فإن الكتاب أود أن أعرب عن امتناني لمختبرات والمجموعات والأفراد الذين طوروا غالاكسي وDAVID، وبالتالي جعل NGS الوصول إليها على نطاق واسع للمجتمع العلمي. واعترف المساعدة والمشورة التي يقدمها زملاؤه في جامعة بيتسبرغ خلال التدريب المعلوماتية الحيوية لدينا. وأيد هذا العمل من قبل المؤسسة الطبية الباحث إليسون الجديد في الشيخوخة جائزة (AG-NS-0879-12) ومنحة من المعاهد الوطنية للصحة (R01AG051659) إلى AG.

<ol>
	<li>Venter, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sequence+of+the+human+genome.">The sequence of the human genome.</a> Science. 291 (5507), 1304-1351 (2001).</li><li>Lander, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+sequencing+and+analysis+of+the+human+genome.">Initial sequencing and analysis of the human genome.</a> Nature. 409 (6822), 860-921 (2001).</li><li>Afgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Galaxy+platform+for+accessible,+reproducible+and+collaborative+biomedical+analyses:+2016+update.">The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update.</a> Nucleic Acids Res. 44 (W1), W3-W10 (2016).</li><li>Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopHat:+discovering+splice+junctions+with+RNA-Seq.">TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq.</a> Bioinformatics. 25 (9), 1105-1111 (2009).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-Seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation.">Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nat Biotechnol. 28 (5), 511-515 (2010).</li><li>Roberts, A., Trapnell, C., Donaghey, J., Rinn, J. L., Pachter, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+RNA-Seq+expression+estimates+by+correcting+for+fragment+bias.">Improving RNA-Seq expression estimates by correcting for fragment bias.</a> Genome Biol. 12 (3), R22 (2011).</li><li>Roberts, A., Pimentel, H., Trapnell, C., Pachter, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+transcripts+in+annotated+genomes+using+RNA-Seq.">Identification of novel transcripts in annotated genomes using RNA-Seq.</a> Bioinformatics. 27 (17), 2325-2329 (2011).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks.">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat Protoc. 7 (3), 562-578 (2012).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+analysis+of+gene+regulation+at+transcript+resolution+with+RNA-seq.">Differential analysis of gene regulation at transcript resolution with RNA-seq.</a> Nat Biotechnol. 31 (1), 46-53 (2013).</li><li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources.">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).</li><li>Giardine, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galaxy:+a+platform+for+interactive+large-scale+genome+analysis.">Galaxy: a platform for interactive large-scale genome analysis.</a> Genome Res. 15 (10), 1451-1455 (2005).</li><li>Han, Y., Gao, S., Muegge, K., Zhang, W., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+Applications+of+RNA+Sequencing+and+Challenges.">Advanced Applications of RNA Sequencing and Challenges.</a> Bioinform Biol Insights. 9 (1), 29-46 (2015).</li><li>Mardis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+platforms.">Next-generation sequencing platforms.</a> Annu Rev Anal Chem (Palo Alto Calif). 6, 287-303 (2013).</li><li>Yang, I. S., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Whole+Transcriptome+Sequencing+Data:+Workflow+and+Software.">Analysis of Whole Transcriptome Sequencing Data: Workflow and Software.</a> Genomics Inform. 13 (4), 119-125 (2015).</li><li>Khatri, P., Draghici, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontological+analysis+of+gene+expression+data:+current+tools,+limitations,+and+open+problems.">Ontological analysis of gene expression data: current tools, limitations, and open problems.</a> Bioinformatics. 21 (18), 3587-3595 (2005).</li><li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatics+enrichment+tools:+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists.">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).</li><li>Shaye, D. D., Greenwald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OrthoList:+a+compendium+of+C.+elegans+genes+with+human+orthologs.">OrthoList: a compendium of C. elegans genes with human orthologs.</a> PLoS One. 6 (5), e20085 (2011).</li><li>Consortium, C. e. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+nematode+C.+elegans:+a+platform+for+investigating+biology.">Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology.</a> Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).</li><li>Agarwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+and+calibration+of+transcriptome+data+from+RNA-Seq+and+tiling+arrays.">Comparison and calibration of transcriptome data from RNA-Seq and tiling arrays.</a> BMC Genomics. 11, 383 (2010).</li><li>Mortazavi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffolding+a+Caenorhabditis+nematode+genome+with+RNA-seq.">Scaffolding a Caenorhabditis nematode genome with RNA-seq.</a> Genome Res. 20 (12), 1740-1747 (2010).</li><li>Bohnert, R., Ratsch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rQuant.web:+a+tool+for+RNA-Seq-based+transcript+quantitation.">rQuant.web: a tool for RNA-Seq-based transcript quantitation.</a> Nucleic Acids Res. 38, W348-W351 (2010).</li><li>Lamm, A. T., Stadler, M. R., Zhang, H., Gent, J. I., Fire, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+RNA-seq+using+single-strand,+double-strand,+and+CircLigase-based+capture+yields+a+refined+and+extended+description+of+the+C.+elegans+transcriptome.">Multimodal RNA-seq using single-strand, double-strand, and CircLigase-based capture yields a refined and extended description of the C. elegans transcriptome.</a> Genome Res. 21 (2), 265-275 (2011).</li><li>Amrit, F. R., Ratnappan, R., Keith, S. A., Ghazi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+lifespan+assay+toolkit.">The C. elegans lifespan assay toolkit.</a> Methods. 68 (3), 465-475 (2014).</li><li>Hsin, H., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+from+the+reproductive+system+regulate+the+lifespan+of+C.+elegans.">Signals from the reproductive system regulate the lifespan of C. elegans.</a> Nature. 399 (6734), 362-366 (1999).</li><li>Alper, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+germ+line+regulates+distinct+signaling+pathways+to+control+lifespan+and+innate+immunity.">The Caenorhabditis elegans germ line regulates distinct signaling pathways to control lifespan and innate immunity.</a> J Biol Chem. 285 (3), 1822-1828 (2010).</li><li>Steinbaugh, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-mediated+regulation+of+SKN-1/Nrf+in+response+to+germ+cell+absence.">Lipid-mediated regulation of SKN-1/Nrf in response to germ cell absence.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Lapierre, L. R., Gelino, S., Melendez, A., Hansen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+and+lipid+metabolism+coordinately+modulate+life+span+in+germline-less.">Autophagy and lipid metabolism coordinately modulate life span in germline-less.</a> C. elegans. Curr Biol. 21 (18), 1507-1514 (2011).</li><li>Rourke, E. J., Soukas, A. A., Carr, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+major+fats+are+stored+in+vesicles+distinct+from+lysosome-related+organelles.">C. elegans major fats are stored in vesicles distinct from lysosome-related organelles.</a> Cell Metab. 10 (5), 430-435 (2009).</li><li>Ghazi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+networks+that+mediate+signals+from+reproductive+tissues+to+influence+lifespan.">Transcriptional networks that mediate signals from reproductive tissues to influence lifespan.</a> Genesis. 51 (1), 1-15 (2013).</li><li>Ghazi, A., Henis-Korenblit, S., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcription+elongation+factor+that+links+signals+from+the+reproductive+system+to+lifespan+extension+in+Caenorhabditis+elegans.">A transcription elongation factor that links signals from the reproductive system to lifespan extension in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genet. 5 (9), e1000639 (2009).</li><li>Amrit, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAF-16+and+TCER-1+Facilitate+Adaptation+to+Germline+Loss+by+Restoring+Lipid+Homeostasis+and+Repressing+Reproductive+Physiology+in+C.+elegans.">DAF-16 and TCER-1 Facilitate Adaptation to Germline Loss by Restoring Lipid Homeostasis and Repressing Reproductive Physiology in C. elegans.</a> PLoS Genet. 12 (2), e1005788 (2016).</li><li>Wang, M. C., O'Rourke, E. J., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat+metabolism+links+germline+stem+cells+and+longevity+in+C.+elegans.">Fat metabolism links germline stem cells and longevity in C. elegans.</a> Science. 322 (5903), 957-960 (2008).</li><li>McCormick, M., Chen, K., Ramaswamy, P., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+genes+that+extend+Caenorhabditis+elegans'+lifespan+in+response+to+reproductive+signals.">New genes that extend Caenorhabditis elegans' lifespan in response to reproductive signals.</a> Aging Cell. 11 (2), 192-202 (2012).</li><li>Kartashov, A. V., Barski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioWardrobe:+an+integrated+platform+for+analysis+of+epigenomics+and+transcriptomics+data.">BioWardrobe: an integrated platform for analysis of epigenomics and transcriptomics data.</a> Genome Biol. 16, 158 (2015).</li><li>Goncalves, A., Tikhonov, A., Brazma, A., Kapushesky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pipeline+for+RNA-seq+data+processing+and+quality+assessment.">A pipeline for RNA-seq data processing and quality assessment.</a> Bioinformatics. 27 (6), 867-869 (2011).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

أهمية التسلسل منصة غالاكسي في علم الأحياء الحديث أصبح مشروع غالاكسي دورا أساسيا في مساعدة علماء الأحياء دون تدريب المعلوماتية الحيوية لمعالجة وتحليل البيانات تسلسل عالية الإنتاجية بطريقة سريعة وفعالة. كانت تعتبر مهمة شاقة، جعلت...

التسلسل الأول من الجينوم البشري، قام باستخدام طريقة dideoxynucleotide التسلسل فريد سانجر، واستغرق 10 سنوات، وتكلف ما يقدر بنحو 3 مليارات $ 1 و 2. ومع ذلك، الجيل التالي من التسلسل جعلت (خ ع) التكنولوجيا في ما يزيد قليلا على عقد من الزمان منذ إنشائها من الممكن لتسلسل الجينوم البشري بأكمله في غضون أسبوعين والولايات المتحدة 1000 $. أدوات NGS الجديدة التي تسمح بسرعة جمع تسلسل البيانات المتزايدة مع كفاءة لا يصدق، جنبا إلى جنب مع تخفيضات حادة في التكاليف، هي ثورة البيولوجيا الحديثة بطرق لا يمكن تصورها كما هي مشاريع تسلسل الجينوم أصبحت بسرعة شائعا. وبالإضافة إلى ذلك، قد حفزت هذه التطورات التقدم في العديد من المجالات الأخرى مثل تحليل الجينات التعبير من خلال RNA-التسلسل (RNA-يليها)، ودراسة التعديلات جينية على نطاق الجينوم، وتفاعلات الحمض النووي والبروتينات، والكشف عن التنوع الميكروبي في المضيف البشري. NGS القائم على RNA سيجعلت ف على وجه الخصوص من الممكن تحديد وترنسكربيتوم خريطة شاملة مع الدقة والحساسية، وحلت محل تكنولوجيا متطورة مثل طريقة الاختيار لتحديد ملامح التعبير. في حين تكنولوجيا متطورة استخدمت على نطاق واسع، ويقتصر من قبل اعتمادها على المصفوفات القائمة من قبل مع المعلومات الجينية المعروفة، وعيوب أخرى مثل التهجين عبر ومجموعة محدودة من التغييرات التعبير التي يمكن قياسها بشكل موثوق. RNA وما يليها، من ناحية أخرى، يمكن أن تستخدم لكشف كل النصوص المعروفة وغير المعروفة في حين أن إنتاج منخفضة الضوضاء الخلفية نظرا لطبيعة لا لبس فيها رسم خرائط الحمض النووي. RNA-تسلسل جنبا إلى جنب مع أدوات الوراثية كثيرة عرضت من قبل الكائنات نموذج مثل الخميرة والذباب والديدان والأسماك والفئران، وقد خدم، كأساس للعديد من الاكتشافات الطبية الحيوية الهامة الأخيرة. ومع ذلك، تبقى تحديات كبيرة التي تجعل NGS قابلة للوصول إلى المجتمع العلمي الأوسع، بما في ذلك القيود المفروضة على التخزين والتجهيز، والأهم من ذلك كله، م<html> تحليل المعلوماتية الحيوية eaningful كميات كبيرة من البيانات التسلسل. خلقت التقدم السريع في تكنولوجيا التسلسل وتراكم البيانات الأسي حاجة كبيرة لمنصات الحسابية التي من شأنها أن تسمح للباحثين للوصول وتحليل وفهم هذه المعلومات. وكانت النظم الأولى تعتمد بشكل كبير على المعرفة برمجة الكمبيوتر، في حين المتصفحات الجينوم مثل NCBI التي سمحت غير المبرمجين للوصول إلى وتصور البيانات لا تسمح تحليلات متطورة. منصة، والوصول المفتوح على شبكة الإنترنت، غالاكسي ( <a href="https://galaxyproject.org/" target="_blank">https://galaxyproject.org/</a> )، وقد شغل هذا الفراغ وثبت أن خط أنابيب قيمة تمكن الباحثون لمعالجة البيانات NGS وتنفيذ مجموعة بسيطة-لمجمع تحليل المعلوماتية الحيوية. وقد أنشأت غالاكسي في البداية، وحافظت، من خلال مختبرات انطون Nekrutenko (جامعة ولاية بنسلفانيا)، وجيمس تايلور (جامعة جونز هوبكنز)و &quot;&gt; 3. غالاكسي يقدم مجموعة واسعة من المهام الحسابية مما يجعلها&quot; محطة واحدة &quot;لتلبية الاحتياجات المعلوماتية الحيوية لا تعد ولا تحصى، بما في ذلك جميع الخطوات المتبعة في دراسة الحمض النووي الريبي يليها. Itallows للمستخدمين تنفيذ معالجة البيانات إما على خوادمها أو محليا على أجهزتهم الخاصة. البيانات وسير العمل يمكن استنساخها وتبادلها. البرامج التعليمية عبر الإنترنت، والمساعدة القسم، ويكي الصفحات ( <a href="https://wiki.galaxyproject.org/Support" target="_blank">https://wiki.galaxyproject.org/Support</a> ) مخصصة لمشروع غالاكسي توفر الدعم المستمر. ومع ذلك، لأول مرة للمستخدمين، وخاصة أولئك الذين ليس لهم تدريب المعلوماتية الحيوية، يمكن أن تظهر في خط أنابيب شاقة وعملية التعلم الذاتي والتعريف يمكن أن يكون مضيعة للوقت. وبالإضافة إلى ذلك، درس النظام البيولوجي، وتفاصيل التجربة وطرق استخدامها، والأثر القرارات التحليلية في عدة خطوات، وهذه يمكن أن يكون من الصعب التنقل دون توجيه. وعموما RN<html> يتكون A-تسلسل غالاكسي سير العمل في تحميل البيانات والتأكد من جودتها تليها تحليل باستخدام سهرة جناح 4، 5، 6، 7، 8، 9، وهو الجماعية لمختلف الأدوات اللازمة لمراحل مختلفة من تحليل البيانات RNA يليها 10، 11، 12، 13، 14. تتكون التجربة-RNA يليها نموذجية من الجزء التجريبي (إعداد العينات، والعزلة مرنا وكدنا] إعداد مكتبة)، وNGS وتحليل المعلوماتية الحيوية البيانات. لمحة عامة عن هذه الأقسام، والخطوات المتبعة في خط أنابيب غالاكسي، وتظهر في الشكل 1. 3fig1.jpg &quot;/&gt; الشكل (1): نظرة عامة على سير عمل RNA-تسلسل. التوضيح من الخطوات التجريبية والحسابية تشارك في تجربة-RNA يليها مقارنة ملامح الجينات التعبير من سلالتين دودة (A و B، وخطوط برتقالية وخضراء والسهام، على التوالي). وتظهر وحدات مختلفة من غالاكسي المستخدمة في مربعات مع الخطوة المقابلة في بروتوكول لدينا هو مبين في الحمراء. تتم كتابة مخرجات العمليات المختلفة في الرمادي مع تنسيقات الملفات هو مبين في الزرقاء. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55473/55473fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> الأداة الأولى في جناح سهرة هو برنامج المواءمة يسمى &#39;Tophat. ينهار مدخلات NGS يقرأ إلى أجزاء أصغر ومن ثم خرائط لهم الجينوم المرجعية. وتضمن هذه عملية من خطوتين الذي يقرأ تغطي المناطق intronic تتضاعف الذي يمكن أن يكون الأمر خلاف ذلك دي محاذاةsrupted أو تحتسب وتعيين تفويتها. وهذا يزيد من التغطية ويسهل التعرف على تقاطعات لصق جديدة. وتفيد التقارير الانتاج Tophat كما ملفين، ملف BED (مع معلومات حول تقاطعات لصق التي تشمل موقع الجيني) وملف BAM (مع تفاصيل رسم الخرائط من كل قراءة). بعد ذلك، يتم محاذاة الملف BAM ضد الجينوم مرجعية لتقدير وفرة من النصوص الفردية داخل كل عينة باستخدام أداة لاحقة في جناح سهرة بعنوان &quot;أزرار&quot;. أزرار وظائف عن طريق مسح المحاذاة إلى تقرير شظايا النص بالطول أو &quot;transfrags&quot; التي تشمل جميع المتغيرات لصق المحتملة في إدخال البيانات عن كل جينة. وبناء على هذا، فإنه يقوم بإنشاء &quot;Transcriptome على&quot; (تجميع كل النصوص ولدت في الجينات لكل الجينات) لكل عينة يجري التسلسل. ثم انهارت هذه التجميعات أزرار أكمام أو دمجها معا جنبا إلى جنب مع إعادةference الجينوم لإنتاج ملف الشرح واحد لتحليل التفاضلية المصب باستخدام أداة المقبلة، &quot;Cuffmerge. وأخيرا، فإن &quot;Cuffdiff&quot; التعبير الجيني أداة التدابير التفاضلية بين العينات عن طريق مقارنة النتائج TopHat كل من العينات إلى ملف الإخراج Cuffmerge النهائي (الشكل 1). أزرار أكمام تستخدم FPKM / RPKM (شظايا / يقرأ لكل كيلو قاعدة من نسخة لكل مليون معين يقرأ) القيم أن يقدم فرة نسخة. وتعكس هذه القيم تطبيع البيانات NGS الخام لعمق (متوسط ​​عدد القراءات من عينة أن محاذاة إلى الجينوم مرجعية) وطول الجين (الجينات لها أطوال مختلفة، لذلك لها التهم ليتم تطبيع للطول الجيني لمقارنة مستويات بين الجينات). FPKM وRPKM لا تختلف في جوهرها مع RPKM تستخدم لنهاية واحدة RNA-تسلسل حيث يتوافق مع كل قراءة لجزء واحد، في حين يستخدم FPKM لإقران نهاية RNA-تسلسل، كما يفسر حقيقة أن اثنين من يقرأ يمكن أن تتوافق مع نفس الجزء. وفي النهاية، فإن نتائج هذه التحليلات هي قائمة من الجينات وأعرب تفاضلي بين الظروف و / أو السلالات التي تم اختبارها. بمجرد الانتهاء من مسيرته الناجحة غالاكسي ويتم إنشاء &quot;قائمة الجينات، فإن الخطوة المنطقية المقبلة تتطلب المزيد المعلوماتية الحيوية تحليل للاستدلال على المعرفة ذات مغزى من قواعد البيانات. ظهرت العديد من حزم البرامج لتلبية هذه الحاجة، بما في ذلك المتاحة للجمهور حزم الحسابية على شبكة الإنترنت مثل DAVID (قاعدة بيانات عن الشرح، والتصور واكتشاف المتكاملة) 15. DAVID يسهل تعيين المعنى البيولوجي للقوائم الجينات كبيرة من الدراسات الإنتاجية العالية من خلال مقارنة قائمة الجينات التي تم تحميلها على المعرفة البيولوجية المتكاملة والكشف عن شروح البيولوجية المرتبطة قائمة الجينات. ويلي ذلك تحليل والإثراء، أي من الاختبارات لبيئة تطوير متكاملةntify إذا كان زائدا أي عملية أو الجينات الطبقة البيولوجية في قائمة الجينات (ق) بطريقة ذات دلالة إحصائية. فقد أصبح خيارا شعبيا بسبب مزيج من اسعة ومتكاملة قاعدة المعرفة والخوارزميات التحليلية القوية التي تمكن الباحثين للكشف عن مواضيع البيولوجية التخصيب داخل الجينوم المشتقة &#39;القوائم الجين &quot;10 و 16. وتشمل مزايا إضافية قدرتها على معالجة قوائم الجينات التي تم إنشاؤها على أي منصة التسلسل واجهة عالية سهل الاستعمال. الديدان الخيطية انواع معينة ايليجانس هي نموذج نظام وراثي، معروف جيدا لمزاياها العديدة مثل صغر حجمها، وجسم شفاف، خطة هيئة بسيطة، وسهولة الثقافة وقابليته الكبيرة للتشريح الجيني والجزيئي. الديدان لها الجينوم صغيرة وبسيطة ومشروحة جيدا أن تشمل ما يصل الى 40٪ من الجينات الحفظ مع homologs البشرية المعروفة 17. في الواقع، C. ايليجانسكان متعددة الخلايا الأولى التي كان التسلسل تماما 18 الجينوم، واحدة من الأنواع الأولى حيث تم استخدام الحمض النووي الريبي تسلسل إلى خريطة Transcriptome على الكائن الحي 19 و 20. دراسات دودة في وقت مبكر وشملت التجارب مع أساليب مختلفة لالتقاط عالية الإنتاجية RNA، وإعداد مكتبة والتسلسل وكذلك خطوط الأنابيب المعلوماتية الحيوية التي ساهمت في النهوض التكنولوجيا 21 و 22. في السنوات الأخيرة، أصبح التجريب أساس RNA-تسلسل في الديدان شائعا. ولكن، لعلماء الأحياء دودة التقليدية للتحديات التي تفرضها التحليل الحسابي لبيانات RNA بعدها لا تزال تشكل عائقا رئيسيا لأكبر وأفضل استخدام لهذه التقنية. في هذه المقالة، نحن تصف بروتوكول لاستخدام منصة غالاكسي لتحليل البيانات RNA يليها الإنتاجية العالية المتولدة من C. ايليجانس. بالنسبة للعديد من أول مرة وهيئة السلع التموينية صغيرةالمستخدمين جنيه، والطريقة الأكثر وضوحا فعالة من حيث التكلفة لإجراء تجربة-RNA يليها هو عزل الحمض النووي الريبي في المختبر والاستفادة منشأة NGS التجاري (أو في المنزل) لإعداد مكتبات كدنا] تسلسل وNGS نفسها. وبالتالي، لدينا لأول مرة بالتفصيل الخطوات المتبعة في عزلة، الكمي ونوعية تقييم C. ايليجانس عينات الحمض النووي الريبي لRNA-تسلسل. بعد ذلك، نحن نقدم إرشادات خطوة بخطوة لاستخدام واجهة غالاكسي لتحليل البيانات NGS، بدءا من الاختبارات لاجراء فحوص مراقبة الجودة بعد التسلسل تليها المحاذاة، والتجمع، والفارق الكمي في التعبير الجيني. وبالإضافة إلى ذلك، أدرجنا الاتجاهات للتدقيق في قوائم الجينات الناتجة عن غالاكسي للدراسات البيولوجية تخصيب باستخدام DAVID. كخطوة نهائية في سير العمل، ونحن نقدم تعليمات لتحميل البيانات RNA يليها الدخول إلى ملقمات العامة مثل تسلسل مقروءة الأرشيف (SRA) على NCBI ( <a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra" target="_blank">HTTP: // ث</a>ww.ncbi.nlm.nih.gov/sra) لجعلها في متناول مجانا للمجتمع العلمي. وبشكل عام، فإننا نتوقع أن هذه المادة سوف توفر معلومات شاملة وكافية لعلماء الأحياء دودة إجراء تجارب RNA يليها لأول مرة وكذلك المستخدمين بشكل متكرر تشغيل عدد قليل من العينات.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>RNase spray&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-402-178</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>15596026</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Sonics Vibra Cell&#160;</td>
			<td>VCX130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>288306</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A416P-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2705HC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP561-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2940CA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mac/PC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transcriptomic analysis of c. elegans rna sequencing data through the tuxedo suite on the galaxy project

أحدثت ثورة في الجيل القادم التسلسل (خ ع) تقنيات طبيعة التحقيق البيولوجي. ومن بين هؤلاء، برزت RNA تسلسل (RNA-تسلسل) كأداة قوية لتحليل الجينات التعبير ورسم الخرائط Transcriptome على. ومع ذلك، والتعامل مع قواعد البيانات-RNA يليها يتطلب خبرة حسابية معقدة وتحديات الملازمة للباحثين علم الأحياء. تم تخفيف هذه العقبة من خلال المشروع الوصول المفتوح غالاكسي التي تسمح للمستخدمين دون المهارات المعلوماتية الحيوية لتحليل البيانات RNA يليها، وقاعدة بيانات عن الشرح، والتصور، والمتكاملة ديسكفري (DAVID)، وجين علم الوجود (GO) جناح تحليل المصطلح الذي يساعد استخلاص المعنى البيولوجي من مجموعات البيانات الكبيرة. ومع ذلك، لأول مرة للمستخدمين الهواة والمعلوماتية الحيوية &quot;، والتعلم الذاتي والتعريف مع هذه المنصات يمكن أن يكون وشاقة تستغرق وقتا طويلا. نحن تصف سير العمل واضحة من شأنها أن تساعد C. ايليجانس الباحثين لعزل دودة RNA، إجراء تجربة-RNA يليهاوتحليل البيانات باستخدام غالاكسي وDAVID المنصات. يوفر هذا البروتوكول تعليمات تدريجية لاستخدام مختلف وحدات غالاكسي للوصول إلى البيانات الخام NGS والشيكات مراقبة الجودة، والمحاذاة، وتحليل التعبير الجيني التفاضلية، وتوجيه المستخدم مع المعلمات في كل خطوة لإنشاء قائمة الجينات التي يمكن فرزهم للتخصيب دروس الجينات أو العمليات البيولوجية باستخدام DAVID. وبشكل عام، فإننا نتوقع أن هذه المادة سوف توفر معلومات إلى C. ايليجانس الباحثون بإجراء تجارب RNA يليها لأول مرة وكذلك المستخدمين بشكل متكرر تشغيل عدد قليل من العينات.

في C. elegans، يكون القضاء على الخلايا الجذعية سلالة الجرثومية (GSCs) يمتد عمر، ويعزز مرونة الإجهاد، ويرفع الدهون في الجسم 24 و 28. فقدان GSCs، سواء الناجمة عن الليزر الاجتثاث أو عن طريق الطفرات مثل GLP-1، يسبب تمديد عمر ?...

Watch this Scientific Journal Video about Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project at JoVE.com

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

ظهرت المجرة وDAVID كأدوات الشعبية التي تسمح للمحققين دون تدريب المعلوماتية الحيوية لتحليل وتفسير البيانات RNA يليها. نحن تصف بروتوكول للC. ايليجانس الباحثين لإجراء التجارب، والوصول RNA يليها ومعالجة بيانات باستخدام جالاكسي والحصول على المعلومات البيولوجية ذات مغزى من القوائم الجين باستخدام DAVID.

تحليل Transcriptomic من<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; ايليجانس</em&gt; RNA تسلسل البيانات من خلال جناح سهرة على مشروع غالاكسي

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged ...

transcriptomic-analysis-c-elegans-rna-sequencing-data-through-tuxedo

Research

JoVE Journal

Genetics

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

17.3K Views.  University of Pittsburgh School of Medicine, Children's Hospital of Pittsburgh.  ظهرت المجرة وDAVID كأدوات الشعبية التي تسمح للمحققين دون تدريب المعلوماتية الحيوية لتحليل وتفسير البيانات RNA يليها. نحن تصف بروتوكول للC. ايليجانس الباحثين لإجراء التجارب، والوصول RNA يليها ومعالجة بيانات باستخدام جالاكسي والحصول على ال...

Video: Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.

Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.

اقترانية التزاوج فحوصات لتحليل تسلسل محدد من البروتينات نقل تشارك في الإقتران البكتيرية

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

الكشف عن نسخة عدد التعديلات عن طريق التسلسل خلية واحدة

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be investigated through electrophysiological analysis, biochemical characterization, mutational studies, and their effects on cellular processes. Transient transfections offer a simple protocol in which the protein becomes available for analysis within a few hours to days. Although this method presents a relatively straightforward and time efficient protocol, one of the critical components is calibrating the expression of the gene of interest to physiological relevant levels or levels that are suitable for analysis. To this end, many different approaches that offer the ability to control the expression of the gene of interest have emerged. Several stable cell transfection protocols provide a way to permanently introduce a gene of interest into the cellular genome under the regulation of a tetracycline-controlled transcriptional activation. While this technique produces reliable expression levels, each gene of interest requires a few weeks of skilled work including calibration of a killing curve, selection of cell colonies, and overall more resources. Here we present a protocol that uses transient transfection of the Transient Receptor Potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) gene in an inducible system as an efficient way to express a protein in a controlled manner which is essential in ion channel analysis. We demonstrate that using this technique, we are able to perform calcium imaging, whole cell, and single channel analysis with controlled channel levels required for each type of data collection with a single transfection. Overall, this provides a replicable technique that can be used to study ion channels structure and function.

Studying ion channels through a heterologously expressing system has become a core technique in biomedical research. In this manuscript, we present a time efficient method to achieve tightly controlled ion channel expression by performing transient transfection under the control of an inducible promoter.

السيطرة التعبير قناة ايون من خلال ترنسفكأيشن عابر محرض

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. Therefore, DNA-protein interactions regulate multiple physiological, pathophysiological, and biological functions, such as cell differentiation, cell proliferation, cell cycle control, chromosome stability, epigenetic gene regulation, and cell transformation. In eukaryotic cells, the DNA interacts with histone and nonhistone proteins and is condensed into chromatin. Several technical tools can be used to analyze DNA-protein interactions, such as the Electrophoresis (gel) Mobility Shift Assay (EMSA) and DNase I footprinting. However, these techniques analyze the protein-DNA interaction in vitro, not within the cellular context. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a technique that captures proteins at their specific DNA binding sites, thereby allowing for the identification of DNA-protein interactions within their chromatin context. It is done by fixation&#160;of the DNA-protein interaction, followed by&#160;immunoprecipitation of the protein of interest. Subsequently, the genomic site that the protein was bound to is characterized. Here, we describe and discuss ChIP and demonstrate its analytical value for the identification of the Transforming Growth Factor-&#946; (TGF-&#946;)-induced binding of the transcription factor SMAD2 to SMAD Binding Elements (SBE) within the promoter region of the tyrosine-protein kinase Kit (c-KIT) receptor ligand Stem Cell Factor (SCF).

DNA-protein interactions are essential for multiple biological processes. During the evaluation of cellular functions, the analysis of DNA-protein interactions is indispensable for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to analyze such interactions in vivo.

تحليل ج- كيت يجند المروج باستخدام الكروماتين مناعي

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has been associated with both the progression of cancer and the development of drug resistance. Until now, it has not been feasible to easily manipulate the ploidy of a multicellular animal without generating mostly sterile progeny. Presented here is a simple and rapid protocol for generating tetraploid Caenorhabditis elegans animals from any diploid strain. This method allows the user to create a bias in chromosome segregation during meiosis, ultimately increasing ploidy in C. elegans. This strategy relies on the transient reduction of expression of the rec-8 gene to generate diploid gametes. A rec-8 mutant produces diploid gametes that can potentially produce tetraploids upon fertilization. This tractable scheme has been used to generate tetraploid strains carrying mutations and chromosome rearrangements to gain insight into chromosomal dynamics and interactions during pairing and synapsis in meiosis. This method is efficient for generating stable tetraploid strains without genetic markers, can be applied to any diploid strain, and can be used to derive triploid C. elegans. This straightforward method is useful for investigating other fundamental biological questions relevant to genome instability, gene dosage, biological scaling, extracellular signaling, adaptation to stress, development of resistance to drugs, and mechanisms of speciation.

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

This method allows for the generation of tetraploid and triploid Caenorhabditis nematodes from any diploid strain. Polyploid strains generated by this method have been used to study chromosome interactions in meiotic prophase, and this method is useful for examining important basic questions in cell, developmental, evolutionary, and cancer biology.

التلاعب في بلويدي في ايليجانس كاينورهابديتيس

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing high-throughput short-read DNA sequencing. The resulting sequence datasets can not only track what genes in a population that are enriched during selection for positive yeast 2-hybrid interactions, but also give detailed information about the relevant subdomains of proteins sufficient for interaction. Here, we describe a full suite of stand-alone software programs that allow non-experts to perform all the bioinformatics and statistical steps to process and analyze DNA sequence fastq files from a batch yeast 2-hybrid assay. The processing steps covered by these software include: 1) mapping and counting sequence reads corresponding to each candidate protein encoded within a yeast 2-hybrid prey library; 2) a statistical analysis program that evaluates the enrichment profiles; and 3) tools to examine the translational frame and position within the coding region of each enriched plasmid that encodes the interacting proteins of interest.

Deep sequencing of yeast populations selected for positive yeast 2-hybrid interactions potentially yields a wealth of information about interacting partner proteins. Here, we describe the operation of specific bioinformatics tools and customized updated software to analyze sequence data from such screens.

تحليل بيانات تسلسل من دفعة الخميرة 2-الهجين شاشات المعلوماتي

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to normal and pathological conditions. The goal of this protocol is to generate high-quality, large-scale transcriptome data of each endocrine cell type with the use of a droplet-based microfluidic single-cell RNA sequencing technology. Such data can be utilized to build the gene expression profile of each endocrine cell type in normal or specific conditions. The process requires careful handling, accurate measurement, and rigorous quality control. In this protocol, we describe detailed steps for human pancreatic islets dissociation, sequencing, and data analysis. The representative results of about 20,000 human single islet cells demonstrate the successful application of the protocol.

Here, we present a protocol to generate high-quality, large-scale transcriptome data of single cells from isolated human pancreatic islets using a droplet-based microfluidic single-cell RNA sequencing technology.

تسلسل وتحليل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية من الجزر البنكرياسية البشرية

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT employs two purification steps. First, immunoprecipitation of a tagged RNP subunit is followed by mild RNase digestion and subsequent non-denaturing affinity elution. A second immunoprecipitation of another RNP subunit allows for enrichment of a defined complex. Following a denaturing elution of RNAs and proteins, the RNA footprints are converted into high-throughput DNA sequencing libraries. Unlike the more popular ultraviolet (UV) crosslinking followed by immunoprecipitation (CLIP) approach to enrich RBP binding sites, RIPiT is UV-crosslinking independent. Hence RIPiT can be applied to numerous proteins present in the RNA interactome and beyond that are essential to RNA regulation but do not directly contact the RNA or UV-crosslink poorly to RNA. The two purification steps in RIPiT provide an additional advantage of identifying binding sites where a protein of interest acts in partnership with another cofactor. The double purification strategy also serves to enhance signal by limiting background. Here, we provide a step-wise procedure to perform RIPiT and to generate high-throughput sequencing libraries from isolated RNA footprints. We also outline RIPiT&#39;s advantages and applications and discuss some of its limitations.

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Here, we present a protocol to enrich endogenous RNA binding sites or &#34;footprints&#34;&#160;of RNA:protein (RNP) complexes from mammalian cells. This approach involves two immunoprecipitations of RNP subunits and is therefore dubbed RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT).

تحديد آثار أقدام RNA: مجمعات البروتين عن طريق الحمض النووي الريبي المناعيفية جنبا إلى جنب تليها التسلسل (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein interactions, and regulation of parental gene transcription. In classical next generation RNA sequencing (RNA-seq), circRNAs are typically overlooked as a result of poly-A selection during construction of mRNA libraries, or are found at very low abundance, and are therefore difficult to isolate and detect. Here, a circRNA library construction protocol was optimized by comparing library preparation kits, pre-treatment options and various total RNA input amounts. Two commercially available whole transcriptome library preparation kits, with and without RNase R pre-treatment, and using variable amounts of total RNA input (1 to 4 &#181;g), were tested. Lastly, multiple tissue types; including liver, lung, lymph node, and pancreas; as well as multiple brain regions; including the cerebellum, inferior parietal lobe, middle temporal gyrus, occipital cortex, and superior frontal gyrus; were compared to evaluate circRNA abundance across tissue types. Analysis of the generated RNA-seq data using six different circRNA detection tools (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC, and CIRCexplorer) revealed that a stranded total RNA library preparation kit with RNase R pre-treatment and 4 &#181;g RNA input is the optimal method for identifying the highest relative number of circRNAs. Consistent with previous findings, the highest enrichment of circRNAs was observed in brain tissues compared to other tissue types.

Circular RNAs (circRNAs) are non-coding RNAs that may have roles in transcriptional regulation and mediating interactions between proteins. Following assessment of different parameters for construction of circRNA sequencing libraries, a protocol was compiled utilizing stranded total RNA library preparation with RNase R pre-treatment and is presented here.

تحديد RNAs الدائري باستخدام تسلسل RNA

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported for in vitro differentiation of keratinocytes cultured in two-dimensional (2D) submerged manners using various induction conditions. Described here is a procedure for 2D in vitro keratinocyte differentiation method by contact inhibition and subsequent molecular characterization by RNA-seq. In brief, keratinocytes are grown in defined keratinocyte medium supplemented with growth factors until they are fully confluent. Differentiation is induced by close contacts between the keratinocytes and further stimulated by excluding growth factors in the medium. Using RNA-seq analyses, it is shown that both 1) differentiated keratinocytes exhibit distinct molecular signatures during differentiation and 2) the dynamic gene expression pattern largely resembles cells during epidermal stratification. As for comparison to normal keratinocyte differentiation, keratinocytes carrying mutations of the transcription factor p63 exhibit altered morphology and molecular signatures, consistent with their differentiation defects. In conclusion, this protocol details the steps for 2D in vitro keratinocyte differentiation and its molecular characterization, with an emphasis on bioinformatic analysis of RNA-seq data. Because RNA extraction and RNA-seq procedures have been well-documented, it is not the focus of this protocol. The experimental procedure of in vitro keratinocyte differentiation and bioinformatic analysis pipeline can be used to study molecular events during epidermal differentiation in healthy and diseased keratinocytes.

Presented here is a stepwise procedure for in vitro differentiation of human primary keratinocytes by contact inhibition followed by characterization at the molecular level by RNA-seq analysis.

توصيف التمايز في المختبر من خلايا الكيراتينوسيات الأولية البشرية بواسطة تحليل الحمض النووي الريبي-SEQ

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...

تحليل Transcriptomic من

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video