أود أن أشكر الدكتور ألن سين بيرانتونى (CDBL/NCI/المعاهد الوطنية للصحة) لدعم تقديم هذه المخطوطة. أود أيضا أن أشكر الدكتور مايكل هول (CDBL/NCI/المعاهد الوطنية للصحة) و Nirmala شارما (CDBL/NCI/المعاهد الوطنية للصحة) لتحرير هذه المخطوطة. أنا ممتن لأي ثانغ (سايك) لتربية ماوس ممتازة له. وأيد هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة، المعهد الوطني للسرطان، ومركز "أبحاث السرطان".

الفئران (فلكس Wnt5a/فلكس الفئران (Wnt5a tm1.1Tpy) وخط Dll1Cre، ونموذج الماوس أوفجو) 7 تدار وفقا للمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية ودراسة في إطار بروتوكول أقرته لجنة الاستخدام ورعاية الحيوان NCI-فريدريك.
 1-"إعداد حل صبغة أزرق الميثيلين" <ol><li>قياس مسحوق أزرق الميثيلين 0.1 غ.</li>
	<li>حل أزرق الميثيلين في المحلول الملحي العادي 10 مل أو 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) تماما بواسطة فورتيكسينج.</li>
	<li>تصفية الحل الميثيلين الأزرق 10 ملغ/مل مع عامل تصفية المحاقن (حجم المسام غشاء 0.45µm) للقضاء على انسداد أثناء حقن.</li>
	<li>تجميع فروة الرأس عقيمة الوريد مجموعة (27GX3/4 &#8243;) مع 3 مل حقنه المتاح وملء المحاقن مع 3 مل تصفية حل أزرق الميثيلين. 
	ملاحظة: لمنع الضغط الهيدروليكي وتدفق صبغ اللاحقة، ضع طرف إبرة أعلاه حقنه مليئة الأزرق الميثيلين الحل.</li>
</ol> 2. تشريح الأجنة "قبل الولادة" <ol><li>نظيفة تشريح المقص والملقط مع الإيثانول 70%-</li>
	<li>لجمع الأجنة قبل الولادة في E18.5 أو E19.5، euthanize الفئران الحوامل استخدام استنشاق أول أكسيد الكربون 2 أولاً ثم قم بإجراء خلع عنق الرحم وفقا للمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة- 
	ملاحظة: الماوس الإناث الحوامل وعادة ما تلد البدء في E18.5، إلا أن الكليتين أكبر أسهل للتعامل معها. ولذلك، الكلي في E19.5 أقرب للولادة أسهل لإجراء هذا التحليل على. ومع ذلك، من الجراء مع المسالك البولية ثنائية العراقيل يموت بعد الولادة. وينبغي تبعاً لخصائص الفئران التجريبية، تحديد يوم أو وقت جمع مناسب تجريبيا.</li>
	<li>رذاذ الإيثانول 70% على سطح البطن البطني ثم قم بفتح التجويف البطني بطنيا باستخدام مقص وملقط تشريح.</li>
	<li>رفع الرحم كامل وفصل من الجسم بالقطع مع تشريح مقص على نصائح قرون الرحم.</li>
	<li>شطف الرحم كامل مع برنامج تلفزيوني 1 x في طبق بيتري.</li>
	<li>الرحم سيجمينتالي مع تشريح مقص قطع وإزالة المشيمة أوروبية مع تشريح الملقط للكشف عن الأجنة في الأكياس صفار.</li>
	<li>إزالة كيس الصفار أولاً ومن ثم إزالة الغشاء السلوى بتشريح الملقط لتحرير الأجنة قبل الولادة-</li>
	<li>قطع رأس جنين بتشريح المقص. تمحو الدم الزائد مع منصات شاش معقم. دبوس الجنين إلى أسفل مع سطحه البطني حتى على مجهر تشريح مجهزة بكاميرا رقمية للتصوير. جمع ذيله للتنميط إذا لزم الأمر- 
	ملاحظة: إجراء حقن الأجنة واحد في وقت واحد.</li>
	<li>بعناية فتح التجويف البطني للجنين بالملقط بتمزق الجلد. ثم، بعناية إزالة الزائدة والأنسجة مثل الكبد والمعدة والأمعاء بالملقط بقصها أو الانسحاب منها لفضح الكليتين والحالب والمثانة التي تقع في دورسالي ( الشكل 1A). امتصاص الدم الزائد من تشريح الجنين مع منصات شاش معقم إذا لزم الأمر- 
	ملاحظة: الدم الزائد يتداخل مع تحديد الحوض الكلوي لحقن صبغة.</li>
</ol> 3. حقن صبغة "أزرق الميثيلين" إلى الحوض الكلوي ورصد تدفق صبغ <ol><li>إزالة الفقاعات في الإبر والأنابيب بطرد أزرق الميثيلين الحل من طرف الإبرة بالضغط الهيدروليكي. رفع المحاقن التي تحتوي على الحل صبغ فوق مستوى الحافة إبرة لبدء تدفق، وثم انخفاض المحاقن لوقف التدفق.</li>
	<li>أدخل الإبرة في الحوض الكلوي قرب الحالب الدانية، مع الحرص على عدم الإخلال بأنها وضعت مرة واحدة. إجراء حقن صبغة في الكلي لتحديد به انسداد المسالك البولية. 
	ملاحظة: إجراء صبغ حقن في أي الكلي غير طبيعي 7 الأولى باتباع نفس الطريقة لتحديد به انسداد المسالك البولية.</li>
	<li>رفع المحاقن يصل حوالي 20 سم لتوفير الضغط الهيدروليكي واسمحوا ميليلتر 15-60 ميليلتر من تدفق الحل الصبغ. معدل التدفق ستكون حوالي 3 ميليلتر/s إذا أثير المحاقن لهذا الارتفاع فوق الجنين.</li>
	رصد <li>اللون الأزرق لصبغ ابتداء من أول في الحوض الكلوي، ثم في طول الحالب، وأخيراً في التجويف المثانة. 
	ملاحظة: يستغرق حوالي 5 s لمشاهدة لون صبغة ضعيفة تنشأ داخل التجويف المثانة إذا كان يتم بشكل صحيح إدراج الحالب في المثانة. تسمح الصبغة تتراكم في موقع المحظورة حوالي 15 ثانية إذا ظهر أي لون الصبغة في تجويف المثانة.</li>
	<li>مكان المحاقن وصولاً إلى وقف تدفق صبغ وإزالة الإبرة من الكلي.</li>
	<li>تأخذ الصور الكلي والحالب والمثانة تتبع مع الحل صبغ استخدام الكاميرا والتصوير البرنامج متصلاً ستيريوميكروسكوبي.</li>
	<li>جعل سجل hydronephrosis الكلي، هيدروريتير، والموقف النهائي للحل صبغ في دفتر ملاحظات معمل.</li>
	حقن <li>أداء الكلي كونترالاتيرال كما هو موضح في المقاطع 3.1) إلى 3.5) والسماح بتدفق صبغ حوالي 20 s في المجموع- 
	ملاحظة: سيتم ملء التجويف المثانة مع الحل الصبغ، المبين بلون أزرق قوي، إذا كان الحالب يتم إدراجها بشكل صحيح في تجويف المثانة. بعد تقييم لعرقلة مفرق المسالك البولية، يمكن أن تكون ثابتة الحالب والمثانة من أجل تمزيقها.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rasouly, H. M., Lu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+urinary+tract+development+and+disease.">Lower urinary tract development and disease.</a> Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 5, 307-342 (2013).</li><li>Kispert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Box+Genes+in+the+Kidney+and+Urinary+Tract.">T-Box Genes in the Kidney and Urinary Tract.</a> Curr Top Dev Biol. 122, 245-278 (2017).</li><li>Bohnenpoll, T., Kispert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ureter+growth+and+differentiation.">Ureter growth and differentiation.</a> Semin Cell Dev Biol. 36, 21-30 (2014).</li><li>Nicolaou, N., Renkema, K. Y., Bongers, E. M., Giles, R. H., Knoers, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic,+environmental,+and+epigenetic+factors+involved+in+CAKUT.">Genetic, environmental, and epigenetic factors involved in CAKUT.</a> Nat Rev Nephrol. 11, 720-731 (2015).</li><li>Tripathi, P., Wang, Y., Casey, A. M., Chen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+canonical+Smad+signaling+in+ureteral+and+bladder+mesenchyme+causes+ureteropelvic+junction+obstruction.">Absence of canonical Smad signaling in ureteral and bladder mesenchyme causes ureteropelvic junction obstruction.</a> J Am Soc Nephrol. 23, 618-628 (2012).</li><li>Aoki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Id2+haploinsufficiency+in+mice+leads+to+congenital+hydronephrosis+resembling+that+in+humans.">Id2 haploinsufficiency in mice leads to congenital hydronephrosis resembling that in humans.</a> Genes Cells. 9, 1287-1296 (2004).</li><li>Yun, K., Perantoni, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydronephrosis+in+the+Wnt5a-ablated+kidney+is+caused+by+an+abnormal+ureter-bladder+connection.">Hydronephrosis in the Wnt5a-ablated kidney is caused by an abnormal ureter-bladder connection.</a> Differentiation. 94, 1-7 (2017).</li><li>Uetani, N., Bouchard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plumbing+in+the+embryo:+developmental+defects+of+the+urinary+tracts.">Plumbing in the embryo: developmental defects of the urinary tracts.</a> Clin Genet. 75, 307-317 (2009).</li><li>Murawski, I. J., Watt, C. L., Gupta, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+urinary+tract+defects+in+mice:+methods+to+detect+the+presence+of+vesicoureteric+reflux+and+urinary+tract+obstruction.">Assessing urinary tract defects in mice: methods to detect the presence of vesicoureteric reflux and urinary tract obstruction.</a> Methods Mol Biol. 886, 351-362 (2012).</li><li>Weiss, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephric+duct+insertion+requires+EphA4/EphA7+signaling+from+the+pericloacal+mesenchyme.">Nephric duct insertion requires EphA4/EphA7 signaling from the pericloacal mesenchyme.</a> Development. 141, 3420-3430 (2014).</li></ol>

ليس له علاقة بالكشف عن صاحب البلاغ.

الماوس الكلي الوظيفية بدءاً E16.5 واختبار حقن صبغة من الممكن نظرياً من هذه النقطة الزمنية. ومع ذلك، الكلي صغير جداً بالحقن مع الحل صبغ وتعمل مثل هيدرونيفروسيس وهيدروريتير لا تراعي وضوح حيث تعمل هذه تأثير ثانوية من البول التي تراكمت بسبب النقل البول غير طبيعي. وتتضح هذه تعمل، من العراقيل مثل ...

الجهاز البولي يتكون من زوج من الكلي والحالب والمثانة ومجرى البول مشتركة. والوظيفة الرئيسية للجهاز البولي المحافظة على التوازن الجسم بإدارة توازن الماء والكهرباء للدم. الكلي تصفية الدم لتركيزات اﻻلكتروﻻيت التحكم وحمض قاعدة التوازن، وإنتاج البول تفرز فائض المياه والنفايات بما في ذلك الذوائب ونواتج الأيض. ثم يتم نقل البول من خلال الحالب من الحوض الكلوي الكلي إلى بلاديرين بطريقة أحادية الاتجاه حيث يتم تخزينها والقضاء عليها في نهاية المطاف عن طريق الاحليل1.
الحالب أنابيب مستقيمة مصدرها القناة ونمائية. بعد الناشئين من لاصق ونمائية يوم الجنينية 10.5 (E10.5) في الماوس، ساق الحالب الغضروفي ويفرق في بنية متعددة الطبقات تسمى أوروثيليوم وكتيمه بين الماوس E12.5 و E16.5. كما تختلف الخلايا الوسيطة التي تحيط بساق الحالب إلى ثلاث طبقات مكونة من الخلايا اللحمية الداخلية وخلايا العضلات الملساء سميكة الوسيطة الليفية أدفينتيتيال الخارجي. موجات تمعجية الحالب الشروع في الحوض الكلوي تنتشر من خلال طبقة العضلات الملساء لجدار الحالب إلى المثانة لنقل البول2،3، الذي يتم إنتاجه في بداية E16.5 في الماوس1.
التشوهات الخلقية في الكلي والمسالك البولية (كاكوت) من بين الأمراض الوراثية الأكثر شيوعاً، في حوالي 1 في المائة من الأجنة البشرية1،4، وتتألف من مجموعة متنوعة من تعمل بما في ذلك هيدرونيفروسيس وهيدروريتير. ويؤدي التراكم غير طبيعي للبول في الكلي والحالب تشكيل هيدرونيفروتيك hydroureter والكلى. أحد الأسباب لتشكيل هيدرونيفروسيس و/أو هيدروريتير من انسداد المسالك البولية. انسداد مفرق أوريتيروبيلفيك (أوبجو) بسبب تدفق البول الشاذة بسبب انسداد الحالب الدانية بين الحوض الكلوي، مما أدى إلى هيدرونيفروسيس وتضييق hydroureter الدانية مع أنجولاتيون أو المستمرة للطي5، 6. وباﻹضافة إلى ذلك، إدراج الحالب القاصي حمل خارج الرحم في جدار المثانة أو المسالك التناسلية يسمى عرقلة مفرق أوريتيروفيسيكال (أوفجو). يمكن أيضا لحمل أوفجو هيدرونيفروسيس وهيدروميجوريتير7،تشكيل8. هو عيب مفرق (أوفج) أوريتيروفيسيكال إضافية الجزر فيسيكوريتيريك (فور). فور يتسم بالتدفق إلى الوراء البول من المثانة نحو الكلي في أوفج. بالمقارنة مع أوفجو، الأجنة قبل الولادة مع فور لا واضح إظهار الكلي منتفخة هيدرونيفروتيك أو هيدروريتير الشديد النمط الظاهري9.
في مختبر الماوس، يمكن دراسة تدفق البول بحقن صبغة، مثل الميثيلين الأزرق، في الحوض الكلوي9. الحل إينجيكتيدميثيليني الأزرق وسوف تتبع مسار البول من الحوض الكلوي عن طريق الحالب والمثانة. Hydronephrosis يمكن أن تعترف بزيادة الصبغة في الكلي. ويمكن الكشف عن آبجو كانسداد تدفق الصبغة في الحالب الدانية مع الحوض الكلوي منتفخة5. أي تمدد الحالب المؤشرة قطرها اتسعت يوضح مثال على هيدروريتير. أخيرا، يشير إلى أوفجو مع هيدرونيفروتيك منتفخة الكلي تراكم صبغ في جدار المثانة أو في موقع المسالك التناسلية والمتوسعة7،هيدروميجوريتير10. للكشف عن فور، يتم حقن الحل صبغ في المثانة ورصد تدفق تراجعية لاحقة في الكلي9.
ويرد هنا، بروتوكولا لحقن صبغة أزرق الميثيلين إلى الحوض الكلوي الجنين قبل الولادة. هذا البروتوكول يسمح لتعقب تدفق البول من الحوض الكلوي من خلال الحالب والمثانة والتحقق من المسالك البولية مفرق العراقيل المحتملة مثل آبجو أو أوفجو.

<table width="786">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:295px;height:21px;">Methylene blue</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">M9140</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:295px;height:42px;">Quality Biological Inc. NORMAL SALINE - 500ML</td>
			<td style="width:197px;">Fisherscientific</td>
			<td>50-983-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:295px;height:42px;">3 mL disposable syringe with BD Luer-Lok tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:295px;height:42px;">Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane</td>
			<td style="width:197px;">Pall corporation</td>
			<td style="width:127px;">4614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:295px;height:42px;">Exel Scalp Vein (Butterfly) Sets; 27G x 3/4&#34; 12&#34;&#160;</td>
			<td>EXELINT</td>
			<td style="width:127px;">26709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Delicate Operating Scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co.</td>
			<td>RS-6702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:295px;height:21px;">Micro Dissecting Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co.</td>
			<td>RS-5135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:295px;height:21px;">Dumont Tweezers; Pattern #5</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co.</td>
			<td>RS-5045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:295px;height:21px;">BD PrecisionGlide Needles 30 G x 1/2&#34;</td>
			<td style="width:197px;">BD</td>
			<td style="width:127px;">305106</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing urinary tract junction obstruction defects by methylene blue dye injection

المسالك البولية مفرق عرقلة العيوب هي التشوهات الخلقية حمل هيدرونيفروسيس وهيدروريتير. يمكن تقييم المسالك البولية موريني مفرق عرقلة العيوب من خلال تتبع تدفق صبغة أزرق الميثيلين داخل الجهاز البولي. يتم حقن صبغة أزرق الميثيلين في الحوض الكلوي للكلى الجنينية قبل الولادة، ورصد تدفق صبغ من الحوض الكلوي الكلي عن طريق الحالب وفي التجويف المثانة بعد الضغط الهيدروستاتي. تراكم صبغ سيكون واضحا في التجويف المثانة المسالك البولية الفترة المحيطة بالولادة الطبيعية، ولكن ستكون مقيدة بين الحوض الكلوي ونقطة نهاية الحالب غير طبيعي، في حالة حدوث عوائق المسالك البولية. ويسهل هذا الأسلوب تأكيدا للمسالك البولية مفرق العراقيل والتصور هيدرونيفروسيس وهيدروريتير. ويصف هذه المخطوطة بروتوكول لحقن صبغة أزرق الميثيلين في الحوض الكلوي لتأكيد العراقيل مفرق المسالك البولية.

تقع الظهرية لمعظم الأعضاء الداخلية مثل الكبد والأمعاء والكلى والجهاز البولي السفلي. بعد إزالة هذه الأجهزة الداخلية الأخرى، هي زوج من الكلي والحالب ومثانة مفردة مرئية (الشكل 1A). عند تشريح ناجحة، سوف يتدفق صبغ حقن الحوض الكلوي من الكلي إلى المثانة عن طريق ا...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Urinary Tract Junction Obstruction Defects by Methylene Blue Dye Injection at JoVE.com

Assessing Urinary Tract Junction Obstruction Defects by Methylene Blue Dye Injection

حقن صبغة أزرق الميثيلين في الحوض الكلوي يسهل تقييم المسالك البولية مفرق عرقلة العيوب أثناء تطوير المسالك البولية الجنينية الماوس. ويرد هنا، بروتوكولا لحقن صبغة أزرق الميثيلين في الحوض الكلوي.

تقييم العيوب عرقلة مفرق المسالك البولية عن طريق حقن صبغة أزرق الميثيلين

Urinary tract junction obstruction defects are congenital anomalies inducing hydronephrosis and hydroureter. Murine urinary tract junction obstruction ...

assessing-urinary-tract-junction-obstruction-defects-methylene-blue

Research

JoVE Journal

Biology

15.5K Views.  National Institutes of Health. حقن صبغة أزرق الميثيلين في الحوض الكلوي يسهل تقييم المسالك البولية مفرق عرقلة العيوب أثناء تطوير المسالك البولية الجنينية الماوس. ويرد هنا، بروتوكولا لحقن صبغة أزرق الميثيلين في الحوض الكلوي.

Video: Assessing Urinary Tract Junction Obstruction Defects by Methylene Blue Dye Injection

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale. This complex process requires the coordinated activity of many pre- and post-synaptic proteins to ensure appropriate synaptic connectivity, conduction of electrical signals, targeting and priming of secretory vesicles, calcium sensing, vesicle fusion, localization and function of postsynaptic receptors and finally, recycling mechanisms. As neuroscientists it is our goal to elucidate which proteins function in each of these steps and understand their mechanisms of action. Electrophysiological recordings from synapses provide a quantifiable read out of the underlying electrical events that occur during synaptic transmission. By combining this technique with the powerful array of molecular and genetic tools available to manipulate synaptic proteins in C. elegans, we can analyze the resulting functional changes in synaptic transmission. 
The C. elegans NMJs formed between motor neurons and body wall muscles control locomotion, therefore, mutants with uncoordinated locomotory phenotypes (known as unc s) often perturb synaptic transmission at these synapses 1. Since unc mutants are maintained on a rich supply of a bacterial food source, they remain viable as long as they retain some pharyngeal pumping ability to ingest food. This, together with the fact that C. elegans exist as hermaphrodites, allows them to pass on mutant progeny without the need for elaborate mating behaviors. These attributes, coupled with our recent ability to record from the worms NMJs 2,3,7 make this an excellent model organism in which to address precisely how unc mutants impact neurotransmission. 
The dissection method involves immobilizing adult worms using a cyanoacrylic glue in order to make an incision in the worm cuticle exposing the NMJs. Since C. elegans adults are only 1 mm in length the dissection is performed with the use of a dissecting microscope and requires excellent hand-eye coordination. NMJ recordings are made by whole-cell voltage clamping individual body wall muscle cells and neurotransmitter release can be evoked using a variety of stimulation protocols including electrical stimulation, light-activated channel-rhodopsin-mediated depolarization 4 and hyperosmotic saline, all of which will be briefly described.

Application of electrophysiology to accessible synapses provides a quantifiable measure of synaptic activity, useful in analyzing synaptic mutants. This article describes a dissection method used to expose the neuromuscular junctions (NMJ) of Caenorhabditis elegans (C. elegans) and briefly discusses some of the uses to which this preparation can be applied.

تشريح والتسجيل من مفرق العضلية جيم ايليجانس

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

Zebrafish Brain Ventricle Injection

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved cavities within the brain that are filled with cerebrospinal fluid.  In zebrafish, after neural tube formation, the neuroepithelium undergoes a series of constrictions and folds while it fills with fluid resulting in brain ventricle formation.  In order to understand the process of ventricle formation, and the neuroepithelial shape changes that occur at the same time, we needed a way to visualize the ventricle space in comparison to the brain tissue.  However, the nature of transparent zebrafish embryos makes it difficult to differentiate the tissue from the ventricle space.  Therefore, we developed a brain ventricle injection technique where the ventricle space is filled with a fluorescent dye and imaged by brightfield and fluorescent microscopy.  The brightfield and the fluorescent images are then processed and superimposed in Photoshop.  This technique allows for visualization of the ventricle space with the fluorescent dye, in comparison to the shape of the neuroepithelium in the brightfield image.  Brain ventricle injection in zebrafish can be employed from 18 hours post fertilization through early larval stages.  We have used this technique extensively in our studies of brain ventricle formation and morphogenesis as well as in characterizing brain morphogenesis mutants (1-3).

After neural tube formation, the neuroepithelium constricts and folds while the tube fills with embryonic cerebrospinal fluid (eCSF) to form the embryonic brain ventricles. We developed this ventricle injection technique to better visualize the fluid filled space in contrast to the neuroepithelial shape in a live embryo.

الزرد حقن الدماغ البطين

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved ...

Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and functional tissue. Matrix associated stem cell implants (MASI) aim to regenerate cartilage defects due to arthritic or traumatic joint injuries. Adult mesenchymal stem cells (MSCs) have the ability to differentiate into cells of the chondrogenic lineage and have shown promising results for cell-based articular cartilage repair technologies. Autologous MSCs can be isolated from a variety of tissues, can be expanded in cell cultures without losing their differentiation potential, and have demonstrated chondrogenic differentiation in vitro and in vivo1, 2.
In order to provide local retention and viability of transplanted MSCs in cartilage defects, a scaffold is needed, which also supports subsequent differentiation and proliferation. The architecture of the scaffold guides tissue formation and permits the extracellular matrix, produced by the stem cells, to expand. Previous investigations have shown that a 2% agarose scaffold may support the development of stable hyaline cartilage and does not induce immune responses3.
Long term retention of transplanted stem cells in MASI is critical for cartilage regeneration. Labeling of MSCs with iron oxide nanoparticles allows for long-term in vivo tracking with non-invasive MR imaging techniques4.
This presentation will demonstrate techniques for labeling MSCs with iron oxide nanoparticles, the generation of cell-agarose constructs and implantation of these constructs into cartilage defects. The labeled constructs can be tracked non-invasively with MR-Imaging.

Goal of the presentation is to demonstrate a highly reproducible method to generate matrix associated stem cell implants in cartilage defects, which can be visualized with MR imaging. Stem cells are labeled with FDA-approved Ferumoxides, mixed with agarose, implanted into cartilage defects and imaged with a 7T MR scanner.

غرس Ferumoxides إعتبر الإنسان الخلايا الجذعية الوسيطة في عيوب الغضروف

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements and tools for genetic manipulation have become available in Drosophila 2. Soon after the initial discovery by Frie and Mello 3 that double stranded RNA can be used to knockdown the activity of individual genes in Caenorhabditis elegans, RNA interference (RNAi) was shown to provide a powerful reverse genetic approach to analyze gene functions in Drosophila organ development 4, 5.
Many organs, including lung, kidney, liver, and vascular system, are composed of branched tubular networks that transport vital fluids or gases 6, 7. The analysis of Drosophila tracheal formation provides an excellent model system to study the morphogenesis of other tubular organs 8. The Berkeley Drosophila genome project has revealed hundreds of genes that are expressed in the tracheal system. To study the molecular and cellular mechanism of tube formation, the challenge is to understand the roles of these genes in tracheal development. Here, we described a detailed method of dsRNA injection into Drosophila embryo to knockdown individual gene expression. We successfully knocked down endogenous dysfusion(dys) gene expression by dsRNA injection. Dys is a bHLH-PAS protein expressed in tracheal fusion cells, and it is required for tracheal branch fusion 9, 10. dys-RNAi completely eliminated dys expression and resulted in tracheal fusion defect. This relatively simple method provides a tool to identify genes requried for tissure and organ development in Drosophila.

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNA interference has been proven very effective to analyze gene function in Drosophila tracheal development. A detailed protocol used by Jiang lab to inject dsRNA into fly embryos to knockdown gene expression is illustrated. This technique has the potential for screening genes required for tissue and organ development in Drosophila.

رني التدخل عن طريق الحقن في الرنا المزدوج الجديلة ذبابة الفاكهة الأجنة

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular dystrophies1-3, congenital myopathies4,5, and disruptions in sarcomeric assembly6,7, due to high genomic and structural conservation with mammals8. Muscular disorganization and locomotive impairment can be quickly assessed in the zebrafish over the first few days post-fertilization. Two assays to help characterize skeletal muscle defects in zebrafish are birefringence (structural) and touch-evoked escape response (behavioral).
Birefringence is a physical property in which light is rotated as it passes through ordered matter, such as the pseudo-crystalline array of muscle sarcomeres9. It is a simple, noninvasive approach to assess muscle integrity in translucent zebrafish larvae early in development. Wild-type zebrafish with highly organized skeletal muscle appear very bright amidst a dark background when visualized between two polarized light filters, whereas muscle mutants have birefringence patterns specific to the primary muscular disorder they model. Zebrafish modeling muscular dystrophies, diseases characterized by myofiber degeneration followed by repeated rounds of regeneration, exhibit degenerative dark patches in skeletal muscle under polarized light. Nondystrophic myopathies are not associated with necrosis or regenerative changes, but result in disorganized myofibers and skeletal muscle weakness. Myopathic zebrafish typically show an overall reduction in birefringence, reflecting the disorganization of sarcomeres.
The touch-evoked escape assay involves observing an embryo&#39;s swimming behavior in response to tactile stimulation10-12. In comparison to wild-type larvae, mutant larvae frequently display a weak escape contraction, followed by slow swimming or other type of impaired motion that fails to propel the larvae more than a short distance12. The advantage of these assays is that disease progression in the same fish type can be monitored in vivo for several days, and that large numbers of fish can be analyzed in a short time relative to higher vertebrates.

The zebrafish is now an established and powerful tool for modeling muscular dystrophies, congenital myopathies, and related neuromuscular diseases. Birefringence and touch-evoked escape behavior are two common noninvasive assays used to determine the degree of muscular disorganization and locomotive impairment of zebrafish embryos during early development.

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

برازي تحليل جلايكورتيكود: رصد الغدة الكظرية غير الغازية في الخيليات

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

A Mouse Model of Intestinal Partial Obstruction

Intestinal obstructions, that impede or block peristaltic movement, can be caused by abdominal adhesions and most gastrointestinal (GI) diseases including tumorous growths. However, the cellular remodeling mechanisms involved in, and caused by, intestinal obstructions are poorly understood. Several animal models of intestinal obstructions have been developed, but the mouse model is the most cost/time effective. The mouse model uses the surgical implantation of an intestinal partial obstruction (PO) that has a high mortality rate if it is not performed correctly. In addition, mice receiving PO surgery fail to develop hypertrophy if an appropriate blockade is not used or not properly placed. Here, we describe a detailed protocol for PO surgery which produces reliable and reproducible intestinal obstructions with a very low mortality rate. This protocol utilizes a surgically placed silicone ring that surrounds the ileum which partially blocks digestive movement in the small intestine. The partial blockage makes the intestine become dilated due to the halt of digestive movement. The dilation of the intestine induces smooth muscle hypertrophy on the oral side of the ring that progressively develops over 2 weeks until it causes death. The surgical PO mouse model offers an in vivo model of hypertrophic intestinal tissue useful for studying pathological changes of intestinal cells including smooth muscle cells (SMC), interstitial cells of Cajal (ICC), PDGFR&#945;+, and neuronal cells during the development of intestinal obstruction.

Intestinal obstructions are a partial or complete blockage of the intestine that can cause severe abdominal pain, nausea, vomiting, and preventing the passage of stool. This procedure for creating intestinal partial obsructions in mice is reliable in studying the mechanisms underlying pathological cell growth and death in the intestine.

نموذج الفأر من انسداد الأمعاء الجزئي

Intestinal obstructions, that impede or block peristaltic movement, can be caused by abdominal adhesions and most gastrointestinal (GI) diseases including ...

An Iodide-Yellow Fluorescent Protein-Gap Junction-Intercellular Communication Assay

Gap junctions (GJs) are cell membrane channels that allow diffusion of molecules smaller than 1 kDa between adjacent cells. As they have physiological and pathological roles, there is need of high-throughput screening (HTS) assays to identify GJ modulators in drug discovery and toxicology assays. A novel iodide-yellow fluorescent protein-gap junction-intercellular communication (I-YFP-GJIC) assay fulfills this need. It is a cell-based assay including acceptor and donor cells that are engineered to stably express a yellow fluorescent protein (YFP) variant, whose fluorescence is sensitively quenched by iodide, or SLC26A4, an iodide transporter, respectively. When iodide is added to a mixed culture of the two cell types, they enter the donor cells via the SLC26A4 transporter and diffuse to the adjacent acceptor cells via GJs where they quench the YFP fluorescence. YFP fluorescence is measured well by well in a kinetic mode. The YFP quenching rate reflects GJ activity. The assay is reliable and rapid enough to be used for HTS. The protocol for the I-YFP-GJIC assay using the LN215 cells, human glioma cells, is described.

Here, we present a protocol for a novel gap junction intercellular communication assay designed for the high-throughput screening of gap junction-modulating chemicals for drug discovery and toxicological assessment.

مقايسة اتصالات بين الخلايا مفرق الأصفر يوديد فلورسنت بروتين-الفجوة

Gap junctions (GJs) are cell membrane channels that allow diffusion of molecules smaller than 1 kDa between adjacent cells. As they have physiological and ...

Ex Vivo Method for Assessing the Mouse Reproductive Tract Spontaneous Motility and a MATLAB-based Uterus Motion Tracking Algorithm for Data Analysis

Dysmenorrhea, or painful cramping, is the most common symptom associated with menses in females and its severity can hinder women&#39;s everyday lives. Here, we present an easy and inexpensive method that would be instrumental for testing new drugs decreasing uterine contractility. This method utilizes the unique ability of the entire mouse reproductive tract to exhibit spontaneous motility when maintained ex vivo in a Petri dish containing oxygenated Krebs buffer. This spontaneous motility resembles the wave-like myometrial activity of the human uterus, referred to as endometrial waves. To demonstrate the effectiveness of the method, we employed a well-known uterine relaxant drug, epinephrine. We demonstrate that the spontaneous motility of the entire mouse reproductive tract can be quickly and reversibly inhibited by 1 &#181;M epinephrine in this Petri dish model. Documenting the changes of uterine motility can be easily done using an ordinary smart phone or a sophisticated digital camera. We developed a MATLAB-based algorithm allowing motion tracking to quantify spontaneous uterine motility changes by measuring the rate of uterine horn movements. A major advantage of this ex vivo approach is that the reproductive tract remains intact throughout the entire experiment, preserving all intrinsic intrauterine cellular interactions. The major limitation of this approach is that up to 10-20% of uteri may exhibit no spontaneous motility. Thus far, this is the first quantitative ex vivo method for assessing spontaneous uterine motility in a Petri dish model.

Uterine contractions are important for the well-being of females. However, pathologically increased contractility may result in dysmenorrhea, especially in younger females. Here, we describe a simple ex vivo preparation allowing quick assessment of the efficacy of smooth muscle relaxants that may be used for treating dysmenorrhea.

طريقة فيفو السابقة لتقييم الحركة التلقائية للجهاز التناسلي للماوس وخوارزمية تتبع حركة الرحم المستندة إلى MATLAB لتحليل البيانات

Dysmenorrhea, or painful cramping, is the most common symptom associated with menses in females and its severity can hinder women&#39;s everyday lives. ...