تم تمويل هذا العمل بمنحه من نيندس لل KMC (R01 NS086932). وأيد لمن على منحة من برنامج البعثة NIGMS (R25 GM076419). السلالات المستخدمة في هذه الدراسة C. ايليجانس مركز علم الوراثة، والذي يموله مكتب المعاهد الوطنية للصحة "برامج الهياكل الأساسية للبحوث" (P40 OD010440). ونحن نشكر جيمس بيكر وميسون كلاين لإجراء مناقشات مفيدة.

الكتاب يعلن وجود لا تضارب في المصالح.

هدف الرئيسي لعلم الأعصاب لفهم كيفية اتصال الخلايا العصبية في الدوائر لسلوك الحيوانات بالسيارة. دمج الدوائر العصبية مجموعة من الإشارات الحسية المتنوعة بغية تغيير نشاط الدائرة، مما يقود التغيرات السلوكية اللازمة للحيوانات للاستجابة لبيئتهم. ديدان أسطوانية، C. ايليجانس، لديها نظام عصبي بسيط مع الخلايا العصبية 302 اتصالات متشابك التي كانت المعين تماما1. بالإضافة إلى ذلك، هي حفظت الجينات ترميز للبروتينات المشاركة في كبيرة جداً بين C. ايليجانس والثدييات2. وعلى الرغم من بساطة تشريحية في الجهاز العصبي، فإنه يعرض مرجع معقدة من السلوكيات المصانة توفير منصة خصبة لفهم كيفية تنظيم الخلايا العصبية السلوك3.
C. ايليجانس قابلة للتطبيق لمجموعة واسعة من النهج مثل التلاعب بالجينات، والليزر خلية التذرية، التقنيات الكهربية، كذلك في فيفو البصرية التصوير4،5. وأسفرت الدراسات الأخيرة خرائط مفصلة للناقل العصبي الرئيسية مما يشير إلى نظم في ايليجانس جيم- بما في ذلك اتروبين والشبكات العصبية جابايرجيك. هذه الدراسات، جنبا إلى جنب مع الدراسات الجارية لتعيين التعبير عن مستقبلات مقترنة بالبروتين ز جميع الخلايا العصبية مكان هذا النموذج في موقع فريد يمكنها من الاستفادة من هيكلية مفصلة للغاية وخرائط اتصال الخلايا العصبية الوظيفية نفهم تماما كيف أن هذه الإشارات العصبية المختلفة عن طريق المستقبلات المختلفة والجداول الزمنية إلى محرك أقراص مختلف جوانب سلوك الحيوانات.
من أجل دراسة أنماط النشاط الخلايا العصبية الحيوية في أي نظام، شرط أساسي لتطوير منهجيات قوية لتسجيل النشاط في الخلايا العصبية الفردية أو دوائر كاملة خلال السلوكيات. أهمية خاصة الانقياد هذه النهج البصرية لتصور النشاط بريسينابتيك الذي يدفع الانصهار حويصلة متشابك. ثورة الصحفيين الفلورسنت سريعة وحساسة للغاية من داخل الخلية Ca2 +، جنبا إلى جنب مع زيادة توافر نظريتهم الحساسة، تسجيل خلية والنشاط متشابك في الحيوانات الحية مستيقظا أثناء السلوك. لأن نتيجة رئيسية للنشاط الكهربائي متشابك لتنظيم قنوات Ca2 + ، والتغييرات في كاليفورنيا داخل الخلية2 + يعتقد أن صدق التقرير التغييرات ذات الصلة سلوكيا في نشاط الخلية.
في هذه الدراسة، نقدم نهجاً لأداء راتيوميتريك Ca2 + تصوير في HSN الخلايا العصبية الحركية التي تشجع على سلوك وضع البيض في6، C. ايليجانس7هرمون السيروتونين. ويستند هذا النهج الجهود السابقة لتصور Ca2 + النشاط في C. ايليجانس وحلبة وضع البيض خلال السلوك5،،من89،10،11 . الأسلوب يسمح في الوقت نفسه الربط بين التغيرات الملاحظة في نشاط الخلية/الدائرة مع وضع البيض الأحداث، فضلا عن التغييرات في حالة الحركية الحيوانية. على الرغم من أننا استخدام هذا النهج لدراسة النشاط في الديدان الكبار، يبين أعمال غير منشورة من مختبرنا هذا النهج يمكن أن تمتد إلى الحيوانات الأحداث في المرحلة (L4) اليرقات الرابعة كذلك. ومن المرجح أن نشاط الخلايا العصبية C. ايليجانس الأخرى التي تعمل في دوائر متميزة والسلوكيات ينبغي أن يكون موجوداً على نحو مماثل مع هذا الأسلوب. المتقدمة الأخرى مؤخرا سريعة Ca2 + المؤشرات غير متداخلة أطياف الانبعاث12،13،14،،من1516، أوبتوجينيتيك أدوات17 ، ووراثيا ترميز المؤشرات الضوئية للغشاء الجهد18، ينبغي أن تسمح لنا بالقيام باختراق 'جميع الضوئية' التحقيقات كيف التغيرات في نشاط الدوائر العصبية تدفع الدول السلوك متميزة.

ratiometric calcium imaging of individual neurons in behaving caenorhabditis elegans

أصبح من الواضح بشكل متزايد أن نشاط الدوائر العصبية في سلوك الحيوانات يختلف إلى حد كبير من أن ينظر في الحيوانات تخديره أو المعطل تداولها. ثورة الصحفيين الفلورسنت حساسة للغاية، وترميز وراثيا من Ca2 + تسجيل خلية ومتشابك النشاط باستخدام النهج البصرية غير الغازية في سلوك الحيوانات. عندما يتم دمجها مع الوراثية وتقنيات أوبتوجينيتيك، الآليات الجزيئية التي تعدل نشاط الخلية والدائرة خلال سلوك مختلفة يمكن التعرف على الدول.
هنا يصف لنا طرق راتيوميتريك Ca2 + تصوير الخلايا العصبية وحيدة في التصرف بحرية الديدان ايليجانس كاينورهابديتيس . نظهر تقنية بسيطة تركيب بلطف كتلة الديدان تراكبات المتزايد على أجار وسائط نمو ديدان أسطوانية (NGM) قياسية مع ساترة زجاجية، السماح للحيوانات التي سيتم تسجيلها في الاستبانة خلال بحرية الحركة والسلوك. مع هذا الأسلوب، نستخدم الحساسة Ca2 + مراسل GCaMP5 لتسجيل التغييرات في داخل الخلية Ca2 + في "الخلايا العصبية المحددة خنثي" هرمون السيروتونين (هسنس) وهم يقودون سلوك وضع البيض. بالمشاركة الإعراب عن مشري، Ca2 +-بروتين فلوري غير حساسة، نستطيع تتبع موقف HSN داخل ~ 1 ميكرومتر والصحيح للتقلبات في الأسفار التي تسببها التغيرات في التركيز أو حركة. تصوير برايتفيلد المتزامنة، والأشعة تحت الحمراء يسمح بتسجيل السلوك وتتبع الحيوانات باستخدام مرحلة إليه. من خلال دمج هذه التقنيات المجهرية والبيانات والجداول، يمكن تسجيل نشاط Ca2 + C. ايليجانس في حلبة وضع البيض كلما تقدمت بين الدول السلوك غير نشطة وفعالة أكثر من عشرات الدقائق.

تركيب بسيط الأسلوب الموصوفة هنا (الشكل 1) يسبب تغيرات طفيفة للبيئة الثقافة L4 والكبار C. ايليجانس بينما يسمح عالية الدقة تسجيل في سلوك الحيوانات من خلال ساترة زجاجية (الشكل 4). المزامنة من مصادر الضوء LED ووحدات تحكم مرحلة التعرض الكاميرا يسمح بالحصول على البيانات من تيارات متعددة في إطارات 20/s ليصل إلى حاء 1 متوسط التكبير (20 x) مع أهداف الفتحة العددية عالية (0.7-0.8) يوفر جيدة القرار المكانية المنطقة متشابك في حلبة سلوك وضع البيض، حتى مع 4 × 4 binning بكسل (1.25 بيكسل ميكرومتر). اكتساب متزامنة من GCaMP5 ومشري fluorescence إشارات (الشكل 4أ، ب) يستخدم لإنشاء قناة نسبة بكسل بكسل التي تعوض عن التغييرات في حركة الحيوانات والتركيز (الشكل 4د). المحطة HSN presynaptic كبيرا كما يمكن تصور العديد من الهيئات الخلايا العصبية في C. ايليجانس، والتغييرات في كاليفورنيا HSN presynaptic2 + وضوح. فوف كبير الكاميرا برايتفيلد الأشعة تحت الحمراء يسمح الدودة يدوياً يجب تعقبها أثناء تسجيل (الشكل 4ﻫ). لكل الحيوانات، يمكن أن يرتبط تغييرات في كاليفورنيا داخل الخلية2 + مع سلوكيات واضحة في تصوير برايتفيلد بما في ذلك الإفراج عن البيض، والتغيرات في الحركة (الشكل 4ه).
ويؤكد كوانتيتيشن HSN Ca2 + وسرعة أن الديدان تغيير هذه الحركة كما أنها تمر بمرحلة انتقالية إلى سلوك وضع البيض. وهناك اختلافات كبيرة في سرعة دودة قبل وأثناء وبعد الحالة النشطة وضع البيض (الشكل 5ألف). لا يحدث هذا بسبب الضوضاء الملازمة للتصوير أو تتبع النظام. التكبير في حدث واحد وضع البيض، نلاحظ قوي التغيير في الأسفار GCaMP5 (ΔF/و) قبل الحدث وضع البيض بينما مشري fluorescence نسبيا دون تغيير (الشكل 5ب). قياس التغيرات في نسبة GCaMP5:mCherry (ΔR/R) تظهر بوضوح كاليفورنيا HSN2 + عابر ~ 4 s قبل الإفراج عن البيض (الشكل 5ب). تزامنت مع تقلص العضلات فرجي، تباطؤ واضح للحركة دودة يحدث أن تنتهي مع البيض الإفراج. وقد أظهرت النتائج السابقة أن اتروبين VC الخلايا العصبية الحركية، التي هي معصب قبل هسنس، وتظهر ذروة النشاط أثناء تقلصات عضلة فرجي قوية والبيض الإصدار 8،،من1027. ونحن قد أظهرت أيضا أن التنشيط أوبتوجينيتيك من الخلايا العصبية الرأسمالي يدفع تباطؤ الفوري للحركة، مما يشير إلى أنه قد يتم تنشيط الخلايا العصبية VC بتقلص العضلات فرجي، وبالتالي تباطؤ الحركة حتى تلقي التغذية المرتدة للإفراج عن البيض27 .
التصوير ووصف نظام تتبع يسمح التصور المكاني المنظمة لسلوك وضع البيض (الشكل 5ج). كما سبق سيظهر، أدخل الديدان يدير المطرد للحركة إلى الأمام فقط قبل الدولة النشط32. الديدان يقضون معظم وقتهم في جمع العلف على البكتيريا في وسط القطعة أجار. قبل دخولها إلى الحالة النشطة، الديدان التحرك بعيداً عن المواد الغذائية، التي تزامنت مع ظهور نادر HSN Ca2 + العابرين. النشاط HSN ثم التحولات في إطلاق الاندفاع، مع عدة HSN Ca2 + العابرين المتقاربة التي تغذي الأحداث وضع البيض. الديدان ثم غالباً ما يستدير واستئناف الحركة إلى الأمام، وتضع بيضها في الطريق إلى الوراء نحو مركزها انطلاق القرب من البكتيريا OP50. ونحن نفترض أن التغييرات المحلية س2 و/أو تركيز CO2 قد يكون التأثير على حيث تقرر الديدان لوضع البيض33،34.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig1.jpg"> الشكل 1. C. ايليجانس تركيب تقنية لتصوير عالي الدقة لنشاط الدائرة وسلوك وضع البيض. في الأعلى، جبل النهائي من الجانب. أسفل، جبل النهائي كما تم عرضه من خلال الجزء السفلي من ساترة كبيرة. تشير الأسهم إلى الغذاء البكتيرية OP50 والديدان C. ايليجانس والبيض، تقع بين القطعة أجار NGM وساترة الكبيرة 24 × 60 مم. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig2.jpg"> الشكل 2 . ويديفيلد راتيوميتريك Ca2 + تصوير وسلوك تسجيل على مجهر مقلوب ابيفلوريسسينسي. (أ) دودة موقف وسلوك يتم التقاطها في برايتفيلد عن طريق 20 × (0.8 غ) هدف الخطة--أبوتشرومات باستخدام الأشعة تحت الحمراء (750-790 nm) الضوء (الأرجواني السهام) المنبعثة من مصباح هالوجين عن طريق القطعة NGM. عصا والمرحلة يجهز وحدة تحكم يستخدم للحفاظ على الدودة في مجال الرؤية أثناء التسجيل. موقف المرحلة (Δx، Δy) يتم إرسالها إلى جهاز كمبيوتر بمنفذ تسلسلي. البروتينات GCaMP5 ومشري المعرب عنها في الدودة متحمسون استخدام 470 نانومتر (الأسهم الزرقاء) و 590 نانومتر (الأسهم الصفراء) "الصمامات الثنائية" التي ينبعث منها الضوء (LED). تنبعث GCaMP5 (الأسهم الخضراء) والأسفار مشري (الأسهم البرتقالية) جنبا إلى جنب مع ضوء الأشعة تحت الحمراء يمر من خلال مرآة مزدوج اللون فرقة متعددة (انظر الجدول للمواد). يرسل الفاصل شعاع من 80/20 20% الضوء من خلال ديماجنيفير 0.63 x لالتقاط على كاميرا CMOS حساسة للأشعة تحت حمراء (أرجواني سهم). يتم إرسال 80 في المائة المتبقية من الضوء عبر هذا الميناء الجانب المجهر إلى صورة الفاصل الذي يفصل في GCaMP5 وفصل الأسفار متشيري إلى نصفين كاميرا سكموس أثناء إزالة الضوء برايتفيلد الأشعة تحت الحمراء. يتم نقل البيانات من كل من الكاميرات إلى جهاز كمبيوتر عبر كابلات USB3. تستخدم منافذ المشغل من الكاميرا سكموس الفلورية (أزرق) لإرسال + 5V TTL مشغلات نظام إضاءة LED وكاميرا CMOS برايتفيلد الأشعة تحت الحمراء، وجهاز اكتساب الرقمية (دق). (ب) الزناد 3 إخراج إشارات TTL يتم الكشف عنها بواسطة دق على رقمي دبوس #8 وإرسالها إلى جهاز الكمبيوتر عبر اتصال USB. تؤدي هذه المدخلات الرقمية 'حيث XY' الأمر المسلسل من نصي برمجيات بونساي (س-المرحلة النهائي) الذي يقرأ X و Y موقف لكل GCaMP5/مشري fluorescence/الأشعة تحت الحمراء صورة القبض على المرحلة. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig3.jpg"> الشكل 3 : تخطيط البرنامج النصي الاتصال التسلسلي-المرحلة المنمنمات XY-المرحلة النهائي. أعلى العقدة ديجيتالينبوت (الوردي) يقرأ TTL المشغلات القادمة إلى دبوس #8 من دق. لكل إيجابية TTL الجهد (الأخضر)، دق يجعل الطابع زمني (الأزرق) وتكتب سلسلة '"حيث س وص"؟' (وردي) على وحدة تحكم المرحلة عبر المنفذ التسلسلي (رمادي). العقدة سيريالسترينجريد (الوردي) يقرأ X و Y تنسق استجابة من وحدة تحكم المرحلة. هذه السلسلة ثم يتم تحويلها إلى ميكرون وفصلها في X و Y إحداثيات المرحلة. وأخيراً، يتم الجمع بين هذه الجداول الأربعة باستخدام عقده الرمز بريدي (أزرق) وتتم كتابة ملف column.csv أربعة: عدد الإطارات TTL الإشارات الواردة (نطاق العقدة، وردي) واحداثيات X و Y، والفاصل الزمني بين تيميبوينتس اللاحقة (عادة ~ 50 مللي ثانية عندما تسجيل معدل 20 هرتز). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig4.jpg"> الشكل 4 : ميكروجرافس الممثل HSN الأسفار وبرايتفيلد كله الحيوان أثناء السلوك وضع البيض. (أ–د) تصوير راتيوميتريك واحد من GCaMP5 ومشري fluorescence في هسنس قبل الإفراج عن البيض. يتم الإشارة إلى HSN presynaptic تيرميني مع رؤوس الأسهم. (ج) دمج GCaMP5 ومشري fluorescence. (د) كثافة التضمين GCaMP5:mCherry نسبة؛ يشير إلى نسبة عالية (أحمر)-عالية داخل الخلية Ca2 + في المحطة بريسينابتيك (ﻫ) صورة برايتفيلد من دودة كاملة فقط بعد أن تم وضع البيض. تشير رؤوس الأسهم إلى النصفين الأمامي والخلفي للفرج من التي تزرع بيض. شريط مقياس لكل الصور هو 50 ميكرومتر. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig5.jpg"> الشكل 5 : تسجيل سرعة HSN Ca2 + والحركة خلال سلوك وضع البيض. (أ) آثار التغييرات نسبة GCaMP5:mCherry في الاستجابة إلى داخل الخلية Ca2 + العابرين (ΔR/R؛ الأحمر) جنبا إلى جنب مع سرعة لحظية دودة (ميكرومتر/s؛ الأزرق). يتم الإشارة إلى الأحداث وضع البيض برؤوس الأسهم. (ب) آثار مشري fluorescence (الأحمر؛ ΔF/F) ونسبة الأسفار GCaMP5:mCherry (أسود؛ ΔR/R)، الأسفار HSN GCaMP5 (الأخضر؛ ΔF/F) والدودة السرعة (الأزرق) حول لحظة الإفراج عن البيض. (ج) المكانية تنظيم سلوك وضع البيض والحركة أثناء تسجيل 10-دقيقة كاملة. تم الحصول على المسار دودة من المعلومات المرحلة XY الذي تمت إضافته إلى موقف centroid HSN التي تم الحصول عليها من تسجيل مشري fluorescence. يتم الإشارة إلى توقيت HSN العابرين (دوائر حمراء)، وأحداث وضع البيض (رؤوس سوداء)، وبداية ونهاية التسجيل (الماس الأخضر والأزرق). هو شريط مقياس 1 مم. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans at JoVE.com

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

يصف هذا البروتوكول استخدام جينياً المرمزة Ca2 + الصحفيين لتسجيل التغييرات في النشاط العصبي في التصرف ايليجانس كاينورهابديتيس الديدان.

تصوير راتيوميتريك الكالسيوم من الخلايا العصبية الفردية في التصرف ايليجانس كاينورهابديتيس

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

ratiometric-calcium-imaging-individual-neurons-behaving

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

11.5K Views.  University of Miami School of Medicine. يصف هذا البروتوكول استخدام جينياً المرمزة Ca2 + الصحفيين لتسجيل التغييرات في النشاط العصبي في التصرف ايليجانس كاينورهابديتيس الديدان.

Video: Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of neurons and circuits requires methods with the spatial selectivity and temporal resolution appropriate for mechanistic analysis of neural ensembles in the behaving animal, i.e. recording of representatively large samples of isolated single neurons. Ensemble monitoring of neuronal activity has progressed remarkably in the past decade in both small and large-brained animals, including human subjects1-11. Multiple-site recording with silicon-based devices are particularly effective because of their scalability, small volume and geometric design.
Here, we describe methods for recording multiple single neurons and local field potential in behaving rodents, using commercially available micro-machined silicon probes with custom-made accessory components. There are two basic options for interfacing silicon probes to preamplifiers: printed circuit boards and flexible cables. Probe supplying companies (<a href="http://www.neuronexustech.com/" >http://www.neuronexustech.com/</a>; <a href="http://www.sbmicrosystems.com/">http://www.sbmicrosystems.com/</a>; <a href="http://www.acreo.se/">http://www.acreo.se/</a>) usually provide the bonding service and deliver probes bonded to printed circuit boards or flexible cables. Here, we describe the implantation of a 4-shank, 32-site probe attached to flexible polyimide cable, and mounted on a movable microdrive. Each step of the probe preparation, microdrive construction and surgery is illustrated so that the end user can easily replicate the process.

We describe methods for large-scale recording of multiple single units and local field potential in behaving rodents with silicon probes. Drive fabrication, probe attachment to the drive and probe implantation processes are illustrated in sufficient details for easy replication.

على نطاق واسع التسجيل من الخلايا العصبية بواسطة مجسات سيليكون المنقول في يتصرفون القوارض

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

الردود الكالسيوم في الخلايا العصبية التصوير GFP الموسومة تحت المهاد البصري من شرائح مخ الفأر

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

الكالسيوم في الجسم الحي التصوير الخلايا العصبية في C. ايليجانس

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

A<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em&gt; النظام النموذجي للدراسات Amylopathy

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Microchambers الاغاروز لفترة طويلة التصوير الكالسيوم من<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse

In vivo real-time monitoring of neuronal activities in freely moving animals is one of key approaches to link neuronal activity to behavior. For this purpose, an in vivo imaging technique that detects calcium transients in neurons using genetically encoded calcium indicators (GECIs), a miniaturized fluorescence microscope, and a gradient refractive index (GRIN) lens has been developed and successfully applied to many brain structures1,2,3,4,5,6. This imaging technique is particularly powerful because it enables chronic simultaneous imaging of genetically defined cell populations for a long-term period up to several weeks. Although useful, this imaging technique has not been easily applied to brain structures that locate deep within the brain such as amygdala, an essential brain structure for emotional processing and associative fear memory7. There are several factors that make it difficult to apply the imaging technique to the amygdala. For instance, motion artifacts usually occur more frequently during the imaging conducted in the deeper brain regions because a head-mount microscope implanted deep in the brain is relatively unstable. Another problem is that the lateral ventricle is positioned close to the implanted GRIN lens and its movement during respiration may cause highly irregular motion artifacts that cannot be easily corrected, which makes it difficult to form a stable imaging view. Furthermore, because cells in the amygdala are usually quiet at a resting or anesthetized state, it is hard to find and focus the target cells expressing GECI in the amygdala during baseplating procedure for later imaging. This protocol provides a helpful guideline for how to efficiently target cells expressing GECI in the amygdala with head-mount miniaturized microscope for successful in vivo calcium imaging in such a deeper brain region. It is noted that this protocol is based on a particular system (e.g., Inscopix) but not restricted to it.

In vivo microendoscopic calcium imaging is an invaluable tool that enables real-time monitoring of neuronal activities in freely behaving animals. However, applying this technique to the amygdala has been difficult. This protocol aims to provide a useful guideline for successfully targeting amygdala cells with a miniaturized microscope in mice.

ناجحة في التصوير الكلسيوم الجسم الحي مع المجهر Miniaturized الرأس جبل في Amygdala من الماوس تتصرف بحرية

In vivo real-time monitoring of neuronal activities in freely moving animals is one of key approaches to link neuronal activity to behavior. For this ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

في الجسم الحي تصوير الكالسيوم في الزيتون السفلي الماوس

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are specialized sites of synaptic innervation modulated by activity and serve as substrates for learning and memory. Recently, dendritic spines have been described for DD GABAergic neurons as the input sites from presynaptic cholinergic neurons in the motor circuit of Caenorhabditis elegans. This synaptic circuit can now serve as a powerful new in vivo model of spine morphogenesis and function that exploits the facile genetics and ready accessibility of C. elegans to live-cell imaging. 
This protocol describes experimental strategies for assessing DD spine structure and function. In this approach, a super-resolution imaging strategy is used to visualize the intricate shapes of actin-rich dendritic spines. To evaluate the DD spine function, the light-activated opsin, Chrimson, stimulates the presynaptic cholinergic neurons, and the calcium indicator, GCaMP, reports the evoked calcium transients in postsynaptic DD spines. Together, these methods comprise powerful approaches for identifying genetic determinants of dendritic spines in C. elegans that could also direct spine morphogenesis and function in the brain.

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are important cellular features of the nervous system. Here live imaging methods are described for assessing the structure and function of dendritic spines in C. elegans.&#160;These approaches support the development of mutant screens for genes that define dendritic spine shape or function.

تصوير العمود الفقري التغصني في Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are specialized sites of synaptic innervation modulated by activity and serve as substrates for learning and memory. Recently, dendritic ...

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed orientation. Here we describe methods to label, image, and analyze the microtubule dynamics and growth during the development and regeneration of touch neurons in C. elegans. Using genetically encoded fluorescent reporters of microtubule tips, we imaged the axonal microtubules. The local changes in microtubule behavior that initiates axon regeneration following axotomy can be quantified using this protocol. This assay is adaptable to other neurons and genetic backgrounds to investigate the regulation of microtubule dynamics in various cellular processes.

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

A protocol for imaging the dynamic microtubules in vivo using fluorescently labeled End binding protein has been presented. We described the methods to label, image, and analyze the dynamic microtubules in the Posterior lateral microtubule (PLM) neuron of C. elegans.

في الجسم الحي تقييم ديناميات Microtubule والتوجه في Caenorhabditis elegans الخلايا العصبية

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...