompatibility+complex+ligands.">On the composition of the preimmune repertoire of T cells specific for Peptide-major histocompatibility complex ligands.</a> Annu Rev Immunol. 28, 275-294 (2010).</li><li>Matechak, E. O., Killeen, N., Hedrick, S. M., Fowlkes, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+class+II-specific+T+cells+can+develop+in+the+CD8+lineage+when+CD4+is+absent.">MHC class II-specific T cells can develop in the CD8 lineage when CD4 is absent.</a> Immunity. 4, 337-347 (1996).</li><li>Burchill, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linked+T+cell+receptor+and+cytokine+signaling+govern+the+development+of+the+regulatory+T+cell+repertoire.">Linked T cell receptor and cytokine signaling govern the development of the regulatory T cell repertoire.</a> Immunity. 28, 112-121 (2008).</li><li>Pepper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+routes+of+bacterial+infection+induce+long-lived+TH1+memory+cells+and+short-lived+TH17+cells.">Different routes of bacterial infection induce long-lived TH1 memory cells and short-lived TH17 cells.</a> Nature Immunology. 11, 83-89 (2010).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وtetramer PMHC تخصيب خلية مقرها طريقة التي قدمها هذا البروتوكول هو أداة قوية لدراسة حاتمة محددة خلايا T من الخلايا T الذاتية ذخيرة. استخدام tetramers PMHC تمكن الكشف عن خلايا T حاتمة محددة تستند مباشرة على قدرة TCRs لربط يغاندس PMHC وما شابه ذلك. إثراء يوفر مستوى من الحساسية بحيث يمكن ا...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; الكاشف</strong</td&gt;<td<strong&gt; البائع</strong</td&gt;<td<strong&gt; كتالوج عدد</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PE أو APC مترافق PMHC tetramer (أو متعدد القسيمات)</td&gt;<td&gt; صنع من قبل المحقق، تم الحصول عليها من المعاهد الوطنية للصحة الأساسية tetramer، أو تم شراؤها من مصادر تجارية</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; مكافحة PE microbeads المغناطيسي مترافق</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-048-801</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; مكافحة APC microbeads المغناطيسي مترافق</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-090-855</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; الأعمدة LS المغناطيسي</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-042-401</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MidiMACS أو المغناطيس QuadroMACS</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-042-302 أو 130-090-976</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; الخرز خلية العد</td&gt;<td&gt; الحياة تكنولوجيز</td&gt;<td&gt; PCB-100</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

peptide:mhc tetramer-based enrichment of epitope-specific t cells

ضرورة أساسية للباحثين الذين يدرسون الحصانة التكيف مع نماذج تجريبية في الجسم الحي هو القدرة على تحديد الخلايا T T بهم على أساس خلية مستقبلة المستضد (TCR) خصوصية. العديد من الطرق غير المباشرة التي تتوفر في عدد سكانها ويتم تحفيز الخلايا T الأكبر من في المختبر مع مستضد معين وحاتمة محددة خلايا T وتحديدها من خلال قياس استجابة وظيفية مثل انتشار الأسلحة النووية، إنتاج السيتوكينات، أو التعبير عن علامات التنشيط 1. ومع ذلك، هذه الأساليب تحديد حاتمة محددة فقط خلايا T واظهار واحدة من العديد من الوظائف المحتملة، وأنها ليست حساسة بما يكفي للكشف عن خلايا محددة حاتمة T على ترددات السلائف السذاجة. وثمة بديل شعبية هو المعدلة وراثيا TCR نموذج نقل بالتبني، والتي هي خلايا T المصنف حيدة النسيلة من الماوس المعدلة وراثيا في TCR المضيفين متوافق نسيجيا لخلق السكان السلائف كبير من الخلايا T-حاتمة محددة يمكن أن تكون EASIلي مع تعقب استخدام الأجسام المضادة علامة 2،3 مسانج مشترك. بينما قوية، وهذه الطريقة يعاني من التحف التجريبية المرتبطة تردد من الخلايا T unphysiological مع خصوصية لحاتمة واحدة 4،5. وعلاوة على ذلك، لا يمكن أن تستخدم هذا النظام للتحقيق في عدم التجانس الوظيفي للحاتمة محددة استنساخ الخلايا T للسكان من بولكلونل. يجب أن الطريقة المثلى لدراسة الحصانة التكيف تنطوي على الكشف المباشر للحاتمة محددة خلايا T T من مرجع الخلية المحلية باستخدام أسلوب الذي يميز خصوصية TCR فقط من قبل ملزم لالمشابهة الببتيد: مجمعات MHC (PMHC). استخدام tetramers PMHC والتدفق الخلوي يحقق هذا 6، ولكن يقتصر على الكشف عن السكان تيرة عالية من الخلايا T-حاتمة محددة لا توجد إلا مستضد التالية التي يسببها التوسع نسيلي. في هذا البروتوكول، ونحن تصف الطريقة التي تنسق استخدام tetramers PMHC وماغنيتيك تكنولوجيا تخصيب الخلية لتمكين الكشف عن خلايا T التردد المنخفض للغاية حاتمة محددة من الأنسجة اللمفاوية 3،7 الماوس. مع هذه التقنية، يمكن للمرء أن تتبع شامل كامل حاتمة محددة من الخلايا T السكان الذاتية في الفئران في جميع مراحل الاستجابة المناعية.

الشكل 1 يصور ممثل المؤامرات التدفق الخلوي من الطحال pMHCII المخصب tetramer وعينات من الفئران العقدة الليمفاوية السذاجة، بينما يصور الشكل 2 بيانات تمثيلية للتحصين الفئران سابقا مع الببتيد ذات الصلة + CFA. مسلسل الأحداث النابضة يزيل autofluorescent غير المرغوب فيها ...

Watch this Scientific Journal Video about Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells at JoVE.com

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

يصف هذا البروتوكول استخدام الببتيد: MHC tetramers وmicrobeads المغناطيسي لعزل السكان التردد المنخفض من الخلايا T-حاتمة محددة وتحليلها من قبل التدفق الخلوي. هذه الطريقة تمكن من الدراسة الذاتية المباشرة السكان خلية T من الاهتمام من<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; أنظمة التجريبية.

الببتيد: MHC Tetramer القائم على إثراء خلايا T حاتمة محددة

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

peptidemhc-tetramer-based-enrichment-of-epitope-specific-t-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.8K Views.  Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School. يصف هذا البروتوكول استخدام الببتيد: MHC tetramers وmicrobeads المغناطيسي لعزل السكان التردد المنخفض من الخلايا T-حاتمة محددة وتحليلها من قبل التدفق الخلوي. هذه الطريقة تمكن من الدراسة الذاتية المباشرة السكان خلية T من الاهتمام من في الجسم الحي أنظمة التجريبية.

Video: Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

تنبيغ من فيروسات تي خلية المستقبلات في الخلايا التائية ماوس

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in immunologic homeostasis with the vast amount of self and commensal antigens in and on the human body. Perturbations in the balance between Tregs and inflammatory conventional T cells can result in immunopathology or cancer. Although therapeutic injection of Tregs has been shown to be efficacious in murine models of colitis1 , type I diabetes2 , rheumatoid arthritis and graft versus host disease,4 several fundamental differences in human versus mouse Treg biology5 has thus far precluded clinical use. The lack of sufficient number, purity, stability and homing specificity of therapeutic Tregs necessitated a dynamic platform of human Treg development on which to optimize conditions for their ex vivo expansion6.
Here we describe a method for the differentiation of induced Tregs (iTregs) from a single human peripheral blood donor which can be broken down into four stages: isolation of peripheral blood mononuclear cells, magnetic selection of CD4+ T cells, in vitro cell culture and fluorescence activated cell sorting (FACS) of T cell subsets. Since the Treg signature transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) is an activation-induced transcription factor in humans7 and no other unique marker exists, a combinatorial panel of markers must be used to identify T cells with suppressor activity. After six days in culture, cells in our system can be demarcated into na&iuml;ve T cells, memory T cells or iTregs based on their relative expression of CD25 and CD45RA. As memory and na&iuml;ve T cells have different reported polarization requirements and plasticities8 , pre-sorting of the initial T cell population into CD45RA+ and CD45RO+ subsets can be used to examine these discrepancies. Consistent with others, our CD25HiCD45RA- iTregs express high levels of FoxP39 , GITR and CTLA-411 and low levels of CD12712 . Following FACS of each population, resultant cells can be used in a suppressor assay which evaluates the relative ability to retard the proliferation of carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeled autologous T cells.

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&amp;#239;ve and Memory T Cells

We describe a method for generating regulatory, memory and na&#239;ve T cells from a single human blood donor. Polarized Tregs can be then compared to other subsets in a variety of genetic and functional applications with genetic homogeneity, including a suppression assay also detailed here.

جيل من الخلايا المستحثة تي التنظيمية من المرحلة الابتدائية الإنسان خلايا T ساذجة والذاكرة

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

piggyBac تعديل النظام الأساسي للخلايا ينقول T الإنسان

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

اشتقاق خلايا T<em&gt; في المختبر</em&gt; من الفأر الجنينية الخلايا الجذعية

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

توليد خلايا T الإنسان مستضد خيفي محددة من الدم المحيطي

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection occurring after allogeneic hematopoietic stem-cell transplantation. Viral-specific T cells from allogeneic donors, including third party donors, can be propagated ex vivo in compliance with current good manufacturing practice (cGMP), employing repeated rounds of antigen-driven stimulation to selectively propagate desired T cells. The identification and isolation of antigen-specific T cells can also be undertaken based upon the cytokine capture system of T cells that have been activated to secrete gamma-interferon (IFN-&#947;). However, widespread human application of the cytokine capture system (CCS) to help restore immunity has been limited as the production process is time-consuming and requires a skilled operator. The development of a second-generation cell enrichment device such as CliniMACS Prodigy now enables investigators to generate viral-specific T cells using an automated, less labor-intensive system. This device separates magnetically labeled cells from unlabeled cells using magnetic activated cell sorting technology to generate clinical-grade products, is engineered as a closed system and can be accessed and operated on the benchtop. We demonstrate the operation of this new automated cell enrichment device to manufacture CMV pp65-specific T cells obtained from a steady-state apheresis product obtained from a CMV seropositive donor. These isolated T cells can then be directly infused into a patient under institutional and federal regulatory supervision. All the bio-processing steps including removal of red blood cells, stimulation of T cells, separation of antigen-specific T cells, purification, and washing are fully automated. Devices such as this raise the possibility that T cells for human application can be manufactured outside of dedicated good manufacturing practice (GMP) facilities and instead be produced in blood banking facilities where staff can supervise automated protocols to produce multiple products.

The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.

الآلي إثراء خلية من الفيروس المضخم للخلايا محددة خلايا T للتطبيقات السريرية باستخدام نظام خلوى التقاط

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

T خلايا التقاط البكتيريا التي كتبها Transinfection من الخلايا الجذعية

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with hematological malignancies and are currently being investigated for various solid tumors. CAR-T cells are generated by removing T cells from a patient's blood and engineering them to express a synthetic immune receptor that redirects the T-cells to recognize and eliminate target tumor cells. Gene editing of CAR-T cells has the potential to improve safety of current CAR-T cell therapies and further increase the efficacy of CAR-T cells. Here, we describe methods for the activation, expansion, and characterization of human CRISPR-engineered CD19 directed CAR-T cells. This comprises transduction of the CAR lentiviral vector and use of single guide RNA (sgRNA) and Cas9 endonuclease to target genes of interest in T cells. The methods described in this protocol can be universally applied to other CAR constructs and target genes beyond the ones used for this study. Furthermore, this protocol discusses strategies for gRNA design, lead gRNA selection and target gene knockout validation to reproducibly achieve high-efficiency, multiplex CRISPR-Cas9 engineering of clinical grade human T cells.

Here, we present a protocol for gene editing in primary human T cells using CRISPR Cas Technology to modify CAR-T cells.

إنتاج خلايا CAR-T البشرية التي تم تصميمها من قبل CRISPR

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with ...

Adoptive Transfer of P14 T-Cells into Tumor-Bearing Mice

النقل بالتبني للخلايا التائية P14 إلى الفئران الحاملة للورم

عزل وتوصيف الخلايا التائية الخاصة بالمستضد في رئتي الفأر

Identification of Rare Antigen-Specific T Cells from Mouse Lungs with Peptide:Major Histocompatibility Complex Tetramers

The identification and characterization of antigen-specific T cells during health and disease remains a key to improving our understanding of immune pathophysiology. The technical challenges of tracking antigen-specific T cell populations within the endogenous T cell repertoire have been greatly advanced by the development of peptide:MHC tetramer reagents. These fluorescently labeled soluble multimers of MHC class I or class II molecules complexed to antigenic peptide epitopes bind directly to T cells with corresponding T cell receptor (TCR) specificity and can, therefore, identify antigen-specific T cell populations in their native state without a requirement for a functional response induced by ex vivo stimulation. For exceedingly rare populations, tetramer-bound T cells can be magnetically enriched to increase the sensitivity and reliability of detection.
As the investigation of tissue-resident T cell immunity deepens, there is a pressing need to identify antigen-specific T cells that traffic to and reside in nonlymphoid tissues. In this protocol, we present a detailed set of instructions for the isolation and characterization of antigen-specific T cells present within mouse lungs. This involves the isolation of T cells from digested lung tissue followed by a general T cell magnetic enrichment step and tetramer staining for flow cytometry analysis and sorting. The steps highlighted in this protocol utilize common techniques and readily available reagents, making it accessible for nearly any researcher engaged in mouse T cell immunology, and are highly adaptable for a variety of downstream analyses of any low frequency antigen-specific T cell population residing within the lungs.

تسليط الضوء على المؤلف: بروتوكول محسن للكشف عن الخلايا التائية الخاصة بالمستضد في رئتي الفأر باستخدام Tetramers

We provide a detailed protocol for isolating and identifying rare antigen-specific T cell populations in mouse lungs through magnetic bead-based T cell enrichment and peptide:major histocompatibility complex (MHC) tetramers.

تحديد الخلايا التائية النادرة الخاصة بالمستضد من رئتي الفأر مع الببتيد: رباعيات التوافق النسيجي المعقدة الرئيسية

The identification and characterization of antigen-specific T cells during health and disease remains a key to improving our understanding of immune ...