فإن الكتاب أود أن أشكر اندريه هان والين لورانس للمساعدة التقنية، وأعضاء المختبر جنكينز للمساعدة في تطوير هذا البروتوكول.

1. عزل الخلايا من الأنسجة اللمفاوية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من الجليد الباردة cEHAA (+ 10٪ EHAA FBS، القلم / بكتيريا، جنتاميسين، 2 مم L-الجلوتامين، 55 مم 2-المركابتويثانول) أو غيرها من الخلايا T المتوسطة ما يعادلها، إلى صحن الثقافة 60 مم يحتوي على مربع صغير من 100 شبكة النايلون ميكرومتر ومكان على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الماوس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الطحال والغدد الليمفاوية ما يصل يمكن الوصول إليها بسهولة ممكن. ينبغي أن تشمل هذه على الأقل، الإبطين الأربية، العضدية، والعقد اللمفاوية العنقية، والمساريقي. وضعها على رأس شبكة النايلون في طبق الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الأعلى المسطح من 1،5 أنبوب مغلق microfuge مل، الهريس بلطف الأنسجة اللمفاوية خلال شبكة من النايلون لتحرير الخلايا الليمفاوية. إضافة 1 مل من آخر cEHAA والماصة صعودا وهبوطا للعمل الخلايا في التعليق. نقل الخلايا من خلال قطعة أخرى من النايلون وضعت على شبكة أعلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل مادة البولي بروبيلين. شطف الأطباق وشبكة مع آخر 1 مل من الجليد الباردة cEHAA، صأولينغ وحدات التخزين في أنبوب واحد. تكرار لتحقيق التعليق الخلية النهائي حجم 4 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الباردة العازلة فارز (PBS + 2٪ FBS، أزيد 0.05٪) إلى الحجم النهائي من 15 مل والطرد المركزي في أنبوب لمدة 5 دقائق في 300 XG، 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بعناية طاف، والتأكد من عدم ترك أي قطرات من السائل على جانبي الأنبوب. إعادة تعليق بيليه خلية في كتلة FC (فارز عازلة + 2.4G2 الضد) إلى وحدة تخزين النهائي يساوي تقريبا ضعف من بيليه نفسه. على سبيل المثال، الطحال والغدد الليمفاوية على فأرة الحاسوب ساذجة تنتج عادة بيليه خلية من حوالي 100 ميكرولتر. في هذه الحالة، إضافة 100 ميكرولتر من كتلة التيسير لتبرزي حجم إلى 200 ميكرولتر. إذا كان درجة كبيرة من التثاقل خلية حدث، وإزالة بعناية تتجمع الخلايا في هذه المرحلة مع طرف الماصة. </li></ol> 2. Tetramer تلوين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة PE-APC-المسمى أو PMHC tetramer إلى تركيز النهائي من 10 نانومتر (أو تركيز الأمثل تجريبيا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ومزيج incubaالشركة المصرية للاتصالات لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (أو الوقت الأمثل تجريبيا ودرجة الحرارة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الباردة العازلة فارز إلى حجم 15 مل والطرد المركزي في أنبوب لمدة 5 دقائق في 300 XG، 4 ° C. الحفاظ على العينات على الجليد أو عند 4 ° C من الآن فصاعدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بعناية طاف، والتأكد من عدم ترك أي قطرات من السائل على جانبي الأنبوب. إعادة تعليق بيليه خلية في المخزن المؤقت فارز إلى الحجم النهائي من 200 ميكرولتر. لتخصيب tetramer مزدوجة، إعادة تعليق النهائية إلى وحدة تخزين من 150 ميكرولتر. </li></ol> 3. المغناطيسية التخصيب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر من microbeads Miltenyi مكافحة PE أو مكافحة APC. لتخصيب tetramer مزدوجة، إضافة 50 ميكرولتر من كل من. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط واحتضان لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الباردة العازلة فارز إلى حجم 15 مل والطرد المركزي في أنبوب لمدة 5 دقائق في 300 XG، 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أثناء انتظار، إعداد عمود LS Miltenyi المغناطيسي المغناطيس على MidiMACS أو QuadroMACS. وضع مفتوح البولي بروبلين 15 مل أنبوب الطرد المركزي علىرف مباشرة تحت العمود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أضف 3 مل من العازلة فارز إلى أعلى العمود، والسماح لها لاستنزاف في أنبوب 15 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع النايلون مساحة 100 ميكرومتر شبكة على رأس العمود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تنتهي من الخلايا الغزل ونضح بعناية طاف بيليه و resuspend في 3 مل من العازلة فارز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل التعليق الخلية من خلال شبكة من النايلون على الجزء العلوي من العمود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما توقف خلية استنزفت تماما في العمود، وشطف الأنبوب الأصلي مع آخر مل 3 من فارز العازلة ونقل المخزن المؤقت من خلال شبكة من النايلون في العمود، الشطف شبكة في هذه العملية. تجاهل شبكة النايلون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما استنزفت تماما عازلة في العمود، إضافة آخر مل 3 من المخزن المؤقت فارز إلى العمود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 10 لما مجموعه 3 مل يغسل X 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة عمود من المغناطيس ومكان أكثر من أنبوب جديد 15 مل الطرد المركزي البولي بروبلين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 مل من العازلة فارز لرانه العمود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج فورا الغواص في أعلى العمود في واحد وحركة مستمرة، ودفع المكبس على طول الطريق، مما اضطر العازلة من العمود في أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي أنابيب تحتوي على جزء محدد مزال وجزء غير منضم التدفق من خلال لمدة 5 دقائق في 300 XG، 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بعناية طاف من الكسر محدد، مع التأكد من عدم ترك أي قطرات من السائل على جانبي الأنبوب. إعادة تعليق بيليه خلية في المخزن المؤقت فارز إلى الحجم النهائي من 95 ميكرولتر بالضبط. نضح و resuspend الكسر غير منضم إلى الحجم النهائي من 2 مل. </li></ol> 4. تدفق الخلوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل جزء، وإزالة وإضافة 5 ميكرولتر إلى 200 ميكرولتر من الخرز العد (معدلة لتركيز مل / 200،000 في المخزن المؤقت فارز) في أنبوب مل 5 FACS. توضع جانبا في 4 لتحليل C ° في وقت لاحق. لتوفير الوقت، يمكن الخرز مسبقا aliquoted لأنابيب المسمى قبل بدء التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد صباحاأستر مزيج من الأجسام المضادة لعلامات وصمة عار على سطح الخلايا (الجدول 1). لتوفير الوقت، ويمكن أن يتم ذلك قبل بدء التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجزء محدد، إضافة جرعة من الأجسام المضادة كوكتيل مباشرة إلى ميكرولتر من 90 ~ الخلايا في الأنبوب. إذا هو المطلوب تحليل الكسر غير منضم، بتحويل 90 ميكرولتر من الخلايا إلى أنبوب 5 مل FACS وإضافة جرعة من الأجسام المضادة كوكتيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشكيل لجنة للضوابط التعويض أحادية اللون لتدفق عداد الكريات. لكل ملون تألقي لاستخدامها، مزيج 50 ميكرولتر من الخلايا بقايا جزء غير منضم في أنبوب مل 5 FACS مع 1 ميكرولتر من الأجسام المضادة لمكافحة CD4 مترافق إلى ملون تألقي المقابلة. تذكر لإنشاء عنصر تحكم غير ملوثين أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة واحتضان جميع العينات لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 مل من العازلة فارز لكل أنبوب الطرد المركزي ولمدة 5 دقائق في 300 XG، 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجزء محدد، نضح بعناية طاف و resuspend الخلايا في 200 ميكرولتر من BUF فارزFER. نقل الخلايا إلى microtube 1،2 مل FACS. شطف الأنبوب مع آخر ميكرولتر العازلة 200 من فارز والمسبح في نفس microtube. إذا كتل الخلايا واضحة، تمر الخلايا من خلال مرشح ميكرون 50. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجزء غير منضم وضوابط التعويض، أو صب نضح طاف و resuspend في فارز 2 مل العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد قياس التدفق الخلوي باستخدام عناصر التحكم التعويض أحادية اللون. حدد الجانب مبعثر ذات العرض (SSC-W) كمعلمة إضافية ليتم تسجيلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل عينات الملون باستخدام سلسلة من البوابات إدراج المتعاقبة CD4 + لتحديد أو CD8 + T الخلايا كما هو موضح في الشكلين 1 و 2. لكسور محدد، جمع خلايا أكبر عدد ممكن بحد أقصى 2،000،000 مجموع الأحداث. لكسور غير منضم، وجمع 1000000 مجموع الأحداث. الحفاظ على معدل الاستحواذ في 3000 أو أقل الأحداث في الثانية الواحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام إعدادات الجهاز نفسه، وتحليل عينات العد حبة. جمع 10000 مجموع الأحداث. &lt;/ لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ كافة البيانات في ملفات FCS. </li></ol> 5. تحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل FCS ملفات البيانات لعينات العد باستخدام حبة FlowJo البرمجيات. مبعثر مؤامرة قدمها FITC ووضع بوابة أرونج عد حبات (أنظر الشكلين 1 و 2). تحديد العدد الإجمالي للعد الخرز الكشف عن في كل عينة. طرح من إجمالي عدد الأحداث التي تم جمعها لتحديد عدد الخلايا التي تم جمعها من الأحداث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب العدد الإجمالي للجميع الخلايا في كل عينة باستخدام المعادلات المبينة في الإطار 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل FCS ملفات البيانات لعينات الملون جزء محدد وغير منضم. إعداد سلسلة من البوابات إدراج المتعاقبة لتحديد اللمفاوية +، لو الجانبية مبعثر العرض، تفريغ، CD3 +، + CD4 CD8 + أو، tetramer + الخلايا التائية في كل عينة كما هو موضح في الشكلين 1 و 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مضاعفة العدد الإجمالي للخلايا في العينة من الترددات لكل من بوابات إدراج تستخدم لتحديد CD4 + tetramer+ + CD8 أو tetramer + الخلايا لحساب العدد الإجمالي للخلايا T-حاتمة محددة (الإطار 1). </li></ol>

<ol>
	<li>Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+analysis+of+T-cell+immunity.">Laboratory analysis of T-cell immunity.</a> Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).</li><li>Kearney, E. R., Pape, K. A., Loh, D. Y., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+peptide-specific+T+cell+immunity+and+peripheral+tolerance+induction+in+vivo.">Visualization of peptide-specific T cell immunity and peripheral tolerance induction in vivo.</a> Immunity. 1, 327-339 (1994).</li><li>Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+epitope-specific+T+cells.">Tracking epitope-specific T cells.</a> Nat Protoc. 4, 565-581 (2009).</li><li>Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naive+and+memory+CD4++T+cell+survival+controlled+by+clonal+abundance.">Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance.</a> Science. 312, 114-116 (2006).</li><li>Marzo, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+T+cell+frequency+dictates+memory+CD8++T+cell+lineage+commitment.">Initial T cell frequency dictates memory CD8+ T cell lineage commitment.</a> Nat Immunol. 6, 793-799 (2005).</li><li>Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+the+repertoire:+broadening+the+scope+of+peptide-MHC+multimer+analysis.">Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis.</a> Nature reviews. Immunology. 11, 551-558 (2011).</li><li>Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naive+CD4(+)+T+cell+frequency+varies+for+different+epitopes+and+predicts+repertoire+diversity+and+response+magnitude.">Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude.</a> Immunity. 27, 203-213 (2007).</li><li>Seah, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+linear+range+for+accurately+quantifying+antigen-specific+T-cell+frequencies+by+tetramer+staining+during+natural+immune+responses.">The linear range for accurately quantifying antigen-specific T-cell frequencies by tetramer staining during natural immune responses.</a> European Journal of Immunology. 41, 1499-1500 (2011).</li><li>Obar, J. J., Khanna, K. M., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+naive+CD8++T+cell+precursor+frequency+regulates+primary+and+memory+responses+to+infection.">Endogenous naive CD8+ T cell precursor frequency regulates primary and memory responses to infection.</a> Immunity. 28, 859-869 (2008).</li><li>Daniels, M. A., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+for+CD8+in+T+cell+receptor+binding+and+activation+by+peptide/major+histocompatibility+complex+multimers.">Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers.</a> J Exp Med. 191, 335-346 (2000).</li><li>Pittet, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha+3+domain+mutants+of+peptide/MHC+class+I+multimers+allow+the+selective+isolation+of+high+avidity+tumor-reactive+CD8+T+cells.">Alpha 3 domain mutants of peptide/MHC class I multimers allow the selective isolation of high avidity tumor-reactive CD8 T cells.</a> Journal of Immunology. 171, 1844-1849 (2003).</li><li>Choi, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+avidity+antigen-specific+CTL+identified+by+CD8-independent+tetramer+staining.">High avidity antigen-specific CTL identified by CD8-independent tetramer staining.</a> Journal of Immunology. 171, 5116-5123 (2003).</li><li>Chu, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+selection+optimizes+the+number+and+function+of+MHCII-restricted+CD4++T+cell+clones+in+the+naive+polyclonal+repertoire.">Positive selection optimizes the number and function of MHCII-restricted CD4+ T cell clones in the naive polyclonal repertoire.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11241-11245 (2009).</li><li>Chu, H. H., Moon, J. J., Kruse, A. C., Pepper, M., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+Selection+and+Peptide+Chemistry+Determine+the+Size+of+Naive+Foreign+Peptide-MHC+Class+II-Specific+CD4++T+Cell+Populations.">Negative Selection and Peptide Chemistry Determine the Size of Naive Foreign Peptide-MHC Class II-Specific CD4+ T Cell Populations.</a> J Immunol. 185, 4705-4713 (2010).</li><li>Legoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+TCR+reactivity+and+HLA+phenotype+on+naive+CD8+T+cell+frequency+in+humans.">Impact of TCR reactivity and HLA phenotype on naive CD8 T cell frequency in humans.</a> J Immunol. 184, 6731-6738 (2010).</li><li>Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K., Hasan, M., Albert, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+human+antigen-specific+naive+CD8++T+cells+reveals+conserved+precursor+frequencies.">Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies.</a> Blood. 115, 3718-3725 (2010).</li><li>Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+of+Epitope-Specific+Naive+CD4++T+Cells+Correlates+with+Immunodominance+in+the+Human+Memory+Repertoire.">Frequency of Epitope-Specific Naive CD4+ T Cells Correlates with Immunodominance in the Human Memory Repertoire.</a> Journal of Immunology. 188, 2537-2544 (2012).</li><li>Jenkins, M. K., Chu, H. H., McLachlan, J. B., Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+composition+of+the+preimmune+repertoire+of+T+cells+specific+for+Peptide-major+histocompatibility+complex+ligands.">On the composition of the preimmune repertoire of T cells specific for Peptide-major histocompatibility complex ligands.</a> Annu Rev Immunol. 28, 275-294 (2010).</li><li>Matechak, E. O., Killeen, N., Hedrick, S. M., Fowlkes, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+class+II-specific+T+cells+can+develop+in+the+CD8+lineage+when+CD4+is+absent.">MHC class II-specific T cells can develop in the CD8 lineage when CD4 is absent.</a> Immunity. 4, 337-347 (1996).</li><li>Burchill, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linked+T+cell+receptor+and+cytokine+signaling+govern+the+development+of+the+regulatory+T+cell+repertoire.">Linked T cell receptor and cytokine signaling govern the development of the regulatory T cell repertoire.</a> Immunity. 28, 112-121 (2008).</li><li>Pepper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+routes+of+bacterial+infection+induce+long-lived+TH1+memory+cells+and+short-lived+TH17+cells.">Different routes of bacterial infection induce long-lived TH1 memory cells and short-lived TH17 cells.</a> Nature Immunology. 11, 83-89 (2010).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وtetramer PMHC تخصيب خلية مقرها طريقة التي قدمها هذا البروتوكول هو أداة قوية لدراسة حاتمة محددة خلايا T من الخلايا T الذاتية ذخيرة. استخدام tetramers PMHC تمكن الكشف عن خلايا T حاتمة محددة تستند مباشرة على قدرة TCRs لربط يغاندس PMHC وما شابه ذلك. إثراء يوفر مستوى من الحساسية بحيث يمكن الكشف عن السكان نادرة للغاية من الخلايا T-مستضد محددة من ذخيرة الذاتية من الخلايا T دون اي مس تكوينهم الوراثي أو تردد السلائف. ونتيجة لذلك، وهذا الأسلوب يسمح المحقق لتتبع مباشرة الذاتية مستضد محددة الخلايا T من السكان في النظم التجريبية المجراة من السذاجة مستوياتها خلال جميع مراحل الاستجابة المناعية. وقد تم تحسين هذا البروتوكول لاستخدام PMHC الدرجة الثانية (pMHCII) tetramers لتخصيب حاتمة محددة CD4 + T الخلايا اللمفاوية من الجهاز الثانويق من الفئران. ومع ذلك، فإن تقنية ينطبق أيضا على tetramers (pMHCI) PMHC فئة I + CD8 الخلايا وT 9. على عكس CD4، وcoreceptor CD8 تلعب دورا هاما في تحقيق الاستقرار TCR-MHC التفاعلات، وهذا يمكن أن يكون لها آثار عملية لتلطيخ tetramer pMHCI 10. وأبرزها، ينبغي أن يقتصر استخدام الأجسام المضادة لاستنساخ CD8 التي لا تضر CD8-tetramer ملزمة، وينبغي إضافتها إلى الخلايا بعد تلطيخ tetramer. في الواقع، لقد تم تصميم بعض tetramers pMHCI مع تحور مواقع CD8 MHCI ملزمة للتخفيف ملزمة لغير محددة CD8 + T الخلايا 11،12. يمكن Tetramer التركيز، وفترة حضانة، وحرارة الحضانة تؤثر بشكل كبير على كفاءة تلطيخ tetramer، وينبغي أن يكون الأمثل لتحقيق ظروف أفضل مزيج من إشارة tetramer عالية، وانخفاض إشارة الخلفية، وانخفاض استيعاب tetramer، وتغيرات طفيفة في علم وظائف الأعضاء الخلية. ومن الناحية المثالية، ينبغي أن تكون هذه الشروط به تحديد تجريبيا لكل كاشف فريدة من نوعها. في أيدينا، ومع ذلك، فإن تركيز النهائي من 10 نانومتر وحضانة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة توفر ظروف جيدة للعام tetramers معظم pMHCI أو pMHCII. بشكل عام، يبدو أن tetramers pMHCI وصمة عار بسهولة أكثر من tetramers pMHCII، ويمكن في كثير من الأحيان أن يؤديها في تلطيخ C ° 4 مقابل أقل من 30 دقيقة. هي مناسبة لحجم هذا الإجراء لتحليل ما يقرب من جميع الأجهزة اللمفاوية الثانوية على فأرة الحاسوب في عينة واحدة. لذلك، كل عينة تمثل تحليلا شاملا إلى حد ما من تعميم الطرفية كامل مرجع خلية T على فأرة الحاسوب. ويمكن أيضا حاتمة محددة الخلايا T يمكن المخصب من الأنسجة الأخرى ذات الصلة، بما في ذلك الغدة الصعترية 13،14. عندما يتم تحليل thymii من الفئران الأسبوع 4-5 من العمر، يمكن أن يتم الكشف عن حاتمة محددة thymocytes إيجابية واحدة في أعداد مماثلة لتلك التي الطرفية خلايا T السذاجة. حاتمة محددة نقرا مزدوجا إيجابية thymocytes،ومع ذلك، من الصعب جدا اكتشاف بسبب انخفاض مستويات التعبير TCR. ويمكن أيضا أن تتكيف هذا البروتوكول للكشف عن حاتمة محددة CD4 + الإنسان أو CD8 + T الخلايا في الدم أو الأنسجة الأخرى 15-17. تواتر من الخلايا T-حاتمة محددة هو تقريبا نفس بين الفئران والبشر 17، لذلك فإن التحليل 50 - 100 مل من الدم من شأنه أن يعود أرقام مقارنة للحاتمة محددة خلايا T والطحال والغدد الليمفاوية المجمعة على فأرة الحاسوب 18. ومن التحديات الرئيسية في تحليل تدفق cytometric من الخلايا بعد tetramer القائم على التخصيب المميزة الأحداث الحقيقية من الخلايا الخلفية. هذا يرجع إلى حد كبير إلى حقيقة أن الخلايا هي أيضا العديد من autofluorescent غير المخصب على وجه التحديد أثناء العملية. إن لم يكن من بوابات بعناية، يمكن لهذه الخلايا كخلايا autofluorescent تظهر tetramer إيجابية كاذبة والتخلص من دقة التحليل، وخاصة في حالة نادرة السذاجة الخلايا T عopulations. لدينا بروتوكول توظف استراتيجية النابضة من خطوتين في الأحداث التي CD3 + لأول بوابات بعيدا عن النسب تفريغ + الأحداث، ومن ثم CD4 + الأحداث بعيدا عن بوابات الأحداث CD8 +. في هذه العملية، autofluorescent الخلايا، والتي تميل إلى الكذب على طول مركز قطري من أي مؤامرة FACS، خارج بوابات للتحليل في اثنين متكررة الخطوات. إزالة فعالة للأحداث autofluorescent يأتي على حساب الألوان الفلورية كثيرة، لذلك نحن نوصي بشدة استخدام أجهزة قياس التدفق الخلوي قادرة على المعلمات لا يقل عن 6 الفلورسنت. tetramers معظم PMHC هي مترافق لPE وAPC نظرا لسطوع هذه fluorochromes، ومكافحة PE-APC ومكافحة microbeads المغناطيسي متوفرة لتمكين تخصيب معهم. ومع ذلك، يمكن أيضا أن تستخدم fluorochromes أخرى طالما microbeads المغناطيسي المقابلة متوفرة. في الواقع، يمكن استخدام tetramers متعددة مع تسميات مختلفة ملون تألقي مع هيئة التصنيع العسكري الأجسام المضادة مترافق المقابلةrobeads متعددة في وقت واحد لتخصيب حاتمة محددة السكان خلية T من نفس العينة. وقد أوجزنا أساسي جدا للأجسام المضادة ملون تألقي الإعداد التي يتم أمثل لاستخدام PE-APC tetramers وصفت-(الجدول 1)، ولكن العديد من تركيبات فعالة أخرى ممكنة لزيادة المرونة في دراسة علامات المظهري. ويمكن استخدام الخلايا CD8 + T السكان والسيطرة على السلبية الداخلية، لأنها لا ينبغي ربط يغاندس pMHCII (والعكس بالعكس لحاتمة CD8 + محددة تخصيب خلية T). وتيرة + + CD8 خلايا tetramer في عينة يوفر تقييما جيدا لمستوى تلطيخ tetramer الخلفية، على الرغم من حسن النية tetramer CD8 + إيجابية الخلايا T مع الصليب المقيدة لخصوصية الحواتم pMHCII قد تكون موجودة في ترددات صغيرة جدا 19. أحيانا أثناء الاستجابات المناعية قوية جدا، قد تكون هذه الخلايا موجودة في ترددات الموسعة. إذا رغبت، TCR المعدلة وراثيا الطرافة T الخلاياويمكن استخدام ساعة أو دون خصوصية حاتمة ذات الصلة إضافية الضوابط الإيجابية والسلبية. نلاحظ أن لأسباب غير معروفة، وبعض الخلايا المعدلة وراثيا وTCR hybridomas لا صمة بشكل جيد مع tetramers ذات الصلة. لدينا بروتوكول ينطوي على استخدام الخرز الفلورسنت عد للمساعدة في حساب الأرقام الخلية. بينما يمكن أيضا أن يتحقق عدد الخلايا يدويا مع عدادة الكريات، نجد أن استخدام العد الخرز النتائج التجريبية في الدقة أكبر بكثير، وخصوصا عندما تشارك المحققين متعددة. نظرا لأعداد صغيرة من الخلايا وحدات التخزين التي يتم معالجتها في هذا البروتوكول، يتعين على التقليل من الخطأ التجريبي أن يكون أولوية عالية. Tetramer تلطيخ متوافق مع تثبيت الخلية وpermeabilization، والعديد من الدراسات وتحليل بنجاح خلوى داخل الخلايا والنسخ التعبير عاملا في الخلايا التالية تخصيب الخلية tetramer المستندة إلى 20،21.ومع ذلك، فإن خطوات إضافية المعنية المساهمة في الخسائر خلية إضافية في العينات.

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; الكاشف</strong</td&gt;<td<strong&gt; البائع</strong</td&gt;<td<strong&gt; كتالوج عدد</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PE أو APC مترافق PMHC tetramer (أو متعدد القسيمات)</td&gt;<td&gt; صنع من قبل المحقق، تم الحصول عليها من المعاهد الوطنية للصحة الأساسية tetramer، أو تم شراؤها من مصادر تجارية</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; مكافحة PE microbeads المغناطيسي مترافق</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-048-801</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; مكافحة APC microbeads المغناطيسي مترافق</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-090-855</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; الأعمدة LS المغناطيسي</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-042-401</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MidiMACS أو المغناطيس QuadroMACS</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-042-302 أو 130-090-976</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; الخرز خلية العد</td&gt;<td&gt; الحياة تكنولوجيز</td&gt;<td&gt; PCB-100</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

peptide:mhc tetramer-based enrichment of epitope-specific t cells

ضرورة أساسية للباحثين الذين يدرسون الحصانة التكيف مع نماذج تجريبية في الجسم الحي هو القدرة على تحديد الخلايا T T بهم على أساس خلية مستقبلة المستضد (TCR) خصوصية. العديد من الطرق غير المباشرة التي تتوفر في عدد سكانها ويتم تحفيز الخلايا T الأكبر من في المختبر مع مستضد معين وحاتمة محددة خلايا T وتحديدها من خلال قياس استجابة وظيفية مثل انتشار الأسلحة النووية، إنتاج السيتوكينات، أو التعبير عن علامات التنشيط 1. ومع ذلك، هذه الأساليب تحديد حاتمة محددة فقط خلايا T واظهار واحدة من العديد من الوظائف المحتملة، وأنها ليست حساسة بما يكفي للكشف عن خلايا محددة حاتمة T على ترددات السلائف السذاجة. وثمة بديل شعبية هو المعدلة وراثيا TCR نموذج نقل بالتبني، والتي هي خلايا T المصنف حيدة النسيلة من الماوس المعدلة وراثيا في TCR المضيفين متوافق نسيجيا لخلق السكان السلائف كبير من الخلايا T-حاتمة محددة يمكن أن تكون EASIلي مع تعقب استخدام الأجسام المضادة علامة 2،3 مسانج مشترك. بينما قوية، وهذه الطريقة يعاني من التحف التجريبية المرتبطة تردد من الخلايا T unphysiological مع خصوصية لحاتمة واحدة 4،5. وعلاوة على ذلك، لا يمكن أن تستخدم هذا النظام للتحقيق في عدم التجانس الوظيفي للحاتمة محددة استنساخ الخلايا T للسكان من بولكلونل. يجب أن الطريقة المثلى لدراسة الحصانة التكيف تنطوي على الكشف المباشر للحاتمة محددة خلايا T T من مرجع الخلية المحلية باستخدام أسلوب الذي يميز خصوصية TCR فقط من قبل ملزم لالمشابهة الببتيد: مجمعات MHC (PMHC). استخدام tetramers PMHC والتدفق الخلوي يحقق هذا 6، ولكن يقتصر على الكشف عن السكان تيرة عالية من الخلايا T-حاتمة محددة لا توجد إلا مستضد التالية التي يسببها التوسع نسيلي. في هذا البروتوكول، ونحن تصف الطريقة التي تنسق استخدام tetramers PMHC وماغنيتيك تكنولوجيا تخصيب الخلية لتمكين الكشف عن خلايا T التردد المنخفض للغاية حاتمة محددة من الأنسجة اللمفاوية 3،7 الماوس. مع هذه التقنية، يمكن للمرء أن تتبع شامل كامل حاتمة محددة من الخلايا T السكان الذاتية في الفئران في جميع مراحل الاستجابة المناعية.

الشكل 1 يصور ممثل المؤامرات التدفق الخلوي من الطحال pMHCII المخصب tetramer وعينات من الفئران العقدة الليمفاوية السذاجة، بينما يصور الشكل 2 بيانات تمثيلية للتحصين الفئران سابقا مع الببتيد ذات الصلة + CFA. مسلسل الأحداث النابضة يزيل autofluorescent غير المرغوب فيها وغيرها من CD4 + تحليل السكان خلية T. وCD8 + T الخلية السكان بمثابة السيطرة مفيدة السلبية الداخلية لتلطيخ tetramer pMHCII من CD4 + الخلايا التائية. نلاحظ أن الكسور متجهة من تخصيب عادة ما تحتوي على نسبة أعلى بكثير من الخلايا autofluorescent من الكسور غير منضم، مما يجعل النابضة أكثر تحديا. وتحسب الأعداد المطلقة للخلايا T حاتمة محددة في عينة بضرب العدد الإجمالي لجميع الخلايا في جزء محدد من العينة التخصيب، كما هو محدد من تحليل عدد حبة، مع نسبة هذه الخلايا التي هي tetramer +، ومحدداتNED من الخلية تحليل تلطيخ (الإطار 1). لالسذاجة الماوس في الشكل 1، وتركيز جميع الخلايا في جزء محدد من العينة (4411/5589) (200.000) (0.200/0.005) = 6،31 × 10 6 / مل. إجمالي عدد الخلايا في جميع العينة (6.31 × 10 6 / مل) (0.095) = 6.00 × 10 5. وأخيرا، فإن العدد الإجمالي للحاتمة محددة CD4 + T الخلايا هي (6.00 × 10 5) (41.5٪) (96.6٪) (10.2٪) (62.3٪) (0.64٪) = 98. لتحصين الماوس في الشكل 2، وتركيز جميع الخلايا في جزء محدد من العينة (6410/3590) (200.000) (0.200/0.005) = 1،43 X 10 7 / مل. إجمالي عدد الخلايا في جميع العينة (1.43 × 10 7 / مل) (0.095) = 1.36 × 10 6. وأخيرا، فإن العدد الإجمالي للحاتمة محددة CD4 + T الخلايا هي (1.36 × 10 6) (40.9٪) (93.9٪) (9.54٪) (72.0٪) (42.7٪) = 1.53 × 10 4 &lt;/ STRONG&gt;. انخفاض كفاءة التخصيب وعدد الخلايا T-حاتمة محددة يزيد 8، بحيث يمكن أن ينظر إليها tetramer + الخلايا في جزء من العينات تحتوي على غير منضم الترددات العالية جدا من الخلايا T-حاتمة محددة. ويمكن حساب في مثل هذه الحالات، وعدد من الخلايا T-حاتمة محددة موجودة في جزء غير منضم على حدة، وأضاف أن عدد جدت في جزء محدد. لذلك، في الشكل 2، وتركيز جميع الخلايا في جزء من العينة غير منضم هو (9031/969) (200.000) (0.200/0.005) = 7،46 X 10 7 / مل، فإن العدد الإجمالي لجميع الخلايا هو (7.46 X 10 7 / مل) (2.0) = 1.49 × 10 8، والعدد الإجمالي للحاتمة محددة CD4 + الخلايا T هو (1.49 × 10 8) (62.7٪) (96.4٪) (44.5٪) (54.7٪) (0.0409 ٪) = 8.97 × 10 3. إضافة الأرقام في الكسور غير منضم منضم و، هناك 1،53 × 10 4 + 8.97 × 10 3 = 2.43 X10 4 مجموع حاتمة محددة CD4 + T الخلايا في العينة كلها. في الواقع، إذا حاتمة محددة التوسع خلية قوية بما فيه الكفاية، يمكن تخطي عملية التخصيب. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ملون تألقي </td><td> الجسم المضاد </td></tr><tr><td> المحيط الهادئ الأزرق </td><td> تفريغ (B220، CD11b، CD11c، F4/80) </td></tr><tr><td> أورانج المحيط الهادئ </td><td> CD8 </td></tr><tr><td> FITC </td><td> CD3 </td></tr><tr><td> PE </td><td> PMHC tetramer أو علامة المظهري </td></tr><tr><td> PerCP </td><td> CD4 </td></tr><tr><td> APC </td><td> PMHC tetramer أو علامة المظهري </td></tr><tr><td> AlexaFluor 700 </td><td> CD44 </td></tr></tbody></table> واقترح الجدول 1. الضد استراتيجية تلطيخ <img alt="الشكل 1" fo<html> : عرض المحتوى = &quot;6in&quot; FO: SRC = &quot;/ files/ftp_upload/4420/4420fig1highres.jpg&quot; SRC = &quot;/ files/ftp_upload/4420/4420fig1.jpg&quot; /&gt; الشكل 1. تحليل تدفق cytometric من حاتمة محددة CD4 + T الخلايا في الفئران بعد السذاجة تخصيب tetramer القائم على pMHCII. وتظهر قطع ممثل عن كسور (B) منضمة (A) وغير منضم. يتم تعيين A خلافة جيتس لتحديد اللمفاوية +-مبعثر، جنبا إلى مبعثر-widthlo، تفريغ، CD3 + الأحداث. من هذه، CD4 + + CD8 أو الأحداث بوابات لتحليل الخلايا T-حاتمة محددة أو تلطيخ الخلفية. كانت مختلطة مأخوذة من الخلايا غير ملوثين من الكسر (D) منضمة (C) وغير منضم مع الخرز الفلورسنت العد وتحليلها بشكل منفصل. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4420/4420fig1large.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية</a> . oad/4420/4420fig2.jpg &quot;/&gt; تحليل التدفق الرقم 2. cytometric من حاتمة محددة CD4 + T الخلايا في الفئران الببتيد تحصين بعد تخصيب tetramer القائم على pMHCII. وتظهر قطع ممثل عن كسور (B) منضمة (A) وغير منضم. يتم تعيين A خلافة جيتس لتحديد اللمفاوية +-مبعثر، جنبا إلى مبعثر-widthlo، تفريغ، CD3 + الأحداث. من هذه، CD4 + + CD8 أو الأحداث بوابات لتحليل الخلايا T-حاتمة محددة أو تلطيخ الخلفية. كانت مختلطة مأخوذة من الخلايا غير ملوثين من الكسر (D) منضمة (C) وغير منضم مع الخرز الفلورسنت العد وتحليلها بشكل منفصل. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4420/4420fig2large.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية</a> . الإطار 1. حساب حاتمة محددة أعداد الخلايا T وتحسب أفضل الأعداد المطلقة للخلايا T-حاتمة محددة مع المعونة من الخرز الفلورسنت العد. وقسامة من غير ملوثينيتم خلط الخلايا من كل عينة بحجم محدد من عد حبات تعيين بتركيز المعروف ومن ثم تحليلها من قبل التدفق الخلوي. ويمكن أن يستدل من تركيز الخلايا في عينة من المقارنة بين وتيرتها مع تركيز معروف من الخرز الفلورسنت العد. <img alt="المعادلة 1" src="/files/ftp_upload/4420/4420eq1.jpg" /> ثم يتم حساب إجمالي عدد الخلايا في العينة عن طريق ضرب تركيز الخلية مع حجم العينة الكلية. <img alt="المعادلة 2" src="/files/ftp_upload/4420/4420eq2.jpg" /> العدد الإجمالي للحاتمة محددة خلايا T في العينة هو ببساطة العدد الإجمالي لجميع الخلايا في العينة مضروبا في نسبة الخلايا التي هي tetramer إيجابية. <img alt="المعادلة 3" src="/files/ftp_upload/4420/4420eq3.jpg" />

Watch this Scientific Journal Video about Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells at JoVE.com

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

يصف هذا البروتوكول استخدام الببتيد: MHC tetramers وmicrobeads المغناطيسي لعزل السكان التردد المنخفض من الخلايا T-حاتمة محددة وتحليلها من قبل التدفق الخلوي. هذه الطريقة تمكن من الدراسة الذاتية المباشرة السكان خلية T من الاهتمام من<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; أنظمة التجريبية.

الببتيد: MHC Tetramer القائم على إثراء خلايا T حاتمة محددة

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

peptidemhc-tetramer-based-enrichment-of-epitope-specific-t-cells

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.8K Views.  Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School. يصف هذا البروتوكول استخدام الببتيد: MHC tetramers وmicrobeads المغناطيسي لعزل السكان التردد المنخفض من الخلايا T-حاتمة محددة وتحليلها من قبل التدفق الخلوي. هذه الطريقة تمكن من الدراسة الذاتية المباشرة السكان خلية T من الاهتمام من في الجسم الحي أنظمة التجريبية.

Video: Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

تنبيغ من فيروسات تي خلية المستقبلات في الخلايا التائية ماوس

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in immunologic homeostasis with the vast amount of self and commensal antigens in and on the human body. Perturbations in the balance between Tregs and inflammatory conventional T cells can result in immunopathology or cancer. Although therapeutic injection of Tregs has been shown to be efficacious in murine models of colitis1 , type I diabetes2 , rheumatoid arthritis and graft versus host disease,4 several fundamental differences in human versus mouse Treg biology5 has thus far precluded clinical use. The lack of sufficient number, purity, stability and homing specificity of therapeutic Tregs necessitated a dynamic platform of human Treg development on which to optimize conditions for their ex vivo expansion6.
Here we describe a method for the differentiation of induced Tregs (iTregs) from a single human peripheral blood donor which can be broken down into four stages: isolation of peripheral blood mononuclear cells, magnetic selection of CD4+ T cells, in vitro cell culture and fluorescence activated cell sorting (FACS) of T cell subsets. Since the Treg signature transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) is an activation-induced transcription factor in humans7 and no other unique marker exists, a combinatorial panel of markers must be used to identify T cells with suppressor activity. After six days in culture, cells in our system can be demarcated into na&iuml;ve T cells, memory T cells or iTregs based on their relative expression of CD25 and CD45RA. As memory and na&iuml;ve T cells have different reported polarization requirements and plasticities8 , pre-sorting of the initial T cell population into CD45RA+ and CD45RO+ subsets can be used to examine these discrepancies. Consistent with others, our CD25HiCD45RA- iTregs express high levels of FoxP39 , GITR and CTLA-411 and low levels of CD12712 . Following FACS of each population, resultant cells can be used in a suppressor assay which evaluates the relative ability to retard the proliferation of carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeled autologous T cells.

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&amp;#239;ve and Memory T Cells

We describe a method for generating regulatory, memory and na&#239;ve T cells from a single human blood donor. Polarized Tregs can be then compared to other subsets in a variety of genetic and functional applications with genetic homogeneity, including a suppression assay also detailed here.

جيل من الخلايا المستحثة تي التنظيمية من المرحلة الابتدائية الإنسان خلايا T ساذجة والذاكرة

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of malignancies 1. CTLs can recognize malignant cells by interacting tumor antigens with the T cell receptors (TCR), and release cytotoxins as well as cytokines to kill malignant cells. It is known that less-differentiated and central-memory-like (termed highly reactive) CTLs are the optimal population for ACT-based immunotherapy, because these CTLs have a high proliferative potential, are less prone to apoptosis than more differentiated cells and have a higher ability to respond to homeostatic cytokines 2-7. However, due to difficulties in obtaining a high number of such CTLs from patients, there is an urgent need to find a new approach to generate highly reactive Ag-specific CTLs for successful ACT-based therapies.
TCR transduction of the self-renewable stem cells for immune reconstitution has a therapeutic potential for the treatment of diseases 8-10. However, the approach to obtain embryonic stem cells (ESCs) from patients is not feasible. Although the use of hematopoietic stem cells (HSCs) for therapeutic purposes has been widely applied in clinic 11-13, HSCs have reduced differentiation and proliferative capacities, and HSCs are difficult to expand in in vitro cell culture 14-16. Recent iPS cell technology and the development of an in vitro system for gene delivery are capable of generating iPS cells from patients without any surgical approach. In addition, like ESCs, iPS cells possess indefinite proliferative capacity in vitro, and have been shown to differentiate into hematopoietic cells. Thus, iPS cells have greater potential to be used in ACT-based immunotherapy compared to ESCs or HSCs.
Here, we present methods for the generation of T lymphocytes from iPS cells in vitro, and in vivo programming of antigen-specific CTLs from iPS cells for promoting cancer immune surveillance. Stimulation in vitro with a Notch ligand drives T cell differentiation from iPS cells, and TCR gene transduction results in iPS cells differentiating into antigen-specific T cells in vivo, which prevents tumor growth. Thus, we demonstrate antigen-specific T cell differentiation from iPS cells. Our studies provide a potentially more efficient approach for generating antigen-specific CTLs for ACT-based therapies and facilitate the development of therapeutic strategies for diseases.

Generation of T lymphocytes from induced pluripotent stem (iPS) cells gives an alternative approach of using embryonic stem cells for T cell-based immunotherapy. The method shows that by utilizing either in vitro or in vivo induction system, iPS cells are able to differentiate into both conventional and antigen-specific T lymphocytes.

توجه التمييز بين الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة نحو الخلايا اللمفية تي

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

piggyBac تعديل النظام الأساسي للخلايا ينقول T الإنسان

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in various immune responses. DN T cells are a unique immune cell type that has been implicated in regulating immune and autoimmune responses and tolerance to allotransplants1-6. DN T cells are, however, rare in peripheral blood and secondary lymphoid organs (spleen and lymph nodes), but are major residents of the normal kidney. Very little is known about their pathophysiologic function7 due to their paucity in the periphery. We recently described a comprehensive phenotypic and functional analysis of this population in the kidney8 in steady state and during ischemia reperfusion injury. Analysis of DN T cell function will be greatly enhanced by developing a protocol for their isolation from the kidney.
Here, we describe a novel protocol that allows isolation of highly pure ab CD4+ CD8+ T cells and DN T cells from the murine kidney. Briefly, we digest kidney tissue using collagenase and isolate kidney mononuclear cells (KMNC) by density gradient. This is followed by two steps to enrich hematopoietic T cells from 3% to 70% from KMNC. The first step consists of a positive selection of hematopoietic cells using a CD45+ isolation kit. In the second step, DN T cells are negatively isolated by removal of non-desired cells using CD4, CD8, and MHC class II monoclonal antibodies and CD1d &#945;-galcer tetramer. This strategy leads to a population of more than 90% pure DN T cells. Surface staining with the above mentioned antibodies followed by FACs analysis is used to confirm purity.

Isolation of Double Negative &amp;#945;&amp;#946; T Cells from the Kidney

DNabT cells are rare among peripheral T cells; however, they are abundant in certain non-lymphoid tissues. Difficulty of isolating DN T cells from non-lymphoid tissue hinders their functional analysis despite increasing recognized pathophysiologic significance. We describe a novel protocol for isolation of highly purified DN T cells from murine kidney.

عزل مزدوج السلبية خلايا T αβ من الكلى

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

اشتقاق خلايا T<em&gt; في المختبر</em&gt; من الفأر الجنينية الخلايا الجذعية

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

توليد خلايا T الإنسان مستضد خيفي محددة من الدم المحيطي

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection occurring after allogeneic hematopoietic stem-cell transplantation. Viral-specific T cells from allogeneic donors, including third party donors, can be propagated ex vivo in compliance with current good manufacturing practice (cGMP), employing repeated rounds of antigen-driven stimulation to selectively propagate desired T cells. The identification and isolation of antigen-specific T cells can also be undertaken based upon the cytokine capture system of T cells that have been activated to secrete gamma-interferon (IFN-&#947;). However, widespread human application of the cytokine capture system (CCS) to help restore immunity has been limited as the production process is time-consuming and requires a skilled operator. The development of a second-generation cell enrichment device such as CliniMACS Prodigy now enables investigators to generate viral-specific T cells using an automated, less labor-intensive system. This device separates magnetically labeled cells from unlabeled cells using magnetic activated cell sorting technology to generate clinical-grade products, is engineered as a closed system and can be accessed and operated on the benchtop. We demonstrate the operation of this new automated cell enrichment device to manufacture CMV pp65-specific T cells obtained from a steady-state apheresis product obtained from a CMV seropositive donor. These isolated T cells can then be directly infused into a patient under institutional and federal regulatory supervision. All the bio-processing steps including removal of red blood cells, stimulation of T cells, separation of antigen-specific T cells, purification, and washing are fully automated. Devices such as this raise the possibility that T cells for human application can be manufactured outside of dedicated good manufacturing practice (GMP) facilities and instead be produced in blood banking facilities where staff can supervise automated protocols to produce multiple products.

The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.

الآلي إثراء خلية من الفيروس المضخم للخلايا محددة خلايا T للتطبيقات السريرية باستخدام نظام خلوى التقاط

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

T خلايا التقاط البكتيريا التي كتبها Transinfection من الخلايا الجذعية

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and multiplexing ability. Using fluorescent nano-diamond fiducial markers, we describe the drift correction and alignment procedures required to obtain high precision in single molecule localization microscopy. In addition, a new multiplexing strategy, madSTORM, is described in which multiple molecules are targeted in the same cell using sequential binding and elution of fluorescent antibodies. madSTORM is demonstrated on an activated T cell to visualize the locations of different components within a membrane-bound, multi-protein structure called the T cell receptor microcluster. In addition, application of madSTORM as a general tool for visualization of multi-protein structures is discussed.

We demonstrate a method to image multiple molecules within heterogeneous nano-structures at single molecule accuracy using sequential binding and elution of fluorescently labeled antibodies.