المؤلف يود أن يشكر مجلس البحوث السويدية (349-2007-8680) للتمويل و Dalsjöfors Kött AB (Dalsjöfors، السويد) للتبرع بالغدد الكظرية الأبقار.

<ol>
	<li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry.">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).</li><li>Dunevall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+Catecholamine+Content+of+Single+Mammalian+Vesicles+by+Collision-Adsorption+Events+at+an+Electrode.">Characterizing the Catecholamine Content of Single Mammalian Vesicles by Collision-Adsorption Events at an Electrode.</a> J Am Chem Soc. 137 (13), 4344-4346 (2015).</li><li>Crivellato, E., Nico, B., Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromaffin+vesicle:+advances+in+understanding+the+composition+of+a+versatile,+multifunctional+secretory+organelle.">The chromaffin vesicle: advances in understanding the composition of a versatile, multifunctional secretory organelle.</a> Anat Rec. 291 (12), 1587-1602 (2008).</li><li>Morris, S., Schultens, H., Schober, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+osmometer+model+for+changes+in+the+buoyant+density+of+chromaffin+granules.">An osmometer model for changes in the buoyant density of chromaffin granules.</a> Biophys J. 20 (1), 33 (1977).</li><li>Winkler, H., Smith, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromaffin+granule+and+the+storage+of+catecholamines.">The chromaffin granule and the storage of catecholamines.</a> Handbook of Physiology. 6 (7), 321-399 (1975).</li><li>Phillips, J., Allison, Y., Morris, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+calcium,+magnesium,+copper+and+iron+in+the+bovine+adrenal+medulla.">The distribution of calcium, magnesium, copper and iron in the bovine adrenal medulla.</a> Neurosci. 2 (1), 147-152 (1977).</li><li>Est&#233;vez-Herrera, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP:+The+crucial+component+of+secretory+vesicles.">ATP: The crucial component of secretory vesicles.</a> Proc Natl Acad Sci. 113 (28), 4098-4106 (2016).</li><li>Machado, J. D., Camacho, M., Alvarez, J., Borges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+role+of+intravesicular+calcium+in+the+motion+and+exocytosis+of+secretory+organelles.">On the role of intravesicular calcium in the motion and exocytosis of secretory organelles.</a> Commun integr biol. 2 (2), 71-73 (2009).</li><li>Toll, L., Howard, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Mg2++ion-activated+ATPase+and+a+pH+gradient+in+the+storage+of+catecholamines+in+synaptic+vesicles.">Role of Mg2+ ion-activated ATPase and a pH gradient in the storage of catecholamines in synaptic vesicles.</a> Biochemistry. 17 (13), 2517-2523 (1978).</li><li>Terland, O., Flatmark, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbate+as+a+natural+constituent+of+chromaffin+granules+from+the+bovine+adrenal+medulla.">Ascorbate as a natural constituent of chromaffin granules from the bovine adrenal medulla.</a> FEBS letters. 59 (1), 52-56 (1975).</li><li>Camacho, M., Machado, J. D., Montesinos, M. S., Criado, M., Borges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intragranular+pH+rapidly+modulates+exocytosis+in+adrenal+chromaffin+cells.">Intragranular pH rapidly modulates exocytosis in adrenal chromaffin cells.</a> J Neurochem. 96 (2), 324-334 (2006).</li><li>Jankowski, J. A., Schroeder, T. J., Ciolkowski, E. L., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+characteristics+of+quantal+secretion+of+catecholamines+from+adrenal+medullary+cells.">Temporal characteristics of quantal secretion of catecholamines from adrenal medullary cells.</a> J Biol Chem. 268 (20), 14694-14700 (1993).</li><li>Daniels, A., Williams, R., Wright, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+character+of+the+stored+molecules+in+chromaffin+granules+of+the+adrenal+medulla:+a+nuclear+magnetic+resonance+study.">The character of the stored molecules in chromaffin granules of the adrenal medulla: a nuclear magnetic resonance study.</a> Neurosci. 3 (6), 573-585 (1978).</li><li>Borges, R., Travis, E. R., Hochstetler, S. E., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+external+osmotic+pressure+on+vesicular+secretion+from+bovine+adrenal+medullary+cells.">Effects of external osmotic pressure on vesicular secretion from bovine adrenal medullary cells.</a> J Biol Chem. 272 (13), 8325-8331 (1997).</li><li>Troyer, K. P., Mundorf, M. L., Fries, H. E., Wightman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+vesicle+fusion+and+exocytosis+in+hypertonic+conditions.">Separating vesicle fusion and exocytosis in hypertonic conditions.</a> Ann NY Acad Sci. 971 (1), 251-253 (2002).</li><li>Brodwick, M. S., Curran, M., Edwards, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+osmotic+stress+on+mast+cell+vesicles+of+the+beige+mouse.">Effects of osmotic stress on mast cell vesicles of the beige mouse.</a> J Membrane Biol. 126 (2), 159-169 (1992).</li><li>Amatore, C., Arbault, S., Bonifas, I., Lemaitre, F., Verchier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+exocytosis+under+hypotonic+conditions+shows+two+distinct+populations+of+dense+core+vesicles+in+bovine+chromaffin+cells.">Vesicular exocytosis under hypotonic conditions shows two distinct populations of dense core vesicles in bovine chromaffin cells.</a> Chem Phys Chem. 8 (4), 578-585 (2007).</li><li>Hampton, R. Y., Holz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+changes+in+osmolality+on+the+stability+and+function+of+cultured+chromaffin+cells+and+the+possible+role+of+osmotic+forces+in+exocytosis.">Effects of changes in osmolality on the stability and function of cultured chromaffin cells and the possible role of osmotic forces in exocytosis.</a> J Cell Biol. 96 (4), 1082-1088 (1983).</li><li>Troyer, K. P., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+separation+of+vesicle+release+from+vesicle+fusion+during+exocytosis.">Temporal separation of vesicle release from vesicle fusion during exocytosis.</a> J Biol Chem. 277 (32), 29101-29107 (2002).</li><li>Pihel, K., Travis, E. R., Borges, R., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytotic+release+from+individual+granules+exhibits+similar+properties+at+mast+and+chromaffin+cells.">Exocytotic release from individual granules exhibits similar properties at mast and chromaffin cells.</a> Biophys J. 71 (3), 1633 (1996).</li><li>Jankowski, J. A., Finnegan, J. M., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ionic+composition+alters+kinetics+of+vesicular+release+of+catecholamines+and+quantal+size+during+exocytosis+at+adrenal+medullary+cells.">Extracellular ionic composition alters kinetics of vesicular release of catecholamines and quantal size during exocytosis at adrenal medullary cells.</a> J Neurochem. 63 (5), 1739-1747 (1994).</li><li>Leszczyszyn, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+receptor-mediated+catecholamine+secretion+from+individual+chromaffin+cells.+Chemical+evidence+for+exocytosis.">Nicotinic receptor-mediated catecholamine secretion from individual chromaffin cells. Chemical evidence for exocytosis.</a> J Biol Chem. 265 (25), 14736-14737 (1990).</li><li>Wightman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+resolved+catecholamine+spikes+correspond+to+single+vesicle+release+from+individual+chromaffin+cells.">Temporally resolved catecholamine spikes correspond to single vesicle release from individual chromaffin cells.</a> P Natl Acad Sci. 88 (23), 10754-10758 (1991).</li><li>Fathali, H., Dunevall, J., Majdi, S., Cans, A. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+osmotic+stress+reduces+the+vesicle+size+while+keeping+a+constant+neurotransmitter+concentration.">Extracellular osmotic stress reduces the vesicle size while keeping a constant neurotransmitter concentration.</a> ACS Chemical Neuroscience. , (2017).</li><li>Bath, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsecond+adsorption+and+desorption+of+dopamine+at+carbon-fiber+microelectrodes.">Subsecond adsorption and desorption of dopamine at carbon-fiber microelectrodes.</a> Anal Chem. 72 (24), 5994-6002 (2000).</li><li>Li, X., Majdi, S., Dunevall, J., Fathali, H., Ewing, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Measurement+of+Transmitters+in+Individual+Vesicles+in+the+Cytoplasm+of+Single+Cells+with+Nanotip+Electrodes.">Quantitative Measurement of Transmitters in Individual Vesicles in the Cytoplasm of Single Cells with Nanotip Electrodes.</a> Angew Chem Int Edit. 54 (41), 11978-11982 (2015).</li><li>Zoski, C. G., Mirkin, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+limiting+currents+at+finite+conical+microelectrodes.">Steady-state limiting currents at finite conical microelectrodes.</a> Anal Chem. 74 (9), 1986-1992 (2002).</li><li>Mosharov, E. V., Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+exocytotic+events+recorded+by+amperometry.">Analysis of exocytotic events recorded by amperometry.</a> Nat Methods. 2 (9), 651-658 (2005).</li><li>Morris, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+formaldehyde+glutaraldehyde+fixative+of+high+osmolality+for+use+in+electron+microscopy.">A formaldehyde glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy.</a> J Cell Biol. 27, 137-139 (1965).</li><li>Parsons, T. D., Coorssen, J., Horstmann, H., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Docked+granules,+the+exocytic+burst,+and+the+need+for+ATP+hydrolysis+in+endocrine+cells.">Docked granules, the exocytic burst, and the need for ATP hydrolysis in endocrine cells.</a> Neuron. 15 (5), 1085-1096 (1995).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

نقدم هنا بروتوكولا ومزايا الجمع بين ثلاثة أساليب تحليلية تكميلية لتحليل الحويصلات الافرازية وعملية الرقابة للحصول على فهم أفضل لكيف يمكن أن يؤثر على قوة مادية مثل الضغط التناضحي الحويصلات الافرازية وفي عملية الرقابة في الخلايا الافرازية. وتشمل هذه الأساليب أمبيروميتري ميكروليكترودي أ?...

الخلايا تشرومافين في الغدد الكظرية هي خلايا الغدد الصم العصبية أن الإفراج عن جزيئات الناقل العصبي في مجرى الدم. وهذا يحدث من خلال عملية الخلوية التي تنطوي على الالتحام والانصهار من حويصلات مملوءة بالعصبي، أسفرت عن الإفراج عن المحتوى من الحويصلات إلى الفضاء خارج الخلية في عملية تسمى الرقابة. العصبية (الأدرينالين ونورادرينالين) في الخلايا تشرومافين بنشاط تنقل عن طريق بروتينات الغشاء إلى حويصلات الأساسية كثيفة كبيرة (لدكفس) وتخزينها في تركيزات عالية (~0.5-1 م)1،2. يتم إنجاز تراكم العصبية داخل لدكفس بتقارب جزيئات الكاتيكولامينات إلى مصفوفة البروتين الأساسية كثيفة إينترافيسيكولار تتألف من تشروموجرانين البروتينات (~ 169 ملغ/مل)3،4،5 ،6، وحلا كوكتيل إينترافيسيكولار الذي يحتوي على المكونات الرئيسية لتخزين وتحميل الكاتيكولامينات إلى حويصلة مثل ATP (125-300 مم)7، Ca2 + (50-100 ميكرومتر في الحل ومم ~ 40 ملزمة مصفوفة البروتين)8، Mg2 + (5 ملم)9، اسكوربات (10-30 ملم)10، والرقم الهيدروجيني من ~5.511،12. لدكفس الحفاظ على شرط iso ناضح الخلية السيتوبلازم (310 موسم/كغ)13، على الرغم من أن تركيز ذائبة النظرية داخل الحويصلات مبلغ يصل إلى أكثر من 750 ملم. تكوين المكونات إينترافيسيكولار ليست فقط ضرورية لتحميل وتخزين الكاتيشولامين، ولكن أيضا لتجميع الذوائب لمصفوفة البروتين الأساسية كثيفة. وهذا يقلل كثيرا من الاسموليه الحويصلات انخفض انخفاضا كبيرا، ويمكن أن تؤثر على الكاتيكولامينات المبلغ تم إصداره من خلال الرقابة5،6.
وأفادت الدراسات عن تأثير الضغط الاسموزي خارج الخلية في عملية الرقابة عن طريق تسجيل أمبيروميتريك أن ارتفاع الضغط الاسموزي خارج الخلية يحول دون نشاط الرقابة، ويقلل من العدد من أجهزة الإرسال العصبية ويفرز من واحد حويصلة المقصورات4،،من1415،16،17،،من1819. تكهنت التفسيرات لهذه الملاحظات على تعزيز إمكانية مزاحمة الجزيئات في أحداث الانصهار حويصلة المثبطة الخلية السيتوبلازم، وتغيير في غشاء الخصائص الفيزيائية التي تؤثر على عدد أجهزة الإرسال العصبية صدر خلال الرقابة. هذه الأفكار يفترض أن ارتفاع الضغط التناضحي خارج الخلية لا يؤثر على حجم حويصلة كانتال، الذي يحدد عدد جزيئات العصبي المخزنة في حجرة حويصلة في المرحلة السابقة للرقابة المشغلة14، 15 , 17 , 19 , 20 , 21-في القياسات أمبيروميتريك للإفراج عن الرقابة في الخلايا المفردة، يوضع ميكروليكترودي قرص ألياف الكربون في اتصال وثيق مع سطح الخلية، إنشاء مجموعة تجريبية حتى محاكاة التكوين المشبك، حيث أمبيروميتريك بمثابة القطب22،بوستسينابتيك كاشف (الشكل 1)23. عن طريق تنشيط خلية للرقابة، واحد يمكن أن يستحث حويصلات مملوءة العصبي تلتحم مع غشاء بلازما الخلية والإفراج عن جزء أو محتوى حويصلة كاملة في الفضاء خارج الخلية. يمكن اكتشاف هذه الجزيئات العصبي صدر على سطح القطب اليكتروتشيميكالي العصبية في حالة اليكترواكتيفي (مثلاً، الكاتيشولامين) بتطبيق محتملة الأكسدة + 700 مقابل أم قطب مرجعي Ag/AgCl . ونتيجة لذلك، سلسلة من المسامير الحالية مناسبة الكشف عن أحداث الرقابة الفردية. من الحالي مقابل تتبع الوقت في تسجيل أمبيروميتريك بالمنطقة تحت كل سبايك أمبيروميتريك واحد يمثل المسؤول عن الكشف عن كل حدث الرقابة ويمكن تحويلها إلى الخلد العصبية في إصدارها، باستخدام المعادلة فاراداي. ومن ثم، تسجيلات أمبيروميتريك تقديم معلومات كمية عن العصبية المبلغ طردوا من أحداث الرقابة واحد وتقرير عن تواتر الأحداث الرقابة، لكن لا تقدم معلومات كمية عن الحويصلات الافرازية المحتوى قبل بدأ الإفراج عن الانصهار والعصبي حويصلة.
ولذلك، للحصول على فهم أفضل للحويصلات الافرازية كيف في الخلية السيتوبلازم يستجيب للضغط التناضحي خارج الخلية قبل أن يتم تشغيل الخلية على الخضوع للرقابة، يمكن استخدام أساليب تحليلية تكميلية أخرى لإثراء هذه المعلومات. على سبيل المثال، للتحقيق في حالة الإجهاد ناضح يغير حجم حويصلة، يمكن استخدام مجهر إلكتروني (TEM) التصوير تحليل لقياس حجم حويصلة من الخلايا بعد التثبيت الكيميائي. لفحص حالة الإجهاد ناضح يؤثر حجم حويصلة كانتال، يمكن تطبيق تقنية أمبيروميتريك المتقدمة مؤخرا تسمى الخلوي داخل الخلايا الكهروكيميائية، للتحديد الكمي لمحتوى العصبي حويصلة في الحويصلات الافرازية في هذه الدولة الأصلية عند الذين ما زالوا يقيمون في السيتوبلازم للخلايا الحية26. في تقنية الخلوي داخل الخلايا الكهروكيميائية، يتم إدراج قطب أسطواني ألياف الكربون نانوتيب برفق في السيتوبلازم للخلايا الحية، وعن طريق تطبيق محتملة أم + 700 لهذا القطب (مقابل Ag/AgCl مرجع قطب كهربائي)، محتوى الكاتيكولامينات في حويصلات يمكن قياسها كمياً بالكشف عن طفرة الأكسدة الحالية من حويصلات وحيد الاصطدام، أدسوربينج، ويمزق بعد ذلك ستوتشاستيكالي على سطح القطب وثم الإفراج عن محتوياتها ضد القطب السطحية26. ومن ثم في أمبيروميتريك الحالية مقابل تتبع الوقت، كل حدث rupturing حويصلة واحدة يمكن أن ينتج عابرة الحالية وعن طريق إدماج مجال كل المصطلحات الحالية، يمكن حساب حجم قوانتال حويصلة استخدام القانون Faraday´s.
ولذلك، من خلال ربط المعلومات الكمية المكتسبة من قياسات حجم حويصلة استخدام التصوير تيم جنبا إلى جنب مع تحليل حجم كانتال حويصلة، كما سجلتها الخلوي داخل الخلايا الكهروكيميائية، حويصلة العصبي تركيز يمكن أيضا يجب تحديد. وهذا يسمح توصيف حويصلة عندما تتعرض الخلايا لمختلف الظروف ناضح ويعطي فكرة أفضل عن كيفية حويصلات قد تستجيب للضغط التناضحي خارج الخلية في المرحلة قبل الرقابة. وقد أظهرت النتائج من الجمع بين هذه الأساليب أن حضور الضغط الاسموزي العالي خارج الخلية، حويصلات تقليص وضبط حجمها كانتال، ومقارنة المعلومات الكمية المتعلقة بالتغيرات النسبية من هذه القياسات تبين أن بينما تتقلص، حويصلات ضبط محتوياتها والحجم للحفاظ على تركيز عصبي مستمر24. وهكذا، هذا الفهم القيمة في الاتصال بالملاحظات التي أبديت على إطلاق سراح العصبي في الخلايا التي تتعرض للضغط التناضحي. في هذه البروتوكولات، يصف لنا استخدام هذه ثلاث منهجيات متكاملة تسمح بتوصيف الحويصلات الافرازية كيف في الرد على البيئة الأصلية ل osmolality خارج الخلية وآثار هذا الرد على الرقابة عملية. وبالإضافة إلى ملاحظاتنا السابقة فيما يتعلق بالتأثير ارتفاع الضغط الاسموزي على الرقابة24، نقدم المزيد من التجارب التي تصف خلية الإنعاش بعد صدمة ناضح وتأثير التحفيز الباريوم متعددة في تشرومافين الخلايا.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-2670</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase P</td><td>Roche, Sweden</td><td>11 213 857 001</td><td></td></tr><tr><td>100-&amp;micro;M Nylon mesh</td><td>Fisher Sientific</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1677</td><td></td></tr><tr><td>Collagen IV coated 60 mm plastic dish</td><td>VWR</td><td>354416</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Avanti J-20XP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillary</td><td>Sutter instrument Co., Novato, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Narishing Inc., Japan</td><td>PE-21</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy solutions (A and B)</td><td>Epoxy technology, Billerica, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beveller</td><td>Narishing Inc.</td><td>EG-400</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>Patch clamp Instrument</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td><td>Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Burleigh Instrument Inc., USA</td><td>PCS-5000</td><td></td></tr><tr><td>Butane Flame</td><td>Multiflame AB, H&amp;auml;sselholm, Sweden</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transmission electron microscopy</td><td>Omega</td><td>Leo 912 AB</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoring the effect of osmotic stress on secretory vesicles and exocytosis

تسجيل أمبيروميتري الخلايا تعرض لصدمة ناضح وتبين أن الخلايا الافرازية تستجيب لهذا الإجهاد البدني بالحد من نشاط الرقابة ومقدار العصبي صدر من حويصلات في أحداث الرقابة واحدة. ويقترح أن يرجع الانخفاض في العصبية طرد تغييرات في الخصائص الفيزيائية الغشاء عند تقليص الخلايا في استجابة للضغط ناضح ومع الافتراضات التي لا تتأثر الحويصلات الافرازية في السيتوبلازم الخلية بالضغط التناضحي خارج الخلية. تسجيل أمبيروميتري للرقابة ترصد ما أطلق سراحه من الخلايا في الوقت الحالي حويصلة الصمامات مع غشاء البلازما، ولكن عدم تقديم معلومات عن محتوى حويصلة قبل أن يتم تشغيل الانصهار حويصلة. ولذلك، يوفر التسجيل مع أساليب أخرى تحليلية متكاملة قادرة على وصف الحويصلات الافرازية قبل أن يتم تشغيل الرقابة على الخلايا عن طريق الجمع بين أمبيروميتري نظرة أوسع لدراسة الحويصلات الافرازية كيف تتأثر عملية الرقابة بصدمة ناضح. ونحن هنا تصف كيف يمكن استخدام تكملة أمبيروميتري تسجيل مع الخلوي داخل الخلايا الكهروكيميائية وانتقال الميكروسكوب الإلكتروني (TEM) تصوير لوصف التغييرات في محتوى الحويصلات الافرازية الحجم والعصبي في تشرومافين الخلايا بالنسبة لنشاط الرقابة قبل وبعد التعرض للضغط التناضحي. عن طريق ربط المعلومات الكمية المكتسبة من تجارب باستخدام جميع الأساليب التحليلية الثلاث، قدمت استنتاجات سابقا أن الحويصلات الافرازية تستجيب للضغط التناضحي خارج الخلية بالتقلص في الحجم وتقليل حجم حويصلة كانتال إلى الحفاظ على تركيز عصبي حويصلة مستمر. ومن ثم، وهذا يعطي بعض التوضيحات بشأن لماذا حويصلات، في استجابة للضغط التناضحي، تقليل العصبية المبلغ صدر خلال الإفراج عن الرقابة. تسجيلات أمبيروميتريك هنا تشير إلى هذا هو عملية عكسية وأن حويصلة بعد صدمة ناضح يتم تعبئتها بالعصبية عندما يتم إعادة وضع الخلايا في بيئة متساوي التوتر.

ونحن هنا وصف البروتوكول لكيفية الجمع بين تصوير تيم جنبا إلى جنب مع اثنين من منهجيات الكهروكيميائية، أمبيروميتري ألياف الكربون والخلوي داخل الخلايا الكهروكيميائية، يمكن أن توفر المعلومات التي تكتسب رؤية أوسع نطاقا في إشارة إلى تأثير الضغط الاسموزي خارج الخلية في عملية الرقابة والحويصلا...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring the Effect of Osmotic Stress on Secretory Vesicles and Exocytosis at JoVE.com

Monitoring the Effect of Osmotic Stress on Secretory Vesicles and Exocytosis

ناضح الإجهاد يؤثر على الرقابة، ومبلغ العصبي أثناء هذه العملية. ونحن تبين كيفية الجمع بين الطرق الكهروكيميائية جنبا إلى جنب مع مجهر إلكتروني يمكن استخدامها لدراسة تأثير الضغط الاسموزي خارج الخلية على نشاط الرقابة وحويصله كانتال حجم ومقدار العصبي صدر خلال الرقابة.

رصد أثر الإجهاد ناضح على الحويصلات الافرازية والرقابة

Amperometry recording of cells subjected to osmotic shock show that secretory cells respond to this physical stress by reducing the exocytosis activity ...

monitoring-effect-osmotic-stress-on-secretory-vesicles

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.5K Views.  Chalmers University of Technology. ناضح الإجهاد يؤثر على الرقابة، ومبلغ العصبي أثناء هذه العملية. ونحن تبين كيفية الجمع بين الطرق الكهروكيميائية جنبا إلى جنب مع مجهر إلكتروني يمكن استخدامها لدراسة تأثير الضغط الاسموزي خارج الخلية على نشاط الرقابة وحويصله كانتال حجم ومقدار العصبي صدر خلال الرقا...

Video: Monitoring the Effect of Osmotic Stress on Secretory Vesicles and Exocytosis

Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local variations in calcium ion concentration. The main molecular components involved in these processes have been identified; however, the specific interplay between calcium ion gradients and the lipids within the cell membrane is far less known, mainly due to the complex nature of biological cells and the difficultly of observation schemes. To bridge this gap, a synthetic approach is successfully implemented to reveal the localized effect of calcium ions on cell membrane mimics. Establishing a mimic to resemble the conditions within a cell is a severalfold problem. First, an adequate biomimetic model with appropriate dimensions and membrane composition is required to capture the physical properties of cells. Second, a micromanipulation setup is needed to deliver a small amount of calcium ions to a particular membrane location. Finally, an observation scheme is required to detect and record the response of the lipid membrane to the external stimulation. This article offers a detailed biomimetic approach for studying the calcium ion-membrane interaction, where a lipid vesicle system, consisting of a giant unilamellar vesicle (GUV) connected to a multilamellar vesicle (MLV), is exposed to a localized calcium gradient formed using a microinjection system. The dynamics of the ionic influence on the membrane were observed using fluorescence microscopy and recorded at video frame rates. As a result of the membrane stimulation, highly curved membrane tubular protrusions (MTPs) formed inside the GUV, oriented away from the membrane. The described approach induces the remodeling of the lipid membrane and MTP production in an entirely contactless and controlled manner. This approach introduces a means to address the details of calcium ion-membrane interactions, providing new avenues to study the mechanisms of cell membrane reshaping.

We present a technique for contactless micromanipulation of vesicles, using localized calcium ion gradients. Microinjection of a calcium ion solution, in the vicinity of a giant lipid vesicle, is utilized to remodel the lipid membrane, resulting in the production of membrane tubular protrusions.

غشاء يعيد البناء من حويصلات العملاقة في استجابة للتدرجات أيون الكالسيوم مترجمة

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local ...

Chemistry

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly synthesized allergic, inflammatory and immunoregulatory mediators. MCs&#8217; mediators affect multiple tissues and organs culminating in allergic and immune responses. The synthesis, storage and release of the MC mediators are highly regulated. The pre-formed mediators are packed in cytoplasmic secretory granules&#160;(SG) that fuse with the plasma membrane and release their content by regulated exocytosis. We present a protocol, based on the co-expression of a gene of interest with a reporter gene that is targeted to the SGs and is released in a regulated fashion alongside the endogenous SG mediators. The protocol enables high resolution four dimensional confocal analyses of the MC SGs and monitoring their timeline from biogenesis to triggered exocytosis. Thus, using this protocol for screening genes of interest for their phenotypic and functional impact allows deciphering the molecular mechanisms that govern the biogenesis and exocytosis of the MC SGs and identifying the regulators involved. Thereby, further insights into the cellular mechanisms that account for MCs function in health and disease should be provided.

The goal of the present&#160;protocol was to develop a method that will allow functional genomic analyses of mast cell secretion. The protocol is based on quantitative assessment of the release of a fluorescent reporter gene cotrasfected with the gene of interest and real time&#160;analyses of the secretory granule&#39;s morphology.

التحقيق ماست الخلية الإفرازية حبيبات. من البناء الحيوي لالإيماس

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

Immunology and Infection

Modulating Shape of Polyester Based Polymersomes using Osmotic Pressure

Polymersomes are membrane-bound, bilayer vesicles created from amphiphilic block copolymers that can encapsulate both hydrophobic and hydrophilic payloads for drug delivery applications. Despite their promise, polymersomes are limited in application due to their spherical shape, which is not readily taken up by cells, as demonstrated by solid nanoparticle scientists. This article describes a salt-based method for increasing the aspect ratios of spherical poly(ethylene glycol) (PEG)- based polymersomes. This method can elongate polymersomes and ultimately control their final shape by adding sodium chloride in post-formation dialysis. Salt concentration can be varied, as described in this method, based on the hydrophobicity of the block copolymer being used as the base for the polymersome and the target shape. Elongated nanoparticles have the potential to better target the endothelium in larger diameter blood vessels, like veins, where margination is observed. This protocol can expand therapeutic nanoparticle applications by utilizing elongation techniques in tandem with the dual-loading, long-circulating benefits of polymersomes.

Polymersomes are self-assembled polymeric vesicles that are formed in spherical shapes to minimize Gibb's Free Energy. In the case of drug delivery, more elongated structures are beneficial. This protocol establishes methods to create more rod-like polymersomes, with elongated aspect ratios, using salt to induce osmotic pressure and reduce internal vesicle volumes.

تعديل شكل البوليستر القائم على البوليمرات باستخدام الضغط التناضحي

Polymersomes are membrane-bound, bilayer vesicles created from amphiphilic block copolymers that can encapsulate both hydrophobic and hydrophilic payloads ...

Bioengineering

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

الكمي الزمانية التعبير MAPK المستحثة في خلايا الخميرة واحدة

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Biology

Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated exocytosis is fundamental for intercellular communication and is a key mechanism for the secretion of neurotransmitters, hormones, inflammatory mediators, and other compounds, by a variety of cells. At least three distinct mechanisms are known for regulated exocytosis: full exocytosis, where a single SG fully fuses with the plasma membrane, kiss-and-run exocytosis, where a single SG transiently fuses with the plasma membrane, and compound exocytosis, where several SGs fuse with each other, prior to or after SG fusion with the plasma membrane. The type of regulated exocytosis undertaken by a cell is often dictated by the type of secretory trigger. However, in many cells, a single secretory trigger can activate multiple modes of regulated exocytosis simultaneously. Despite their abundance and importance across cell types and species, the mechanisms that determine the different modes of secretion are largely unresolved. One of the main challenges in investigating the different modes of regulated exocytosis, is the difficulty in distinguishing between them as well as exploring them separately. Here we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran as an exocytosis reporter, and live cell imaging, to differentiate between the different pathways of regulated exocytosis, focusing on compound exocytosis, based on the robustness and duration of the exocytic events.

Here we detail a method for live cell imaging of regulated exocytosis. This method utilizes FITC-dextran, which accumulates in lysosome-related organelles, as a reporter. This simple method also allows distinguishing between different modes of regulated exocytosis in cells that are difficult to manipulate genetically.

تصوير فيتك-ديكستران كمراسل للرقابة الخاضعة للتنظيم

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated ...

Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells

Live imaging of the pHluorin tagged Soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptor (v-SNARE) Vesicle-associated membrane protein 7 (VAMP7) by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) is a straightforward way to explore secretion from the lysosomal compartment. Taking advantage of cell culture on micropatterned surfaces to normalize cell shape, a variety of statistical tools were employed to perform a spatial analysis of secretory patterns. Using Ripley&#8217;s K function and a statistical test based on the nearest neighbor distance (NND), we confirmed that secretion from lysosomes is not a random process but shows significant clustering. Of note, our analysis revealed that exocytosis events are also clustered in nonadhesion areas, indicating that adhesion molecules are not the only structures that can induce secretory hot spots at the plasma membrane. Still, we found that cell adhesion enhances clustering. In addition to precisely defined adhesive and nonadhesive areas, the circular geometry of these micropatterns allows the use of polar coordinates, simplifying analyses. We used Kernel Density Estimation (KDE) and the cumulative distribution function on polar coordinates of exocytosis events to identify enriched areas of exocytosis. In ring-shaped micropattern cells, clustering occurred at the border between the adhesive and nonadhesive areas. Our analysis illustrates how statistical tools can be employed to investigate spatial distributions of diverse biological processes.

Live imaging of lysosomal exocytosis on micropatterned cells allows a spatial quantification of this process. Morphology normalization using micropatterns is an outstanding tool to uncover general rules about the spatial distribution of cellular processes.

قياس المعلمات االوقائية من إكسوسيتسيس الخلوية في الخلايا micropatterned

Live imaging of the pHluorin tagged Soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptor (v-SNARE) Vesicle-associated membrane protein 7 ...

Automated Detection and Analysis of Exocytosis

Timelapse TIRF microscopy of pH-sensitive GFP (pHluorin) attached to vesicle SNARE proteins is an effective method to visualize single vesicle exocytic events in cell culture. To perform an unbiased, efficient identification and analysis of such events, a computer-vision based approach was developed and implemented in MATLAB. The analysis pipeline consists of a cell segmentation and exocytic-event identification algorithm. The computer-vision approach includes tools for investigating multiple parameters of single events, including the half-life of fluorescence decay and peak &#916;F/F, as well as whole-cell analysis of the frequency of exocytosis. These and other parameters of fusion are used in a classification approach to distinguish distinct fusion modes. Here a newly built GUI performs the analysis pipeline from start to finish. Further adaptation of Ripley&#39;s K function in R Studio is used to distinguish between clustered, dispersed, or random occurrence of fusion events in both space and time.

We developed automated computer vision software to detect exocytic events marked by pH-sensitive fluorescent probes. Here, we demonstrate the use of a graphical user interface and RStudio to detect fusion events, analyze and display spatiotemporal parameters of fusion, and classify events into distinct fusion modes.

الكشف الآلي وتحليل exocytosis

Timelapse TIRF microscopy of pH-sensitive GFP (pHluorin) attached to vesicle SNARE proteins is an effective method to visualize single vesicle exocytic ...

Role of ER in the Secretory Pathway

Eukaryotic cells have a special pathway that enables communication between various intracellular membrane-bound compartments and also with the extracellular environment. This pathway is termed as the secretory pathway.
Components of the secretory pathway
About a third of proteins synthesized in the cell are sorted via the secretory route. They shuffle between different compartments in membrane-bound vesicles until they reach their final destination. The main intracellular compartments involved in the secretory pathway are the endoplasmic reticulum, the ER-Golgi intermediate compartment, and the Golgi apparatus. Eventually, the functional protein cargo is delivered within the endomembrane system, exported out of the cell, or inserted into the plasma membrane.
Endoplasmic reticulum: the gateway to the secretory pathway
The endoplasmic reticulum is the primary gateway to the secretory pathway. It is the site where the proteins are folded, modified, and checked for quality before entering the secretory pathway. Various physiological stresses can increase the demand for secretory proteins or cause the accumulation of misfolded proteins in the ER. The disruption in the balance between protein demand and capacity to deliver correctly folded proteins in the ER causes stress.
Unchecked ER stress disturbs ER homeostasis, resulting in cellular dysfunction and disease. The primary characteristics of ER-related diseases are decreased protein folding capacity, failure to recognize and respond to misfolded proteins, and improper activation of responses to misfolded proteins. ER stress is implicated in the pathogenesis of diseases like diabetes mellitus, viral infections, and cancer.&#160; For example, in type II diabetes mellitus, insulin resistance in the peripheral tissues of the liver results in hypersecretion of insulin by the &#946; cells. The secretory overload experienced by the &#946; cells skews the ER balance. It can also result in cell death in later stages of type II diabetes mellitus.

دور الطوارئ في المسار الإفرازي

Eukaryotic cells have a special pathway that enables communication between various intracellular membrane-bound compartments and also with the ...

Education

JoVE Core

Cell Biology

Unit 1

Transmembrane Transport in Endoplasmic Reticulum and Peroxisomes

KEY TERMS AND CONCEPTS

Exocytosis

Exocytosis is a process that releases molecules outside the cell. Like other bulk transport mechanisms, exocytosis requires energy.
Exocytosis is the opposite of endocytosis, which brings molecules inside the cell. Sometimes, the released materials are signaling molecules. For example, neurons typically use exocytosis to release neurotransmitters. Cells also use exocytosis to insert proteins such as ion channels into their cell membranes, secrete proteins for use in the extracellular matrix, or remove waste.
There are two main types of exocytosis in eukaryotes&#8212;regulated and non-regulated (or constitutive). Regulated exocytosis requires an external signal and is used to release neurotransmitters and secrete hormones. Unlike regulated exocytosis, constitutive exocytosis is carried out by all cells. Cells use constitutive exocytosis to release components of the extracellular matrix or incorporate proteins into the plasma membrane.
Both regulated and constitutive exocytosis occur in a stepwise manner.
The first step is vesicle trafficking, in which vesicles transport material to the plasma membrane. Motor proteins actively move vesicles along the cytoskeletal tracks of microtubules and filaments. The second step is vesicle tethering, in which vesicles are partially linked to the plasma membrane. In the third step, vesicle docking, the vesicle membrane attaches to the plasma membrane, and the two membranes begin to pair with each other.
The fourth step, vesicle priming, occurs only in regulated exocytosis. Vesicle priming includes modifications occurring after the vesicle docks but before releasing its contents. Priming prepares vesicles for fusion with the plasma membrane.
The fifth step is vesicle fusion. Vesicle fusion can be complete or kiss-and-run. In complete fusion, vesicles entirely collapse and become part of the plasma membrane, expelling the contents from the cell in the process. In kiss-and-run fusion, the vesicle is recycled: It only temporarily fuses with the plasma membrane, releases its contents, and returns to the cell&#39;s interior.

إفراز الخلايا

Exocytosis is a process that releases molecules outside the cell. Like other bulk transport mechanisms, exocytosis requires energy.
Exocytosis is the ...

Endocytosis and Exocytosis

Overview of Secretory Vesicles

Secretory vesicles, also known as dense core vesicles (DCVs), are membrane-bound vesicles that transport secretory proteins, such as hormones or neurotransmitters. Regulated secretory vesicles transport proteins from the trans-Golgi network to the exterior of the cell. Proteins present in regulated secretory vesicles are required to be rapidly exocytosed in large amounts upon a specific stimulus.
Various proteins regulate the aggregation of molecules inside the secretory vesicles. Chromogranins (Cgs) A and B are proteins that bind to soluble molecules present in secretory vesicles. This binding aggregates the soluble molecules, forming DCVs. Cgs function optimally at low pH and high intracellular calcium concentration. The low pH is maintained by the continuous pumping of protons by the V-type ATPases. A high concentration of calcium is present in the endoplasmic reticulum and Golgi complex of most mammalian cells. Hence, the secretory vesicles that bud off from the trans-Golgi network are rich in calcium. Calcium induces pH-dependent conformational changes in Cgs A and B. These conformational changes lead to the binding and aggregation of CgsA and B among other vesicular matrix proteins with the vesicular membrane. Aggregation is important for specific proteins to be sorted into regulated secretory vesicles.
The yeast Saccharomyces cerevisiae is a model system for studying the regulation of secretory vesicle-mediated transport. In 1979, Randy Schekman and Peter Novik generated temperature-sensitive mutants of S. cerevisiae. These mutants expressed proteins that were functional only at low temperatures but not at 37&#176;C. Schekman and Novik observed that these mutants accumulated vesicles and internal membranes. These mutants were also defective in different stages of protein secretion and therefore called them sec mutants. Some sec mutants contained vesicles that were unable to fuse with the plasma membrane, while other mutants could not transport proteins to other organelles. Further, molecular analysis of these mutants revealed 23 sec genes that produced proteins with regulatory roles in different transport stages of secretory vesicles.