المؤلف يود أن يشكر مجلس البحوث السويدية (349-2007-8680) للتمويل و Dalsjöfors Kött AB (Dalsjöfors، السويد) للتبرع بالغدد الكظرية الأبقار.

<ol>
	<li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry.">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).</li><li>Dunevall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+Catecholamine+Content+of+Single+Mammalian+Vesicles+by+Collision-Adsorption+Events+at+an+Electrode.">Characterizing the Catecholamine Content of Single Mammalian Vesicles by Collision-Adsorption Events at an Electrode.</a> J Am Chem Soc. 137 (13), 4344-4346 (2015).</li><li>Crivellato, E., Nico, B., Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromaffin+vesicle:+advances+in+understanding+the+composition+of+a+versatile,+multifunctional+secretory+organelle.">The chromaffin vesicle: advances in understanding the composition of a versatile, multifunctional secretory organelle.</a> Anat Rec. 291 (12), 1587-1602 (2008).</li><li>Morris, S., Schultens, H., Schober, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+osmometer+model+for+changes+in+the+buoyant+density+of+chromaffin+granules.">An osmometer model for changes in the buoyant density of chromaffin granules.</a> Biophys J. 20 (1), 33 (1977).</li><li>Winkler, H., Smith, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromaffin+granule+and+the+storage+of+catecholamines.">The chromaffin granule and the storage of catecholamines.</a> Handbook of Physiology. 6 (7), 321-399 (1975).</li><li>Phillips, J., Allison, Y., Morris, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+calcium,+magnesium,+copper+and+iron+in+the+bovine+adrenal+medulla.">The distribution of calcium, magnesium, copper and iron in the bovine adrenal medulla.</a> Neurosci. 2 (1), 147-152 (1977).</li><li>Est&#233;vez-Herrera, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP:+The+crucial+component+of+secretory+vesicles.">ATP: The crucial component of secretory vesicles.</a> Proc Natl Acad Sci. 113 (28), 4098-4106 (2016).</li><li>Machado, J. D., Camacho, M., Alvarez, J., Borges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+role+of+intravesicular+calcium+in+the+motion+and+exocytosis+of+secretory+organelles.">On the role of intravesicular calcium in the motion and exocytosis of secretory organelles.</a> Commun integr biol. 2 (2), 71-73 (2009).</li><li>Toll, L., Howard, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Mg2++ion-activated+ATPase+and+a+pH+gradient+in+the+storage+of+catecholamines+in+synaptic+vesicles.">Role of Mg2+ ion-activated ATPase and a pH gradient in the storage of catecholamines in synaptic vesicles.</a> Biochemistry. 17 (13), 2517-2523 (1978).</li><li>Terland, O., Flatmark, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbate+as+a+natural+constituent+of+chromaffin+granules+from+the+bovine+adrenal+medulla.">Ascorbate as a natural constituent of chromaffin granules from the bovine adrenal medulla.</a> FEBS letters. 59 (1), 52-56 (1975).</li><li>Camacho, M., Machado, J. D., Montesinos, M. S., Criado, M., Borges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intragranular+pH+rapidly+modulates+exocytosis+in+adrenal+chromaffin+cells.">Intragranular pH rapidly modulates exocytosis in adrenal chromaffin cells.</a> J Neurochem. 96 (2), 324-334 (2006).</li><li>Jankowski, J. A., Schroeder, T. J., Ciolkowski, E. L., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+characteristics+of+quantal+secretion+of+catecholamines+from+adrenal+medullary+cells.">Temporal characteristics of quantal secretion of catecholamines from adrenal medullary cells.</a> J Biol Chem. 268 (20), 14694-14700 (1993).</li><li>Daniels, A., Williams, R., Wright, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+character+of+the+stored+molecules+in+chromaffin+granules+of+the+adrenal+medulla:+a+nuclear+magnetic+resonance+study.">The character of the stored molecules in chromaffin granules of the adrenal medulla: a nuclear magnetic resonance study.</a> Neurosci. 3 (6), 573-585 (1978).</li><li>Borges, R., Travis, E. R., Hochstetler, S. E., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+external+osmotic+pressure+on+vesicular+secretion+from+bovine+adrenal+medullary+cells.">Effects of external osmotic pressure on vesicular secretion from bovine adrenal medullary cells.</a> J Biol Chem. 272 (13), 8325-8331 (1997).</li><li>Troyer, K. P., Mundorf, M. L., Fries, H. E., Wightman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+vesicle+fusion+and+exocytosis+in+hypertonic+conditions.">Separating vesicle fusion and exocytosis in hypertonic conditions.</a> Ann NY Acad Sci. 971 (1), 251-253 (2002).</li><li>Brodwick, M. S., Curran, M., Edwards, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+osmotic+stress+on+mast+cell+vesicles+of+the+beige+mouse.">Effects of osmotic stress on mast cell vesicles of the beige mouse.</a> J Membrane Biol. 126 (2), 159-169 (1992).</li><li>Amatore, C., Arbault, S., Bonifas, I., Lemaitre, F., Verchier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+exocytosis+under+hypotonic+conditions+shows+two+distinct+populations+of+dense+core+vesicles+in+bovine+chromaffin+cells.">Vesicular exocytosis under hypotonic conditions shows two distinct populations of dense core vesicles in bovine chromaffin cells.</a> Chem Phys Chem. 8 (4), 578-585 (2007).</li><li>Hampton, R. Y., Holz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+changes+in+osmolality+on+the+stability+and+function+of+cultured+chromaffin+cells+and+the+possible+role+of+osmotic+forces+in+exocytosis.">Effects of changes in osmolality on the stability and function of cultured chromaffin cells and the possible role of osmotic forces in exocytosis.</a> J Cell Biol. 96 (4), 1082-1088 (1983).</li><li>Troyer, K. P., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+separation+of+vesicle+release+from+vesicle+fusion+during+exocytosis.">Temporal separation of vesicle release from vesicle fusion during exocytosis.</a> J Biol Chem. 277 (32), 29101-29107 (2002).</li><li>Pihel, K., Travis, E. R., Borges, R., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytotic+release+from+individual+granules+exhibits+similar+properties+at+mast+and+chromaffin+cells.">Exocytotic release from individual granules exhibits similar properties at mast and chromaffin cells.</a> Biophys J. 71 (3), 1633 (1996).</li><li>Jankowski, J. A., Finnegan, J. M., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ionic+composition+alters+kinetics+of+vesicular+release+of+catecholamines+and+quantal+size+during+exocytosis+at+adrenal+medullary+cells.">Extracellular ionic composition alters kinetics of vesicular release of catecholamines and quantal size during exocytosis at adrenal medullary cells.</a> J Neurochem. 63 (5), 1739-1747 (1994).</li><li>Leszczyszyn, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+receptor-mediated+catecholamine+secretion+from+individual+chromaffin+cells.+Chemical+evidence+for+exocytosis.">Nicotinic receptor-mediated catecholamine secretion from individual chromaffin cells. Chemical evidence for exocytosis.</a> J Biol Chem. 265 (25), 14736-14737 (1990).</li><li>Wightman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+resolved+catecholamine+spikes+correspond+to+single+vesicle+release+from+individual+chromaffin+cells.">Temporally resolved catecholamine spikes correspond to single vesicle release from individual chromaffin cells.</a> P Natl Acad Sci. 88 (23), 10754-10758 (1991).</li><li>Fathali, H., Dunevall, J., Majdi, S., Cans, A. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+osmotic+stress+reduces+the+vesicle+size+while+keeping+a+constant+neurotransmitter+concentration.">Extracellular osmotic stress reduces the vesicle size while keeping a constant neurotransmitter concentration.</a> ACS Chemical Neuroscience. , (2017).</li><li>Bath, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsecond+adsorption+and+desorption+of+dopamine+at+carbon-fiber+microelectrodes.">Subsecond adsorption and desorption of dopamine at carbon-fiber microelectrodes.</a> Anal Chem. 72 (24), 5994-6002 (2000).</li><li>Li, X., Majdi, S., Dunevall, J., Fathali, H., Ewing, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Measurement+of+Transmitters+in+Individual+Vesicles+in+the+Cytoplasm+of+Single+Cells+with+Nanotip+Electrodes.">Quantitative Measurement of Transmitters in Individual Vesicles in the Cytoplasm of Single Cells with Nanotip Electrodes.</a> Angew Chem Int Edit. 54 (41), 11978-11982 (2015).</li><li>Zoski, C. G., Mirkin, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+limiting+currents+at+finite+conical+microelectrodes.">Steady-state limiting currents at finite conical microelectrodes.</a> Anal Chem. 74 (9), 1986-1992 (2002).</li><li>Mosharov, E. V., Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+exocytotic+events+recorded+by+amperometry.">Analysis of exocytotic events recorded by amperometry.</a> Nat Methods. 2 (9), 651-658 (2005).</li><li>Morris, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+formaldehyde+glutaraldehyde+fixative+of+high+osmolality+for+use+in+electron+microscopy.">A formaldehyde glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy.</a> J Cell Biol. 27, 137-139 (1965).</li><li>Parsons, T. D., Coorssen, J., Horstmann, H., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Docked+granules,+the+exocytic+burst,+and+the+need+for+ATP+hydrolysis+in+endocrine+cells.">Docked granules, the exocytic burst, and the need for ATP hydrolysis in endocrine cells.</a> Neuron. 15 (5), 1085-1096 (1995).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

نقدم هنا بروتوكولا ومزايا الجمع بين ثلاثة أساليب تحليلية تكميلية لتحليل الحويصلات الافرازية وعملية الرقابة للحصول على فهم أفضل لكيف يمكن أن يؤثر على قوة مادية مثل الضغط التناضحي الحويصلات الافرازية وفي عملية الرقابة في الخلايا الافرازية. وتشمل هذه الأساليب أمبيروميتري ميكروليكترودي ألياف الكربون، وهي طريقة ثابتة لتسجيل نشاط الرقابة، الخلوي داخل الخلايا الكهروكيميائية، الذي يستخدم لتحديد حجم كانتال من حويصلات في بيئتها الأصلية، و نقل تحليل الصور الميكروسكوب الإلكتروني لرصد حجم حويصلة افرازية. في هذا العمل، بجمع البيانات الكمية من تسجيلات أمبيروميتري حويصلة واحدة الرقابة الأحداث في الخلايا تشرومافين يتعرضون متساوي التوتر وبيئة خارج الخلية مكثف، أكدنا أن صدمة ناضح يقلل بشكل ملحوظ الإفراج عن مبلغ العصبية خلال الرقابة وأن هذه الخلايا يمكن استرداد عكسية والإفراج عن الكمية الأصلية، إذا وضعت مرة أخرى في بيئة متساوي التوتر (الشكل 3).
تسجيلات أمبيروميتريك معلومات من تواتر الأحداث الرقابة مقابل الوقت وذلك يمكن أيضا استخدامها لرصد التغيرات في نشاط الرقابة على الخلايا في مختلف البيئات ناضح. يمكن تفسير هذه البيانات واستخدامها لتبين ما إذا كانت التعديلات في نشاط يحدث على الفور أو كدالة للزمن. وكما أظهرنا في الأعمال السابقة، على الرغم من أن الإجهاد ناضح يعرقل النشاط اكسوسيتوتيك، فإنه لا يبدو تعوق الانصهار تجمع سهولة يمكن نشرة من حويصلات24. يمكن أيضا استخدام بيانات نشاط الرقابة لتحليل إجمالي نشاط اكسوسيتوتيك خلال فترة التسجيل. نقدم هنا تراكم عدد الأحداث الرقابة من تسجيل 3 دقائق للرقابة في خلايا تشرومافين التي تتعرض لظروف ناضح مختلفة اثنين. وتشير هذه البيانات تثبيط نشاط الرقابة من الخلايا التي تعاني من الإجهاد ناضح وأنه يمكن تحقيق انتعاش جزئي لهذا النشاط بعد الخلايا العودة إلى بيئة متساوي التوتر خارج الخلية. لكن الأهم من ذلك، أظهرت تجارب التحكم أن با2 + التحفيز متعددة داخل الإطار الزمني المستخدمة في هذه التجارب الناجمة عن انخفاض كبير في نشاط الرقابة وقت كل خلية وحفز لإفراز. الثالثة على التوالي با2 + التحفيز، سوى ثلث نشاط الرقابة وأبقى على، ومن الواضح الباريوم، وربما أيضا توقيت التحفيز في هذه التجارب، كان يؤثر على دورة حويصلة. وهذا قد يكون مناسباً لشرح لماذا تم استرداد النشاط اكسوسيتوتيك في الخلايا التي توضع في محلول متساوي التوتر بعد الصدمة ناضح وماذا عرض هذه الخلايا تخفيض نسبي مماثل في النشاط مقارنة مع الخلايا في ظروف متساوي التوتر بعد ثلاثة با المتسلسلة2 + التحفيز. ومن ثم تسجيل أمبيروميتري للرقابة ويقدم معلومات عن الحويصلات الافرازية من لحظة الحويصلات يتم تشغيلها للصمامات مع غشاء البلازما، الإفراج عن أجهزة الإرسال العصبية من خلال المسام الانصهار. وبالتالي الإفراج عن البيانات الكمية في العصبي حويصلة واحدة ويمكن أن تجمع المعلومات عن نشاط الرقابة.
يمكن أن تنظم كمية العصبي صدر بطريقة الرقابة التي يتم تشغيلها، حيث يتم تحرير محتوى حويصلة كامل أو جزء من المحتوى. بحسب دراسة الإفراج عن الرقابة باستخدام أمبيروميتري ألياف الكربون التي تكشف فقط ما هو طرد من حويصلة، من الصعب التمييز إذا كان تغيير في الكشف عن مقدار العصبي صدر مرتبط بتغيير في وضع المشغلة من الرقابة، تغيير في الخصائص الفيزيائية الحيوية الخلوية التي تؤثر على الإفراج عن المحتوى حويصلة، أو للتغيرات في حجم حويصلة كانتال. ولذلك، باستكمال تسجيل أمبيروميتريك للرقابة مع قياسات تستخدم في الخلوي داخل الخلايا الكهروكيميائية، قياسات في الموقع لحجم كانتال حويصلة في الخلايا الحية يمكن تتميز ومن ثم استخدامه لمقارنة جزء من حويصلة الإفراج عن المحتوى من الحويصلات خلال الرقابة26.
في هذا العمل، للتحقيق إذا كان حجم حويصلة كانتال تتأثر الإجهاد ناضح، قمنا بتطبيق هذا الأسلوب لتقدير وتقييم حجم كانتال حويصلة في الخلايا التي تتعرض لظروف متساوي التوتر ومكثف. ويعتبر إدخال مسرى نانوتيب في السيتوبلازم من خلية حية الغازية بدلاً من ذلك، هذه التجارب أجريت مرة واحدة فقط كل خلية وقد لا تتكرر في نفس الخلية. ولذلك، تجري هذه التجارب تفضيلي كقياسات فردية من مجموعات من الخلايا المحددة عشوائياً تتعرض لبيئة خارج الخلية مكثف ومتساوي التوتر. لمقارنة التغيرات في حويصلة quantal الحجم مقاسا بالخلوي داخل الخلايا الكهروكيميائية للتعديلات في ناقل عصبي المبلغ صدر في الرقابة، ينبغي النظر مطابقة الشروط التجريبية لتسجيل داخل الخلايا و أيضا القيام بتسجيل أمبيروميتري للرقابة في خلايا عشوائية منفصلة. إذا كانت الدراسات تجري على نفس خلية واحدة، فمن المهم في هذه البروتوكولات التجريبية أيضا النظر في تأثير التحفيز2 BaCl على التوالي، وضمان الشروط التجريبية التي تطابق تلك المستخدمة للخلوي داخل الخلية القياسات. كما تجدر الإشارة إلى أنه من الصعب التحكم في الموضع الدقيق وعمق القطب عندما يتم إدراجها في خلية. وبالتالي، توفر كل خلية عينة عشوائية لتحليل حجم كانتال حويصلة. وباﻹضافة إلى ذلك، يحقق حجم حويصلة كانتال باستخدام هذا الأسلوب لا يميز الفروق في، على سبيل المثال، حويصلة النضج وذلك أيضا قد إضافة التباين للقياسات. وأظهرت التجارب داخل الخلايا أن تم تخفيض حجم quantal حويصلة في الخلايا التي تتعرض للضغط الاسموزي خارج الخلية. تمت مقارنة التخفيض النسبي في حجم قوانتال الكشف عنها بواسطة هذا الأسلوب على الملاحظات للتغيرات النسبية في الإفراج عن ناقل عصبي خلال الرقابة. وجدت هذه الدراسة أن الانخفاض النسبي في حجم كانتال في نفس الترتيب كانخفاض الإفراج العصبي في خلايا الاستشعار عن الإجهاد ناضح.
للتحقق من حالة الإجهاد ناضح كان تغيير تركيز العصبي حويصلة، تم تقييم حجم حويصلة استخدام تيم التصوير تحليل للخلايا تشرومافين ثابتة كيميائيا التي تعرضت إلى ظروف متساوي التوتر ومكثف. تيم التصوير التحليل أظهر أن حويصلات يتقلص عندما تتعرض الخلايا لحدوث صدمة ناضح وأن الانخفاض النسبي في حجم يتم ضبط جنبا إلى جنب مع حجم حويصلة كانتال للحفاظ على تركيز عصبي مستمر24. تحليل الصورة تيم، الذي يوفر دقة الصورة نانومتر يمكن التمييز بين المرحلتين، مصفوفة البروتين الأساسية كثيفة والحل الهالة المحيطة بها داخل لدكفس، ومما يجعل من الممكن لتحديد حجم مصفوفة البروتين الأساسية كثيفة و حساب حجم الحل هالو. من هذا التحليل، مصممة على أن تتعلق أساسا إلى تقلص حجم من الحل الهالة المحيطة بمصفوفة البروتين الأساسية كثيفة24انخفاض حجم حويصلة.
وباختصار، يعرض دراسة هذا بروتوكول مما يدل على مدى ثلاثة أساليب تحليلية يتم جنبا إلى جنب، ويسمح توصيف الحويصلات الافرازية قبل ناقل عصبي الإفراج، وما تم إصدارها من هذه الحويصلات عندما يتم تشغيل الخلايا إلى الرقابة، التوصل إلى فهم أفضل للحويصلات الافرازية كيف وخلية وظائف مثل الرقابة ويتأثر بالضغط خارج الخلية. قد تستخدم هذا البروتوكول أيضا للمساعدة في الإجابة على الأسئلة حول كيفية الإفراج عن ناقل عصبي في الرقابة وحجم حويصلة كانتال تتأثر بتغييرات أخرى في البيئة المادية أو بواسطة الأدوية المحتملة التي قد تؤثر على خلايا افرازية.

الخلايا تشرومافين في الغدد الكظرية هي خلايا الغدد الصم العصبية أن الإفراج عن جزيئات الناقل العصبي في مجرى الدم. وهذا يحدث من خلال عملية الخلوية التي تنطوي على الالتحام والانصهار من حويصلات مملوءة بالعصبي، أسفرت عن الإفراج عن المحتوى من الحويصلات إلى الفضاء خارج الخلية في عملية تسمى الرقابة. العصبية (الأدرينالين ونورادرينالين) في الخلايا تشرومافين بنشاط تنقل عن طريق بروتينات الغشاء إلى حويصلات الأساسية كثيفة كبيرة (لدكفس) وتخزينها في تركيزات عالية (~0.5-1 م)1،2. يتم إنجاز تراكم العصبية داخل لدكفس بتقارب جزيئات الكاتيكولامينات إلى مصفوفة البروتين الأساسية كثيفة إينترافيسيكولار تتألف من تشروموجرانين البروتينات (~ 169 ملغ/مل)3،4،5 ،6، وحلا كوكتيل إينترافيسيكولار الذي يحتوي على المكونات الرئيسية لتخزين وتحميل الكاتيكولامينات إلى حويصلة مثل ATP (125-300 مم)7، Ca2 + (50-100 ميكرومتر في الحل ومم ~ 40 ملزمة مصفوفة البروتين)8، Mg2 + (5 ملم)9، اسكوربات (10-30 ملم)10، والرقم الهيدروجيني من ~5.511،12. لدكفس الحفاظ على شرط iso ناضح الخلية السيتوبلازم (310 موسم/كغ)13، على الرغم من أن تركيز ذائبة النظرية داخل الحويصلات مبلغ يصل إلى أكثر من 750 ملم. تكوين المكونات إينترافيسيكولار ليست فقط ضرورية لتحميل وتخزين الكاتيشولامين، ولكن أيضا لتجميع الذوائب لمصفوفة البروتين الأساسية كثيفة. وهذا يقلل كثيرا من الاسموليه الحويصلات انخفض انخفاضا كبيرا، ويمكن أن تؤثر على الكاتيكولامينات المبلغ تم إصداره من خلال الرقابة5،6.
وأفادت الدراسات عن تأثير الضغط الاسموزي خارج الخلية في عملية الرقابة عن طريق تسجيل أمبيروميتريك أن ارتفاع الضغط الاسموزي خارج الخلية يحول دون نشاط الرقابة، ويقلل من العدد من أجهزة الإرسال العصبية ويفرز من واحد حويصلة المقصورات4،،من1415،16،17،،من1819. تكهنت التفسيرات لهذه الملاحظات على تعزيز إمكانية مزاحمة الجزيئات في أحداث الانصهار حويصلة المثبطة الخلية السيتوبلازم، وتغيير في غشاء الخصائص الفيزيائية التي تؤثر على عدد أجهزة الإرسال العصبية صدر خلال الرقابة. هذه الأفكار يفترض أن ارتفاع الضغط التناضحي خارج الخلية لا يؤثر على حجم حويصلة كانتال، الذي يحدد عدد جزيئات العصبي المخزنة في حجرة حويصلة في المرحلة السابقة للرقابة المشغلة14، 15 , 17 , 19 , 20 , 21-في القياسات أمبيروميتريك للإفراج عن الرقابة في الخلايا المفردة، يوضع ميكروليكترودي قرص ألياف الكربون في اتصال وثيق مع سطح الخلية، إنشاء مجموعة تجريبية حتى محاكاة التكوين المشبك، حيث أمبيروميتريك بمثابة القطب22،بوستسينابتيك كاشف (الشكل 1)23. عن طريق تنشيط خلية للرقابة، واحد يمكن أن يستحث حويصلات مملوءة العصبي تلتحم مع غشاء بلازما الخلية والإفراج عن جزء أو محتوى حويصلة كاملة في الفضاء خارج الخلية. يمكن اكتشاف هذه الجزيئات العصبي صدر على سطح القطب اليكتروتشيميكالي العصبية في حالة اليكترواكتيفي (مثلاً، الكاتيشولامين) بتطبيق محتملة الأكسدة + 700 مقابل أم قطب مرجعي Ag/AgCl . ونتيجة لذلك، سلسلة من المسامير الحالية مناسبة الكشف عن أحداث الرقابة الفردية. من الحالي مقابل تتبع الوقت في تسجيل أمبيروميتريك بالمنطقة تحت كل سبايك أمبيروميتريك واحد يمثل المسؤول عن الكشف عن كل حدث الرقابة ويمكن تحويلها إلى الخلد العصبية في إصدارها، باستخدام المعادلة فاراداي. ومن ثم، تسجيلات أمبيروميتريك تقديم معلومات كمية عن العصبية المبلغ طردوا من أحداث الرقابة واحد وتقرير عن تواتر الأحداث الرقابة، لكن لا تقدم معلومات كمية عن الحويصلات الافرازية المحتوى قبل بدأ الإفراج عن الانصهار والعصبي حويصلة.
ولذلك، للحصول على فهم أفضل للحويصلات الافرازية كيف في الخلية السيتوبلازم يستجيب للضغط التناضحي خارج الخلية قبل أن يتم تشغيل الخلية على الخضوع للرقابة، يمكن استخدام أساليب تحليلية تكميلية أخرى لإثراء هذه المعلومات. على سبيل المثال، للتحقيق في حالة الإجهاد ناضح يغير حجم حويصلة، يمكن استخدام مجهر إلكتروني (TEM) التصوير تحليل لقياس حجم حويصلة من الخلايا بعد التثبيت الكيميائي. لفحص حالة الإجهاد ناضح يؤثر حجم حويصلة كانتال، يمكن تطبيق تقنية أمبيروميتريك المتقدمة مؤخرا تسمى الخلوي داخل الخلايا الكهروكيميائية، للتحديد الكمي لمحتوى العصبي حويصلة في الحويصلات الافرازية في هذه الدولة الأصلية عند الذين ما زالوا يقيمون في السيتوبلازم للخلايا الحية26. في تقنية الخلوي داخل الخلايا الكهروكيميائية، يتم إدراج قطب أسطواني ألياف الكربون نانوتيب برفق في السيتوبلازم للخلايا الحية، وعن طريق تطبيق محتملة أم + 700 لهذا القطب (مقابل Ag/AgCl مرجع قطب كهربائي)، محتوى الكاتيكولامينات في حويصلات يمكن قياسها كمياً بالكشف عن طفرة الأكسدة الحالية من حويصلات وحيد الاصطدام، أدسوربينج، ويمزق بعد ذلك ستوتشاستيكالي على سطح القطب وثم الإفراج عن محتوياتها ضد القطب السطحية26. ومن ثم في أمبيروميتريك الحالية مقابل تتبع الوقت، كل حدث rupturing حويصلة واحدة يمكن أن ينتج عابرة الحالية وعن طريق إدماج مجال كل المصطلحات الحالية، يمكن حساب حجم قوانتال حويصلة استخدام القانون Faraday´s.
ولذلك، من خلال ربط المعلومات الكمية المكتسبة من قياسات حجم حويصلة استخدام التصوير تيم جنبا إلى جنب مع تحليل حجم كانتال حويصلة، كما سجلتها الخلوي داخل الخلايا الكهروكيميائية، حويصلة العصبي تركيز يمكن أيضا يجب تحديد. وهذا يسمح توصيف حويصلة عندما تتعرض الخلايا لمختلف الظروف ناضح ويعطي فكرة أفضل عن كيفية حويصلات قد تستجيب للضغط التناضحي خارج الخلية في المرحلة قبل الرقابة. وقد أظهرت النتائج من الجمع بين هذه الأساليب أن حضور الضغط الاسموزي العالي خارج الخلية، حويصلات تقليص وضبط حجمها كانتال، ومقارنة المعلومات الكمية المتعلقة بالتغيرات النسبية من هذه القياسات تبين أن بينما تتقلص، حويصلات ضبط محتوياتها والحجم للحفاظ على تركيز عصبي مستمر24. وهكذا، هذا الفهم القيمة في الاتصال بالملاحظات التي أبديت على إطلاق سراح العصبي في الخلايا التي تتعرض للضغط التناضحي. في هذه البروتوكولات، يصف لنا استخدام هذه ثلاث منهجيات متكاملة تسمح بتوصيف الحويصلات الافرازية كيف في الرد على البيئة الأصلية ل osmolality خارج الخلية وآثار هذا الرد على الرقابة عملية. وبالإضافة إلى ملاحظاتنا السابقة فيما يتعلق بالتأثير ارتفاع الضغط الاسموزي على الرقابة24، نقدم المزيد من التجارب التي تصف خلية الإنعاش بعد صدمة ناضح وتأثير التحفيز الباريوم متعددة في تشرومافين الخلايا.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-2670</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase P</td><td>Roche, Sweden</td><td>11 213 857 001</td><td></td></tr><tr><td>100-&amp;micro;M Nylon mesh</td><td>Fisher Sientific</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1677</td><td></td></tr><tr><td>Collagen IV coated 60 mm plastic dish</td><td>VWR</td><td>354416</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Avanti J-20XP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillary</td><td>Sutter instrument Co., Novato, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Narishing Inc., Japan</td><td>PE-21</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy solutions (A and B)</td><td>Epoxy technology, Billerica, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beveller</td><td>Narishing Inc.</td><td>EG-400</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>Patch clamp Instrument</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td><td>Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Burleigh Instrument Inc., USA</td><td>PCS-5000</td><td></td></tr><tr><td>Butane Flame</td><td>Multiflame AB, H&amp;auml;sselholm, Sweden</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transmission electron microscopy</td><td>Omega</td><td>Leo 912 AB</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoring the effect of osmotic stress on secretory vesicles and exocytosis

تسجيل أمبيروميتري الخلايا تعرض لصدمة ناضح وتبين أن الخلايا الافرازية تستجيب لهذا الإجهاد البدني بالحد من نشاط الرقابة ومقدار العصبي صدر من حويصلات في أحداث الرقابة واحدة. ويقترح أن يرجع الانخفاض في العصبية طرد تغييرات في الخصائص الفيزيائية الغشاء عند تقليص الخلايا في استجابة للضغط ناضح ومع الافتراضات التي لا تتأثر الحويصلات الافرازية في السيتوبلازم الخلية بالضغط التناضحي خارج الخلية. تسجيل أمبيروميتري للرقابة ترصد ما أطلق سراحه من الخلايا في الوقت الحالي حويصلة الصمامات مع غشاء البلازما، ولكن عدم تقديم معلومات عن محتوى حويصلة قبل أن يتم تشغيل الانصهار حويصلة. ولذلك، يوفر التسجيل مع أساليب أخرى تحليلية متكاملة قادرة على وصف الحويصلات الافرازية قبل أن يتم تشغيل الرقابة على الخلايا عن طريق الجمع بين أمبيروميتري نظرة أوسع لدراسة الحويصلات الافرازية كيف تتأثر عملية الرقابة بصدمة ناضح. ونحن هنا تصف كيف يمكن استخدام تكملة أمبيروميتري تسجيل مع الخلوي داخل الخلايا الكهروكيميائية وانتقال الميكروسكوب الإلكتروني (TEM) تصوير لوصف التغييرات في محتوى الحويصلات الافرازية الحجم والعصبي في تشرومافين الخلايا بالنسبة لنشاط الرقابة قبل وبعد التعرض للضغط التناضحي. عن طريق ربط المعلومات الكمية المكتسبة من تجارب باستخدام جميع الأساليب التحليلية الثلاث، قدمت استنتاجات سابقا أن الحويصلات الافرازية تستجيب للضغط التناضحي خارج الخلية بالتقلص في الحجم وتقليل حجم حويصلة كانتال إلى الحفاظ على تركيز عصبي حويصلة مستمر. ومن ثم، وهذا يعطي بعض التوضيحات بشأن لماذا حويصلات، في استجابة للضغط التناضحي، تقليل العصبية المبلغ صدر خلال الإفراج عن الرقابة. تسجيلات أمبيروميتريك هنا تشير إلى هذا هو عملية عكسية وأن حويصلة بعد صدمة ناضح يتم تعبئتها بالعصبية عندما يتم إعادة وضع الخلايا في بيئة متساوي التوتر.

ونحن هنا وصف البروتوكول لكيفية الجمع بين تصوير تيم جنبا إلى جنب مع اثنين من منهجيات الكهروكيميائية، أمبيروميتري ألياف الكربون والخلوي داخل الخلايا الكهروكيميائية، يمكن أن توفر المعلومات التي تكتسب رؤية أوسع نطاقا في إشارة إلى تأثير الضغط الاسموزي خارج الخلية في عملية الرقابة والحويصلات الافرازية. بمقارنة التسجيلات أمبيروميتريك الممثل للإفراج عن الرقابة في الخلايا تشرومافين واحد باستخدام التجريبية إعداد (هو مبين في الشكل رقم 1)، انخفاض كبير في النشاط اكسوسيتوتيك تم عرضها عند تعرض الخلايا إلى ناضح التشديد بالمقارنة مع الخلايا في ظروف متساوي التوتر (الشكل 2A)24. من هذه التسجيلات وباستخدام القانون Faraday´s، المسؤول عن مجموع يكشفها كل أمبيروميتريك الفردية الحالية استخدمت المصطلحات الخاصة لحساب عدد جزيئات طردوا من حويصلة واحدة الرقابة الأحداث في الخلايا التي تتعرض لمختلف ناضح شروط. وعلى سبيل المقارنة، كما يظهر في الشكل 2 بمنطقة أصغر من أمبيروميتريك المتوسط الحالي سبايك الكشف عنها بواسطة الخلايا في حل مكثف، أطلق سراح أقل العصبي جزيئات من كل حويصلة من الخلايا استشعار الضغط التناضحي24 .
لتحديد إمكانية الرجوع لهذا الانخفاض في عدد الجزيئات العصبي صدر، أجرينا التسجيلات أمبيروميتريك للرقابة في الخلايا المعرضة لبيئة مكثف، وفي وقت لاحق، في الخلايا بعد وضع مرة أخرى في متساوي التوتر البيئة. في هذه التجارب، وحفز الخلايا تشرومافين ثلاث مرات متتالية مع BaCl2 الحل: أولاً في مخزن مؤقت متساوي التوتر، تليها حفز ثانية بعد أن كانت المحتضنة الخلايا لمدة 10 دقيقة في حل مكثف، وأخيراً، ثالث التحفيز بعد 10 دقيقة خلية حضانة في ظروف متساوي التوتر. النتائج كما هو معروض في الشكل 3A الحالي تم تقليل كمية العصبية صدر ~ 50% عند تعرض الخلايا للشرط مكثف مقارنة با2 + تنشيط الأولى في حالة متساوي التوتر. بعد ذلك، عند الخلايا كانت العودة إلى بيئة متساوي التوتر وإخضاعها لثالث با2 + التحفيز، كان عكس العصبي المبلغ الإفراج عن كل حدث الرقابة مرة أخرى إلى المبلغ الأصلي لتسجيلها في تحفيز الأولى، التي وأكدت الملاحظات السابقة14. تجارب التحكم مع ثلاثة با2 + التحفيز المتعاقبة من الخلايا في حالة متساوي التوتر (انظر الشكل 3) تبين أن با2 + التحفيز تسلسلية متعددة في ظروف متساوي التوتر لم يغير العصبي المبلغ صدر من خلال الرقابة. وهذا يوحي بأن حويصلة قوانتال يتم بسرعة وبشكل قابل للعكس ضبط حجم مع الاسموليه خارج الخلية.
ومع ذلك، عند تحليل آثار أمبيروميتريك من هذه التجارب فيما يتعلق بأنشطة الرقابة، أصبح من الواضح، كما هو معروض في الشكل 4A، أن نشاط الرقابة أعيقت إلى حد كبير عندما تتعرض الخلايا لضغط مكثف. أثناء الإجهاد ناضح، خفضت الرقابة الأحداث إلى 12 في المائة النشاط في الخلايا في حالة متساوي التوتر. في وقت لاحق، بعد صدمة ناضح وخلايا وضعت مرة أخرى في بيئة إيسوسموتيك، استعاد الخلايا 41% نشاطها الرقابة الأصلي. من المثير للاهتمام، تجري تجارب التحكم في ظروف متساوي التوتر أظهرت، كما هو معروض في الشكل 4 باء، أنه بعد إجراء ثلاثة متتالية التحفيز BaCl2، خفض تواتر الأحداث الرقابة إلى 53% بعد حفز الثانية وكذلك وصولاً إلى 26% بتحفيز الثالثة مقارنة بتحفيز الأولى. ومن ثم، فمن الواضح أن با2 + التحفيز على التوالي لا يبدو أن تؤثر على عدد العصبية في الإفراج عن كل حويصلة عندما يتم تشغيل الرقابة، ولكن هو التأثير إلى حد كبير على كفاءة عملية الإفراج عن حويصلة.
للتحقيق في الحويصلات الافرازية كيف في بيئتها الأصلية تتأثر بالإجهاد ناضح خارج الخلية من حيث حجم حويصلة أو قوانتال الحجم، حويصلة حجم التحليل باستخدام التصوير تيم كان جنبا إلى جنب مع الخلوي داخل الخلايا الكهروكيميائية في الخلايا تتعرض لظروف متساوي التوتر ومكثف. في التجارب داخل الخلايا الكهروكيميائية الخلوي، قطب نانوتيب ألياف الكربون تم إدراجه في السيتوبلازم الخلايا تشرومافين يعيش عند وضعه في محلول متساوي التوتر ومكثف (كما هو موضح في الشكل 5.) وتم رصد المصطلحات الحالية أمبيروميتريك الناتجة من كل حويصلة في السيتوبلازم الخلية الاصطدام، وأدسوربينج، وستوتشاستيكالي يمزق والإفراج عن محتويات حويصلة على سطح القطب أمبيروميتريك عند انفجار26. المسؤول عن مجموع المتكاملة الكشف عن كل ذروة الحالية مقابل تتبع الوقت استخدمت لحساب حجم متوسط حويصلة كانتال في كل خلية التسجيل بموجب القانون Faraday´s. هذه القياسات داخل الخلايا الكهروكيميائية الخلوي، هو موضح في الشكل 6 و الشكل 7B، أظهرت أن حجم كانتال حويصلة في الخلايا المعرضة للإجهاد ناضح خفضت إلى حد كبير مقارنة في الخلايا في ظروف متساوي التوتر. مقارنة حجم التغيير في حويصلة كانتال الحجم مقاسا بالخلوي الكهروكيميائية داخل الخلايا، إلى انخفاض كمية العصبي صدر أثناء الرقابة على الخلايا التي تعاني من الإجهاد ناضح خارج الخلية كسرى ، وأظهرت انخفاض نسبي من 60 في المائة في حجم قوانتال والعصبي المبلغ صدر مقارنة في الخلايا في ظروف متساوي التوتر (الشكل 7)24. تتصل بالتكيف في حويصلة كانتال حجم اختلاف محتملة في تركيز حويصلة العصبي للخلايا التي تعاني من الضغط التناضحي، أجرى تحليل الصورة تيم لتحديد حجم حويصلة الخلايا المعرضة متساوي التوتر ومكثف شروط. وعلاوة على ذلك، استخدمت تلطيخ الظلام مصفوفة البروتين الأساسية كثيفة داخل لدكفس الذي هو تصور في الصور تيم ملزمة مجال مظلمة في الغشاء الحويصلات لقياس حجم المصفوفة الأساسية كثيفة في هذه الحويصلات. كما عرضت في الشكل 8، تم تخفيض حجم حويصلة إلى 60% في الخلايا التي تتعرض للضغط التناضحي خارج الخلية مقارنة في الخلايا في ظروف متساوي التوتر. من حجم القطر يقاس لدكف ولب كثيفة المحسوبة، حجم الحل الهالة المحيطة بها التي تظهر كما حسبت أيضا التوصل إلى حل واضح داخل لدكفس في الصور ال. وأظهرت النتائج الملخصة من تحليل الصورة تيم، كما يظهر في الشكل 8، أنه أثناء الصدمة ناضح خارج الخلية أساسا تخفيض حجم هالة الحل في لدكفس هو24.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56537/56537fig1.jpg"> الشكل 1 : خلية مفردة الرقابة أمبيروميتري- الخلايا تخطيطي لإعداد تجريبية لقياس أمبيروميتريك للرقابة في واحد تشرومافين24. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56537/56537fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56537/56537fig2.jpg"> الشكل 2: آثار أمبيروميتريك من قياسات الرقابة. A (أ) تسجيل أمبيروميتريك ممثل للرقابة في خلايا تشرومافين في متساوي التوتر (اللون الأسود) وفي بيئات خارج الخلية مكثف (اللون الأحمر). (ب) توسيع ارتفاع متوسط أمبيروميتريك من قياس الرقابة من الخلايا تشرومافين في متساوي التوتر (أسود) ومكثف في بيئات خارج الخلية (أحمر)24. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56537/56537fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56537/56537fig3.jpg"> الشكل 3 : عكس عدد من الكاتيشولامين صدر في الرقابة بعد صدمة ناضح. (A) عدد الجزيئات صدر خلال الرقابة من الخلايا تشرومافين (n = 4) بثلاثة متتالية با2 + التحفيز، مع تحفيز أول في متساوي التوتر، والثانية في مكثف، والثالث في المخزن المؤقت متساوي التوتر. يتم إظهار النتائج الإحصائية للاختبار t مزاوج. قيمة p-بمقارنة لأول با2 + التحفيز (با2 + stim 1) في المخزن المؤقت متساوي التوتر مع الثانية با2 + التحفيز (با2 + stim 2) في المخزن المؤقت مكثف p= 0.1088 و فقيمه مقابل مقارنة الثانية با2 + التنشيط في الحل مكثف مع الثالث با2 + التحفيز (با2 + stim 3) في المخزن المؤقت متساوي التوتر هو p = 0.059. (ب) مراقبة التجربة تثبت مقدار الجزيئات العصبي أطلقت با2 + التحفيز على التوالي ثلاث خلايا تشرومافين (n = 4) في المخزن المؤقت متساوي التوتر. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56537/56537fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56537/56537fig4.jpg"> الشكل 4 : تأثير الضغط الاسموزي على نشاط الرقابة. (A) ويرد أثر الاسموليه خارج الخلية على نشاط الرقابة كتواتر الأحداث الرقابة عند تشرومافين الخلايا (n = 4) تحفز بمحلول الباريوم في متساوي التوتر، ثم مكثف، وأخيراً في ظروف متساوي التوتر. يتم عرض القيم كمتوسط عدد المسامير من كل خلية وعينات المتوسط من كافة الخلايا (الخطأ المعياري للوسط (SEM)). ويرد دلالة إحصائية للتغييرات باستخدام اختبار t للبيانات مزاوج (قيمة p-متساوي التوتر با2 + التحفيز 1 ومكثف با2 + التحفيز 2 ف= 0.0126 و فقيمه لمقارنة مكثف با2 + التحفيز 2 ومتساوي التوتر با2 + التحفيز 3 p= 0.037). (ب) مراقبة تجربة تقديم تواتر الأحداث الرقابة بعد ثلاث متتالية الباريوم التحفيز في الخلايا تشرومافين (n = 4) في ظروف متساوي التوتر. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56537/56537fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56537/56537fig5.jpg"> الشكل 5 : الخلوي حويصلة داخل الخلايا الكهروكيميائية لرصد التغيرات في حجم قوانتال حويصلة. (أ) تخطيطي لإعداد المستخدمة للخلوي داخل الخلايا الكهروكيميائية التجريبية. (ب) صورة الميكروسكوب الإلكتروني المسح ضوئي ل القطب ألياف الكربون المخروطية نانوتيب نموذجي24. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56537/56537fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56537/56537fig6.jpg"> الرقم 6 : الخلوي داخل الخلايا الكهروكيميائية قياسات عرض (أ) آثار الممثل لتسجيلات الخلوي أمبيروميتريك داخل الخلايا في الخلايا تشرومافين في متساوي التوتر (أسود) ومكثف في بيئات خارج الخلية (أحمر). (ب) توسيع ارتفاع متوسط أمبيروميتريك من القياس الخلوي داخل الخلية في الخلايا تشرومافين في متساوي التوتر (أسود) ومكثف في بيئات خارج الخلية (أحمر)24. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56537/56537fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56537/56537fig7.jpg"> الشكل 7 : التحديد الكمي لعدد الكاتيشولامين صدر في الرقابة وتحديد حجم حويصلة كانتال- (أ) متوسط عدد جزيئات صدر خلال تسجيلات الرقابة في خلايا تشرومافين في متساوي التوتر (n = 22) ومكثف (n = 20) البيئات. يتم عرض القيم كعدد متوسط من جزيئات الإفراج عن كل حدث الرقابة من كل خلية وبلغ من عينات الخلايا (± SEM). وترد الدلالة الإحصائية للتغييرات باستخدام الاختبار t للبيانات مزاوج (فالقيمه = 0.0003) (ب) متوسط عدد جزيئات كل حويصلة كما الكشف عنها بواسطة الخلوي داخل الخلايا الكهروكيميائية في الخلايا تشرومافين في متساوي التوتر (n = 19) ومكثف (n = 16) الظروف. القيم المقدمة كمتوسط عدد جزيئات كل المصطلحات الخاصة كما يتم الكشف عن كل خلية وبلغ من كافة الخلايا عينات (± SEM). ويرد دلالة إحصائية للتغييرات باستخدام الاختبار t للبيانات مزاوج (p- القيمة = 0.0108)24. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56537/56537fig7large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56537/56537fig8.jpg"> الشكل 8 : تأثير الضغط الاسموزي على حجم حويصلة الأساسية كثيفة كبيرة- تم حساب حجم المحسوبة لدكفس والبروتين الأساسية كثيفة والحل الهالة المحيطة بمصفوفة البروتين الأساسية كثيفة في أتوليتريس (ال) من تحليل الصور صور تيم للخلايا تشرومافين في متساوي التوتر (n = 12) ومكثف (n = 9) المخازن المؤقتة. النتائج التي جمعت من حويصلات 311 كل خلية في متوسط والمتوسطات من خلايا مفردة (± SEM). ترد القيم من مزاوج تي--اختبارات مقارنة المخازن المؤقتة متساوي التوتر ومكثف. فالقيمه هي 0.0385 (*) لحجم حويصلة، 0.3967 لوحدة التخزين الأساسية كثيفة، 0.0047 (*) لهالة حجم24. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56537/56537fig8large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring the Effect of Osmotic Stress on Secretory Vesicles and Exocytosis at JoVE.com

Monitoring the Effect of Osmotic Stress on Secretory Vesicles and Exocytosis

ناضح الإجهاد يؤثر على الرقابة، ومبلغ العصبي أثناء هذه العملية. ونحن تبين كيفية الجمع بين الطرق الكهروكيميائية جنبا إلى جنب مع مجهر إلكتروني يمكن استخدامها لدراسة تأثير الضغط الاسموزي خارج الخلية على نشاط الرقابة وحويصله كانتال حجم ومقدار العصبي صدر خلال الرقابة.

رصد أثر الإجهاد ناضح على الحويصلات الافرازية والرقابة

Amperometry recording of cells subjected to osmotic shock show that secretory cells respond to this physical stress by reducing the exocytosis activity ...

monitoring-effect-osmotic-stress-on-secretory-vesicles

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.5K Views.  Chalmers University of Technology. ناضح الإجهاد يؤثر على الرقابة، ومبلغ العصبي أثناء هذه العملية. ونحن تبين كيفية الجمع بين الطرق الكهروكيميائية جنبا إلى جنب مع مجهر إلكتروني يمكن استخدامها لدراسة تأثير الضغط الاسموزي خارج الخلية على نشاط الرقابة وحويصله كانتال حجم ومقدار العصبي صدر خلال الرقا...

Video: Monitoring the Effect of Osmotic Stress on Secretory Vesicles and Exocytosis

Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local variations in calcium ion concentration. The main molecular components involved in these processes have been identified; however, the specific interplay between calcium ion gradients and the lipids within the cell membrane is far less known, mainly due to the complex nature of biological cells and the difficultly of observation schemes. To bridge this gap, a synthetic approach is successfully implemented to reveal the localized effect of calcium ions on cell membrane mimics. Establishing a mimic to resemble the conditions within a cell is a severalfold problem. First, an adequate biomimetic model with appropriate dimensions and membrane composition is required to capture the physical properties of cells. Second, a micromanipulation setup is needed to deliver a small amount of calcium ions to a particular membrane location. Finally, an observation scheme is required to detect and record the response of the lipid membrane to the external stimulation. This article offers a detailed biomimetic approach for studying the calcium ion-membrane interaction, where a lipid vesicle system, consisting of a giant unilamellar vesicle (GUV) connected to a multilamellar vesicle (MLV), is exposed to a localized calcium gradient formed using a microinjection system. The dynamics of the ionic influence on the membrane were observed using fluorescence microscopy and recorded at video frame rates. As a result of the membrane stimulation, highly curved membrane tubular protrusions (MTPs) formed inside the GUV, oriented away from the membrane. The described approach induces the remodeling of the lipid membrane and MTP production in an entirely contactless and controlled manner. This approach introduces a means to address the details of calcium ion-membrane interactions, providing new avenues to study the mechanisms of cell membrane reshaping.

We present a technique for contactless micromanipulation of vesicles, using localized calcium ion gradients. Microinjection of a calcium ion solution, in the vicinity of a giant lipid vesicle, is utilized to remodel the lipid membrane, resulting in the production of membrane tubular protrusions.

غشاء يعيد البناء من حويصلات العملاقة في استجابة للتدرجات أيون الكالسيوم مترجمة

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local ...

Chemistry

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly synthesized allergic, inflammatory and immunoregulatory mediators. MCs&#8217; mediators affect multiple tissues and organs culminating in allergic and immune responses. The synthesis, storage and release of the MC mediators are highly regulated. The pre-formed mediators are packed in cytoplasmic secretory granules&#160;(SG) that fuse with the plasma membrane and release their content by regulated exocytosis. We present a protocol, based on the co-expression of a gene of interest with a reporter gene that is targeted to the SGs and is released in a regulated fashion alongside the endogenous SG mediators. The protocol enables high resolution four dimensional confocal analyses of the MC SGs and monitoring their timeline from biogenesis to triggered exocytosis. Thus, using this protocol for screening genes of interest for their phenotypic and functional impact allows deciphering the molecular mechanisms that govern the biogenesis and exocytosis of the MC SGs and identifying the regulators involved. Thereby, further insights into the cellular mechanisms that account for MCs function in health and disease should be provided.

The goal of the present&#160;protocol was to develop a method that will allow functional genomic analyses of mast cell secretion. The protocol is based on quantitative assessment of the release of a fluorescent reporter gene cotrasfected with the gene of interest and real time&#160;analyses of the secretory granule&#39;s morphology.

التحقيق ماست الخلية الإفرازية حبيبات. من البناء الحيوي لالإيماس

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

Immunology and Infection

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real time and dissecting the different steps of exo-endocytosis at the single-vesicle level are crucial for understanding synaptic functions in health and disease.
Genetically-encoded pH-sensitive probes directly targeted to synaptic vesicles and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM) provide the spatio-temporal resolution necessary to follow vesicle dynamics. The evanescent field generated by total internal reflection can only excite fluorophores placed in a thin layer (&#60;150 nm) above the glass cover on which cells adhere, exactly where the processes of exo-endocytosis take place. The resulting high-contrast images are ideally suited for vesicles tracking and quantitative analysis of fusion events.
In this protocol, SH-SY5Y human neuroblastoma cells are proposed as a valuable model for studying neurotransmitter release at the single-vesicle level by TIRFM, because of their flat surface and the presence of dispersed vesicles. The methods for growing SH-SY5Y as adherent cells and for transfecting them with synapto-pHluorin are provided, as well as the technique&#160;to perform TIRFM and imaging. Finally, a strategy aiming to select, count, and analyze fusion events at whole-cell and single-vesicle levels is presented.
To validate the imaging procedure and data analysis approach, the dynamics of pHluorin-tagged vesicles are&#160;analyzed under resting and stimulated (depolarizing potassium concentrations) conditions. Membrane depolarization increases the frequency of fusion events and causes a parallel raise of the net fluorescence signal recorded in whole cell. Single-vesicle analysis reveals modifications of fusion-event behavior (increased peak height and width). These data suggest that potassium depolarization not only induces a massive neurotransmitter release but also modifies the mechanism of vesicle fusion and recycling.
With the appropriate fluorescent probe, this technique can be employed in different cellular systems to dissect the mechanisms of constitutive and stimulated secretion.

This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

TIRFM والحساسة للدرجة الحموضة GFP-تحقيقات في تقييم ناقل عصبي الحويصلة حيوية في خلايا SH-SY5Y العصبية: التصوير خلية وتحليل البيانات

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.

قياس الالتقام حويصلة متشابك في الخلايا العصبية هيبوكامبال مثقف

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

الكمي الزمانية التعبير MAPK المستحثة في خلايا الخميرة واحدة

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Biology

Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated exocytosis is fundamental for intercellular communication and is a key mechanism for the secretion of neurotransmitters, hormones, inflammatory mediators, and other compounds, by a variety of cells. At least three distinct mechanisms are known for regulated exocytosis: full exocytosis, where a single SG fully fuses with the plasma membrane, kiss-and-run exocytosis, where a single SG transiently fuses with the plasma membrane, and compound exocytosis, where several SGs fuse with each other, prior to or after SG fusion with the plasma membrane. The type of regulated exocytosis undertaken by a cell is often dictated by the type of secretory trigger. However, in many cells, a single secretory trigger can activate multiple modes of regulated exocytosis simultaneously. Despite their abundance and importance across cell types and species, the mechanisms that determine the different modes of secretion are largely unresolved. One of the main challenges in investigating the different modes of regulated exocytosis, is the difficulty in distinguishing between them as well as exploring them separately. Here we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran as an exocytosis reporter, and live cell imaging, to differentiate between the different pathways of regulated exocytosis, focusing on compound exocytosis, based on the robustness and duration of the exocytic events.

Here we detail a method for live cell imaging of regulated exocytosis. This method utilizes FITC-dextran, which accumulates in lysosome-related organelles, as a reporter. This simple method also allows distinguishing between different modes of regulated exocytosis in cells that are difficult to manipulate genetically.

تصوير فيتك-ديكستران كمراسل للرقابة الخاضعة للتنظيم

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated ...

Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells

Live imaging of the pHluorin tagged Soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptor (v-SNARE) Vesicle-associated membrane protein 7 (VAMP7) by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) is a straightforward way to explore secretion from the lysosomal compartment. Taking advantage of cell culture on micropatterned surfaces to normalize cell shape, a variety of statistical tools were employed to perform a spatial analysis of secretory patterns. Using Ripley&#8217;s K function and a statistical test based on the nearest neighbor distance (NND), we confirmed that secretion from lysosomes is not a random process but shows significant clustering. Of note, our analysis revealed that exocytosis events are also clustered in nonadhesion areas, indicating that adhesion molecules are not the only structures that can induce secretory hot spots at the plasma membrane. Still, we found that cell adhesion enhances clustering. In addition to precisely defined adhesive and nonadhesive areas, the circular geometry of these micropatterns allows the use of polar coordinates, simplifying analyses. We used Kernel Density Estimation (KDE) and the cumulative distribution function on polar coordinates of exocytosis events to identify enriched areas of exocytosis. In ring-shaped micropattern cells, clustering occurred at the border between the adhesive and nonadhesive areas. Our analysis illustrates how statistical tools can be employed to investigate spatial distributions of diverse biological processes.

Live imaging of lysosomal exocytosis on micropatterned cells allows a spatial quantification of this process. Morphology normalization using micropatterns is an outstanding tool to uncover general rules about the spatial distribution of cellular processes.

قياس المعلمات االوقائية من إكسوسيتسيس الخلوية في الخلايا micropatterned

Live imaging of the pHluorin tagged Soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptor (v-SNARE) Vesicle-associated membrane protein 7 ...

Automated Detection and Analysis of Exocytosis

Timelapse TIRF microscopy of pH-sensitive GFP (pHluorin) attached to vesicle SNARE proteins is an effective method to visualize single vesicle exocytic events in cell culture. To perform an unbiased, efficient identification and analysis of such events, a computer-vision based approach was developed and implemented in MATLAB. The analysis pipeline consists of a cell segmentation and exocytic-event identification algorithm. The computer-vision approach includes tools for investigating multiple parameters of single events, including the half-life of fluorescence decay and peak &#916;F/F, as well as whole-cell analysis of the frequency of exocytosis. These and other parameters of fusion are used in a classification approach to distinguish distinct fusion modes. Here a newly built GUI performs the analysis pipeline from start to finish. Further adaptation of Ripley&#39;s K function in R Studio is used to distinguish between clustered, dispersed, or random occurrence of fusion events in both space and time.

We developed automated computer vision software to detect exocytic events marked by pH-sensitive fluorescent probes. Here, we demonstrate the use of a graphical user interface and RStudio to detect fusion events, analyze and display spatiotemporal parameters of fusion, and classify events into distinct fusion modes.

الكشف الآلي وتحليل exocytosis

Timelapse TIRF microscopy of pH-sensitive GFP (pHluorin) attached to vesicle SNARE proteins is an effective method to visualize single vesicle exocytic ...

An Introduction to Endocytosis and Exocytosis

Cells can take in substances from the extracellular environment by endocytosis and actively release molecules into it by exocytosis. Such processes involve lipid membrane-bound sacs called vesicles. Knowledge of the molecular architecture and mechanisms of both is key to understanding normal cell physiology, as well as the disease states that arise when they become defective. This video will first briefly review a few pivotal discoveries in the history of endo- and exocytosis research. Next, some key questions will be examined, followed by a discussion of the prominent methods used to investigate these problems, including cell labeling, fusion assays, and fluorescence imaging. Finally, it will explore current research being conducted by scientists in the field today.

Endocytosis and Exocytosis; Clathrin Coated Pits and SNAREs

Cells can take in substances from the extracellular environment by endocytosis and actively release molecules into it by exocytosis. Such processes ...

Education

JoVE Science Education

Advanced Biology

Cell Biology

An In Vitro Technique to Visualize Exocytosis of Secretory Granules in Mast Cells

Source: Klein, O., et al. <a href="https://app.jove.com/v/57936">Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates a technique to visualize exocytosis in mast cells. The cells are incubated with FITC-dextran &#8212; a fluorescent reporter &#8212; which is taken up by cells inside secretory granules (SGs), where the acidic pH quenches its fluorescence. Upon stimulation of granule exocytosis, the medium&#39;s higher pH induces reporter fluorescence inside the fused SGs, which is visualized using a fluorescence microscope.

تقنية في المختبر لتصور إفراز الخلايا الإفرازية في الخلايا البدينة

1. Preparations

	Preparation of RBL (RBL-2H3 mast cell line) culture media
	
		Mix 500 mL of low glucose Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium ...