עבודה זו מומן על ידי מענק מ NINDS KMC (R01 NS086932). LMN נתמך על ידי מענק של התוכנית NIGMS IMSD (R25 GM076419). זנים השתמשו במחקר זה C. elegans מרכז הגנטיקה, אשר ממומן על ידי משרד NIH תוכניות תשתית מחקר (P40 OD010440). אנו מודים ג'יימס בייקר, מייסון קליין על דיונים מועילים.

1. זנים, תרבות בתקשורת, ואני הולכת וגוברת של בעלי חיים
<ol><li>לגדול בתולעים המוטנטיות ב 20 מעלות צלזיוס על תקן 60 מ מ בינוני צמיחה תולעים נימיות (NGM) אגר צלחות עם מזון חיידקי e. coli . OP5019.</li>
	<li>להתכונן פלסמידים 2 כל יזם תא ספציפי של עניין: אחד, נהיגה הביטוי של GCaMP5 כדי להקליט תאיים Ca2 +, ואת השני, נהיגה הביטוי של mCherry כדי לאפשר רציומטרי כימות של שינויים זריחה GCaMP5 ו לפשט את מציאת האובייקט ומדידה. הערה: מתקן הדמיה רציומטרי GCaMP5:mCherry על תנודות GCaMP5 זריחה הנובעים מביצוע שינויים בתנועה המוקד של בעלי חיים, שינויים לא בפועל ב Ca תאיים2 +.</li>
	<li>מזריקים GCaMP5 - ו mCherry-ביטוי פלסמידים יחד עם פלסמיד סמן הצלה גלויה pL15EK לתוך הגונדות של LX1832 lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X חיות מוטציה ולשחזר חיות lin-15(+) הלא-Muv לבטא GCaMP5 ו mCherry מ- high-עותק transgene20,21,22. השתמש ברקע מוטציה לייט-1 אור כחול הימנעות התנהגות23,24.</li>
	<li>שלב transgenes כדי כרומוזומים כדי להפחית פסיפס ולפשט את הדור של זנים מוטציה מתחם25. הערה: המתח LX2004 המתוארים כאן נושא transgene גבוהה-העתק של משולב, המבטאת GCaMP5 ו- mCherry, HSNs של האמרגן nlp-3 (ראה טבלה של חומרים)26,27, 28 , 29. האמרגן nlp-3 נמצא ביטוי חזק כונן HSNs של L4 מאוחר ובעלי למבוגרים ללא גרימת פגמים משמעותיים HSN פיתוח או התנהגות להטלת ביצים, בהשוואה היזמים האחרים שנבדקו (e.g.,tph-1. egl-6ו- unc-86). זן זה ואחרים לבטא GCaMP5 ו- mCherry הגחוני כבל (VC) מוטורי לגלוקוז, שרירי vulval, וכן תאים נוירואנדוקריניים uv1 הינם זמינים מן המרכז גנטיקה Caenorhabditis , הפרטים של הבנייה שלהם תוארו 27.</li>
	<li>החל OP50 חיידקי מזון מן צלחת אגר NGM הזריעה לתחתית של תולעת פלטינה לבחור, ולהשתמש בו כדי להעביר ~ 20 חיות L4 LX2004 מאוחר לבטא GCaMP5 ו- mCherry, HSNs של האמרגן nlp-3 . ודא כי הפות המתפתח מופיע ב- stereomicroscope כמו כתם כהות מוקף סהר לבן. דגירה חיות ב- 20 ° C עבור h 24-40.</li>
	<li>לאחר הדגירה, להחיל את OP50 על האיסוף והעברת ~ 3 של התולעים על צלחת NGM unseeded, להשאיר כמות קטנה של אוכל. מאחורי לתולעים להאכיל על במהלך דימות. להבטיח מספיק אוכל, מזון חיידקי מעט מדי תעודד את התולעים להתרחק ממרכז הצלחת בזמן יותר מדי אוכל להגדיל את רקע זריחה ולגרום היפוקסיה.</li>
	<li>להשתמש במרית שטוחה מעוגלים כדי לחתוך ~ 20 מ מ x 20 מ מ צ'אנק מהצלחת נושאת את התולעים ולהעביר את צ'אנק, פנים כלפי מטה במרכז coverslip נקי 24 מ"מ x 60 מ"מ #1.5 (איור 1). הפעל את היישום מצד אחד למנוע בועות להיות לכודה תחת coverslip ו מתערב עם הדמיה. החל coverslip של 22 מ"מ x 22 מ"מ #1 לחלק העליון של גוש כדי להפחית דבק ואת אידוי.</li>
</ol>2. החומרה וההתקנה אינסטרומנטציה
<ol><li>מקם את בשלבים, תולעים הטרנסגניים לבמה של מיקרוסקופ הפוך עם ≥ 0.7 מספרי הצמצם תוכנית-עדשה אפוכרומטית 20 x אובייקטיבי, ממונע XY הבמה לשליטה באמצעות ג'ויסטיק, מפצל תמונה ו קרינה פלואורסצנטית מסננים עבור GCaMP5 בו זמנית, mCherry עירור פליטה, מצלמות brightfield קרינה פלואורסצנטית ואינפרא הדמיה, מערכת תאורה דיודות פולטות אור (LED) triggerable (איור 2א). הערה: 80/20 קרן-ספליטר שולח 80% של האות תמונות עם המצלמה פלורסצנטיות ו-20% על המצלמה brightfield. ניתן להשתמש במיקרוסקופ זקוף, אך גוש NGM צריך להיות ממוקם בין זכוכית את coverslip גדול במקרה זה.<ol>
<li>השתמש עיניות המשקפת את לבחירת תולעת עבור הדמיה. כשבוחרים חיה, להחליק את מסנן האינפרא-אדום במקום מעל מעבה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>טרנזיסטור-טרנזיסטור לוגיקה (TTL) מפעילים<ol>
<li>לחבר כבלים קואקסיאליים מכל שלושת TTL ההדק פלט הקווים על המצלמה זריחה. לחבר את הפלט הראשון לקלט BNC #3 של מערכת תאורה LED.</li>
		<li>התחבר הפלט השני למתאם 'בננה' BNC עם ירוק, חום חוטים מהמחבר GPIO 8 פינים רץ GPIO קלט #3 (pin 4) ואת הקרקע (pin 5) של מצלמה אינפרא-אדום, בהתאמה.</li>
		<li>הפלט השלישי מתאם BNC 'בננה' עם מגשר חוטים רץ לכניסה דיגיטלי #8 על הקרקע במכשיר רכישה דיגיטלית (איור 2B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>המכשיר רכישת דיגיטלי (DAQ)<ol>
<li>חבר מועצת המנהלים של מיקרו-בקר DAQ (ראה טבלה של חומרים) למחשב באמצעות כבל USB. לעדכן את הקושחה עם תקן Firmata פרוטוקול (ראה טבלה של חומרים) ולהגדיר את יציאת ה-USB כדי לתקשר-57600 באוד.</li>
	</ol>
</li>
	<li>נוריות<ol>
<li>להפעיל את התוכנה LED בקר (ראה טבלה של חומרים). לעבור את מפעיל מצב של 'רציף ועד 'מגודרת' בחר גורם מפעיל ערוץ ' 3' עבור שניהם 470 ו 590 nm נוריות.</li>
		<li>הפעל והזן LED כוח עבור כל LED (למשל, סט 470 ננומטר LED 20%, ה-LED nm 590 ל-40%).</li>
	</ol>
</li>
	<li>הפעל את קובץ ה-script 'XY-שלב-גמר' בונסאי (ראה טבלה של חומרים) תקשורת טורית-שלב30. לחץ על הצומת 'CsvWriter' אפור ובחר תיקיה לשמור שנרשמו X ו- Y שלב מידע (איור 3). הקש על החץ הירוק בסרגל הכלים כדי לאתחל את DAQ. הערה: קובץ ה-script יתחיל להקליט את מיקום הבמה X ו- Y כאשר המצלמה פלורסצנטיות שולח אות TTL. קובץ script זה פלטי ארבע עמודות של נתונים: מסגרת מספר, X עמדה (מיקרומטר), מיקום Y (מיקרומטר) ו את מרווח הזמן בין מסגרות (s).</li>
	<li>מצלמה אינפרא אדום הקלטה תוכנה (ראה טבלה של חומרים) תחת "מצבי וידאו מותאם אישית," בחר "מצב 1" (2 x 2 binning; 1,024 x 1,024 פיקסלים), ואת "פיקסל בפורמט Raw 8". תחת ' המפעיל / Strobe', הגדר את ההדק קו הקלט (GPIO) 3, קוטביות 'גבוהה', 'מצב' "14". לעבור 'אפשר' תפסיק מסגרת רכישה עד קבלת אות ההדק TTL.<ol>
<li>עוזב את החלון פתוח, לחץ על הכפתור האדום "שיא" בסרגל הכלים תצוגת המצלמה הראשית. בחר את התיקיה עבור רצפי תמונות להינצל. בחר 'Buffered' הקלטה במצב ושמור 'תמונות' בתבנית JPEG. לחץ על "התחל הקלטה" לאתחל את הרכישה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מפצל מצלמה ותמונה קרינה פלואורסצנטית הערה: GCaMP5 וערוצי זריחה mCherry יש לאסוף בו זמנית כדי להבטיח תמונה נכונה ההרשמה רציומטרי כימות. הפיצול התמונה מאפשר רכישת שני ערוצים של זריחה GCaMP5 ו- mCherry על גבי חיישן אחד.<ol>
<li>בכרטיסיה 'ללכוד' של התוכנה רכישת התמונה (ראה טבלה של חומרים), זמן החשיפה set כדי 10 ms, binning 4 x ולאחר עומק תמונה 16 סיביות. בחר subarray של המצלמה ממורכז של 512 פיקסלים לרוחב על 256 פיקסלים גבוהה. לחצו על 'הצג פלט להפעיל אפשרויות' וקבעו כל המפעילים כדי 'חיובית'. הערה: DAQ יכול מדי פעם לפספס גורמים מפעילים TTL אם הם 10 ms או פחות.</li>
		<li>ודא 'המפעיל 1' ו- 'המפעיל 2' הם 'חשיפה' ואילו 'מפעיל 3' מוגדר כ- 'לתכנות' עם 'תקופה' של גב' 25 תחת הכרטיסייה 'רצף', בחר 'זמן לשגות' עם 'Delay1 שדה' של 50 מילישניות לאסוף תמונות ב- 20 הרץ. בחר באפשרות 'שמור למאגר זמני.'</li>
	</ol>
</li>
	<li>PMT לקבל, לייזר בעוצמה במהלך דימות קונאפוקלית ערוץ 3<ol>
<li>הגדר את רווח PMT כך הרקע הוא ברמה ממש מעל המינימום (רמת השחור). להגדיל את עוצמת הלייזר (ירוק) nm 561 עד פיקסל 12 סיביות או 16 סיביות רווי בודד נצפית התחנה הסופית presynaptic בערוץ mCherry.</li>
		<li>להתאים 488 ננומטר לייזר (כחול) עוצמת כך GCaMP5 הוא גלוי רק בקצהו presynaptic מעל הרקע. הגדרה נמוכה זו מונעת את הרוויה של הפיקסלים GCaMP5 כאשר קרינה פלואורסצנטית שמגביר בתגובה חזקה Ca2 + תופעות מעבר. פתח את חריר קונאפוקלית כל הדרך כדי למקסם ללכוד אור.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. רציומטרי Ca2 + הדמיה והקלטה התנהגות
<ol><li>תחת לשונית 'רצף' בתוכנה רכישה פלורסצנטיות, לחץ על "התחל" כדי להתחיל את ההקלטה. מסלול התולעת עם הג ' ויסטיק, שומר את תא (ים) ואת הסינפסות עניין בפוקוס ועל במרכז שדה הראייה (FOV). לחץ על לחצן 'סטטיסטיקה' בחלון היסטוגרמה להראות פיקסל סטטיסטיקה של כל ערוץ.</li>
	<li>להתאים את הכוח LED כדי להבטיח פלורסצנטיות מרבי mCherry פיקסל בודד-התחנה הסופית presynaptic של ≥ 8,000 סעיפים (~ 4,000 photoelectrons), נתינה ~ 12 סיביות טווח דינמי מעל הרקע (~ 100 photoelectrons). אותות GCaMP5 התחנה הסופית presynaptic במהלך מנוחה Ca (נמוך)2 + צריך להיות סביב ~ נחשב 2,500 - רק בחציו רקע.</li>
	<li>להקליט עד למצב פעיל להטלת ביצים אחד; זה מתרחש בדרך כלל כל 20-30 דקות ב- פראי-סוג תולעת7. שמור ערכת משנה 10 דקות (מסגרות 12,001), מסגרות 6,000 לפני ואחרי להטלת ביצים האירוע הראשון (מסגרת 6,001). הקפד לשמור את המשנה זהה של brightfield תמונות של תולעת ההתנהגות ואת timepoints של XY הבמה עמדה, או הסינכרון מדויק של זרמי נתונים יאבדו.</li>
	<li>השתמש ImageJ את התוסף BioFormats (ראה טבלה של חומרים) כדי להמיר רצפי תמונות בפורמט תמונה Cytometry רגיל (.ics) כך זה ניתן לייבא לתוך התוכנה רציומטרי כימות.</li>
</ol>4. התמונה פילוח וניתוח כמותי
<ol><li>רצפי תמונות לייבא התוכנה כימות רציומטרי (ראה טבלה של חומרים). לחץ על 'ניגוד אוטומטי' בתפריט 'כלים', והתאם את החדות של כל אחד מערוצי להקים שחור המתאים (~ 1,800) ולבן רמות (10,000). בחר 'שינוי הצבעים...' בתפריט כלים כדי לוודא ש- mCherry ו GCaMP5 ערוץ הקצאות צבעים הם הנכונים (איור 4א - ג).<ol>
<li>לחץ לחיצה ימנית על סדרת הזמן בכרטיסיה 'רצף' ולהגדיר אותו 20 מסגרות/s ו- 1.25 מיקרומטר לפיקסל.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בחר 'יחס' בתפריט 'כלים' ובחרו "GCaMP5" עבור "ערוץ A" ו- "mCherry" עבור 'ערוץ B'. לחץ על "חשב" ליד 'סף' כדי לחסר את הרקע של כל רצף תמונות. בחר "החל קשת LUT לערוץ יחס". הערה: לצורך הקלטה עם יחס אכזרי בסיסית של 0.3 (נמוך Ca2 +), יחס מקסימום של 2-3 (גבוהה Ca2 +), טבלת בדיקת מידע מתאים יהיה בין 0 (כחול) 1 (אדום).</li>
	<li>ליצור ערוץ עוצמת מאופנן יחס באמצעות תעלת mCherry (איור 4D). ערוץ עוצמת מאופנן יחס היא תמונה מיליונים-של-צבעים שבו הצבע יחס ממופה על הבהירות של הערוץ mCherry.</li>
	<li>תחת לשונית 'המידות', ליצור פרוטוקול למציאת אובייקט על-ידי גרירת הכלי 'למצוא אובייקטים באמצעות עוצמת' לחלונית 'פרוטוקול'. לחץ על 'קוג' כדי להגדיר החלון של mCherry ערכי העוצמה ולמצוא את האובייקטים.<ol>
<li>בחר בעוצמה ערכים ≥ 2 סטיות תקן (SD) מעל הרקע (למשל, הגבול התחתון של ~ 2,500, הגבול העליון של 65,535). ודא הסופית presynaptic מזוהה זה 'באופן אוטומטי עדכון משוב' נבחרה בתפריט מדידות. הערה: התוכנה יכולה גם לזהות עצמים לפי סטיית תקן שלהם רקע באמצעות פרוטוקול קשורים 'עוצמת SD.' עם זאת, אם אובייקט בהיר במיוחד נכנסת של FOV, זה יכול באופן דרמטי עוצמת רשע במהלך שינוי timepoints האלה, המשפיעים על המכנסונים עוצמת נהגה למצוא את HSN. ההשתנות לא יתרחש אם ערכי העוצמה raw משמשים כדי למצוא חפצים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להוסיף מסננים נוספים מיקוד רק בערוץ mCherry (גודל, עוצמה מקס, וכו ') במידת הצורך לא לכלול אובייקטים לא רצויים כמו ראש, זנב, בטן זריחה. בחרו 'לבצע מדידה פריט' מתפריט מדידות ובחרו 'Timepoints כל.' הערה: זה תתבצע הפרוטוקול, לכתוב כל המדידות קובץ ערך מופרד באמצעות פסיק (. csv) לייצא באמצעות הפקודה 'ייצוא' מתפריט ' קובץ '.</li>
	<li>פתח קובץ exported.csv והעתק Timepoint, אזור (2מיקרומטר), אומר (יחס ערוץ), Centroid X (מיקרומטר) ונתונים Centroid Y (מיקרומטר) לתוך גיליון חדש. ייצוא קובץ a.csv ללא כותרות עמודה. התוכנה רציומטרי כימות עשוי לסווג תא עניין בתור אובייקט אחד או יותר לכל timepoint.<ol>
<li>כדי נגרם אובייקטים אלה, השתמש סקריפט מותאם אישית 'AnalzyeGCaMP_2017.m'. הערה: קובץ ה-script גם מזהה Ca2 + (יחס) פסגות בנתונים, ושומר a.csv קובץ של timepoints שלהם, amplitudes שיא שיא רוחבי. זה גם מייצר קובצי postscript עקבות יחס raw, המבואר. בעזרת מידע זה, Ca2 + ארעי משרעת ומרווח בין-ארעי צריך להיקבע.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הוסף פלט X וערכי Y centroid מכל אובייקט זריחה על הערכים X ו- Y הוקלט על ידי סקריפט XY-שלב של בונסאי. השתמש המיקום XY נטו כדי ליצור עקבות ומכניקה תולעת לחשב הזחה תא והמהירות המלוות התנהגות שונה הברית31.</li>
	<li>לייבא את התמונות מוקלט brightfield ImageJ כמו ערימה וירטואלי. הוספת ביאורים אירועים להטלת ביצים, התנהגויות אחרות. להשוות את התזמון של אירועים אלה Ca2 + פסגות מהעקבות יחס.</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים קיימים.

Transgenes:
משום mCherry ביטוי שופרה דרך הכניסה codon-אופטימיזציה ואינטרון (ויש עיתונאים GCaMP הזמינה ביותר לא), להזריק ~ 4 x כמות פלסמיד מביע GCaMP5 כדי להבטיח רמות דומות של זריחה GCaMP5 במהלך Ca חזק 2 + תופעות מעבר. חילוץ של המוטציה lin-15(n765ts) מאפשר התאוששות נתיישב של חיות הטרנסגניים עם תופעות מינימליות להטלת ביצים ואת שאר התנהגויות35. Transgenes צריך להיות משולב כדי להבטיח תנאים בין בעלי חיים שונים25ביטוי אחיד והדמיה. סמני לבחירה כולל עמידות לאנטיביוטיקה36,37 והצלה של lethals הרגיש38 צריך גם לעבוד, אלא, משום שאינם הטרנסגניים בעלי חיים מתים, אישור של אינטגרציה transgene ו homozygosity קשה יותר בהשוואה סמני שמציגים של פנוטיפ גלוי25. סמנים דומיננטי לשבש ומכניקה נורמלי ולא להקטין כושר, כגון rol-6(dm), צריך להיות נמנעה39. הדמיה לייט-1 רקע מוטציה חיוני כדי להפחית את הבריחה אור כחול תגובות במהלך23,הדמיה40,41. מוטציה נוספת של גור-3, הפועל במקביל ל- lite-1, אפשר להוסיף ולצמצם את התנהגות שיורית ושינויים פיזיולוגיים הנגרמת על ידי אור כחול42. בנוחות, גור-3 lite-1, לין-15 כולם ממוקמים על החצי נכון של כרומוזום X, אשר צריך לפשט הבנייה של זנים חדשים עבור Ca2 + הדמיה וניסויים optogenetic.
מכיוון פעמים חשיפה קצרה תמונות נאספים ב 20 הרץ, GCaMP5, mCherry אותות חייב להיות בהיר. ההסבר הסביר ביותר עבור Ca רועש2 + הקלטות הוא עמום פלורסצנטיות הנגרמת על ידי ביטוי עיתונאי חלש. היזמים צריכים להיות גם סביר ספציפי עבור האזור להיות עם תמונה. בגלל HSN תא ובגוף הסינפסות על השרירים vulval במרכז הגוף, ביטוי נוסף מ האמרגן nlp-3 בראש וזנב בדרך כלל בחוץ שדה הראיה, יכול ייכללו שימוש במסננים נוספים ב- תוכנה רציומטרי כימות. כדי להבטיח כי נצפו שינויים GCaMP5 קרינה פלואורסצנטית כתוצאה משינויים בפועל Ca תאיים2 +, transgenes שליטה לבטא GFP במקום GCaMP5 כדאי להיערך באופן עצמאי וניתח26. Ca2 + כתבים חדשים עם שונה Ca2 + רגישויות, קינטיקה וצבעים הרחיבו את הבחירה של הדמיה כלים זמינים, אך כל הכתב החדש לאמת באמצעות Ca2 +-variant פלורסנט רגישות14 ,16.
מדיה:
NGM לוחות עבור הדמיה צריך להיות מוכן עם אגר באיכות גבוהה. אגר באיכות נמוכה לא יימס לחלוטין על autoclaving, עוזב את פיזור האור במהלך דימות, והגברת רקע זריחה חלקיקים קטנים. ביולוגיה מולקולרית כיתה agarose יכול לשמש במקום, אבל צריך להיות מופחת הסכום הוסיף כדי לשמור על צלחת המקביל מוצקות.
השוואות לשיטות אחרות הרכבה:
גישות הקודם תמונת פעילות המעגל ההתנהגות להטלת ביצים השתמשו תולעים עם הדבק אל רכיב pad agarose. מרותק למיטה. תחת תנאים אלה, פעילות מעגל ההתנהגות להטלת ביצים אינה המועדף ללא ירידה תרבות המדיה osmolarity8,10,44,45. ממצאים אחרונים מעידים כי מספר התנהגויות תולעת הם מווסת על ידי המדינה גפיים, העלאת שאלות על מערכת היחסים של פעילות התאים שנצפה בחיות קיבוע כי ראיתי בחיות מתנהגות באופן חופשי. אנחנו הראו לאחרונה כי פעילות מעגל להטלת ביצים באופן בלתי צפוי בהדרגה עם גפיים26,27. באופן דומה, ממודר Ca2 + איתות ב interneuron ריאה משלבת פעילות נוירונים סנסוריים, ראש מוטורי לגלוקוז במהלך שיחור מזון בתנועות46. התנהגות מפיסורה מלווה גם שינוי מדויק, סטריאוטיפית ומכניקה המאפשר לבעלי תעבור מקומם הרעיה לפני סילוק פסולת47. יחד, תוצאות אלה מראים כי הקלטות קצרה של מעגל הפעילות מחיות קיבוע עשוי להיות שונה בתכלית מכל אלה בשנת בחיות מתנהגות באופן חופשי.
למרות היותו ישירות מתחת coverslip, ההתנהגות של התולעת דומה אליו לראות את לוחות NGM סטנדרטי. ביצים הניח תמשיך לבקוע, ומאפשר כמות קטנה של אוכל להפקיד את הזחלים L1 לגדול לתוך מבוגרים (נתונים לא מוצג). גודל גוש גדול אגר מאפשר חילוף הגזים סבירה, המתנגד התייבשות, למרות יותר מדי אוכל יגדל רקע זריחה. אמנם שיטה זו פועלת הטוב ביותר עבור מבוגרים, הטכניקה גם ניתן לבעלי L4 התמונה. עם זאת, עובי השכבה המימית בין גוש של coverslip הוא כזה זחלים קטנים יותר יש קושי זוחל, יכול לעיתים קרובות להילכד בעקבות של מבוגר נע.
מגבלה של טכניקה זו הרכבה הוא כימי מכניים או גירוי ישיר לאזורים מדויקים של הגוף הוא קשה. התפתחויות בטכניקות תאורה בדוגמת מאפשרים את עירור נפרד של הראש או הביע את הזנב opsins חיידקים עם תאורה נפרדים וזיהוי של GCaMP/mCherry זריחה ב- the midbody48,49. כתוצאה מכך, ייתכן שתהיה אפשרות להתגבר על בעיה זו באמצעות גישות optogenetic.
השוואות ל Ca אחרים 2 + הדמיה גישות:
שיטה זו עובדת היטב עבור הקלטה שינויים cytoplasmic Ca2 + של יחיד, נפתרה תאים ואזורים הסינפטית שלהם. הדמיה בזמן אמת, נפח של נוירונים בראש לאחרונה הושגה באמצעות המיקום של גרעין התא עבור זיהוי תא, quantitate לשינויים סידן nucleoplasmic50,51,52. היחסים בין גרעינית, סינפטית Ca2 + עדיין לא ברור. הנתונים שלנו להציע שהשינויים הבולטים HSN תאיים Ca2 + מתרחשים טרמיני presynaptic הרחק סומה תא (איור 4D). טרמיני presynaptic של HSN, הנוירונים VC מוטבעות postsynaptic שרירי vulval26. לא ברור אם יהיו מספיק רזולוציה בממד Z אפילו עם ספינינג דיסק או טכניקות אור גיליון לייחס presynaptic Ca2 + אותות תאים ספציפיים מבלי להסתמך בצורה כלשהי על סידן סומאטית לזיהוי תא . תוך שימוש בטכניקות המתוארות כאן, כל 10 דקות, שני ערוצים הקלטה עם 12,001 256 x 256 פיקסלים 16 סיביות TIFF תמונות ~ 4 ג'יגה-בתים. היחס מאופנן יחס ועוצמה ערוצי כפול גודל הקובץ כדי ~ 8 ג'יגה-בתים. ניסוי טיפוסי הקלטה 10 חיות מכל שני אחרים (פראי-סוג, ניסיוני) יוצר כמעט 150 ג'יגה-בתים של נתונים עיקריים ודורשת 20 h לאסוף ולנתח. ניתוחים volumetric עם 10 פרוסות Z לכל timepoint ידרוש בסדר גודל יותר נתונים וזמן אנליטית, שמסביר למה כל כך מעט מחקרים כאלה הושלמו.
חומרה:
אנחנו לתעד ולנתח רצפי תמונות בתחנות מעבד כפול עם ביצועים גבוהים וכרטיסים גרפיים (למשל, המשחקים), 64 ג'יגה-בתים של זיכרון RAM, וכונני solid-state ביצועים גבוהים (ראה טבלה של חומרים). הנתונים צריכים להיות המאוחסנים ברשת מערך יתיר של דיסקים עצמאיים (RAID), גיבוי לענן-מרכז נתונים מחוץ לאתר.
אנו ממליצים על שימוש ובעוצמת ממוקדת נוריות עבור עירור קרינה פלואורסצנטית פעמו halide ממתכת או מבוסס כספית מקורות אור. מספר מערכות LED צבע רב זמינים מסחרית זמינים. בעוד כמה מהמערכות הללו LED יש עלות גבוהה יותר מראש, הם חיים ארוך (> 20,000 h), יכולים בו זמנית לרגש ארבעה או יותר fluorophores שונים, ולהציע שליטה טמפורלית מדויקת באמצעות סדרתי ו/או TTL ממשק עם השהיה נמוכה (10-300 µs לעבור זמן). מפעילה מבטיחה כי המדגם מואר רק כאשר נתונים למעשה הנאספות. אנו משתמשים בדרך כלל חשיפה של 10 ms כל 50 מילישניות (20% שיעור חובה). זה מפחית phototoxicity, טשטוש תנועה במהלך לכידת תמונה, כפי שדווחה בעבר43.
אנו משתמשים sCMOS מצלמות מהירות, מערך גדול של פיקסלים קטנים, רגיש. מצלמה EM-CCD הוא חלופה יותר יקר, אבל אפקטים 'לפרוח' יכול לגרום photoelectrons שנתפסו לשפוך לתוך פיקסלים סמוכים. מצלמות sCMOS בחזרה מואר חדשות יש רגישות דומה של EM-CCDs במחיר מוזל משמעותית. בלי קשר חיישן אשר משמש, הערוצים GCaMP5 ו- mCherry יש להשיג בו זמנית. לכידת רציפים במעבר תולעים תוביל לתמונות לקוי רשום מתאים רציומטרי כימות. ערוץ כפול הדמיה יכול להתבצע לתוך מצלמה אחת לאחר פיצול של ערוצים באמצעות הפיצול של התמונה (איור 2) או באמצעות שתי מצלמות זהים. הטווח הדינמי של 16 סיביות תמונות מומלץ על רקע תמונות של 8 סיביות עבור כימות מדויק רציומטרי. לתמונות brightfield של אופן פעולה של תולעת, תופסים בעזרת מצלמה USB3 in 1. 4.1-סגול MP כדי ללכוד גדולים 2 x 2 רצפי תמונות 8 סיביות 1,024 x 1,024 נשברתי לאחר דחיסת JPEG. FOV גדול יותר זמין על הדגמים המיקרוסקופ מאפשר של התולעת הבוגרת ניתן לאבחן ב- 20 x לאחר 0.63 x demagnification עם רק קלה פינות כהות (איור 4E).
אנו ממליצים להשתמש אותות מתח אורך חיים רגיל כדי לסנכרן תאורה ו לכידת מסגרת. בגלל השהיות פוטנציאליים בתוכנות שונות, מומלץ למשתמשים להגדיר המצלמה פלורסצנטיות עם ההדק פלטי כמאסטר עם תפוקות TTL נהיגה כל ההתקנים האחרים. בדרך זו, brightfield ומידע מיקום הבמה ייאספו למדידה כל2 + Ca.
שסע - או תהודה לסריקת נקודת קונאפוקלית מיקרוסקופים נמצאו בדרך כלל מתקנים קונאפוקלית משותפים גם לתת ביצועים מצוינים במהלך רציומטרי Ca2 + הדמיה. כלי כזה יכול לשמש כדי ללכוד שניים או יותר קרינה פלואורסצנטית ערוצים יחד עם brightfield24. במקרה זה, חריר קונאפוקלית אמור להיפתח כדי הקוטר המרבי שלה, גלאי ספקטרלי אמור לשמש כדי להפריד בין GCaMP5 mCherry, אותות אינפרא-אדום brightfield. זה הגדלת אוסף אור מ עבה (~ 20 מיקרומטר) פרוסה תוך מתן אפשרות דחייה של out-of-להתמקד זריחה. אחת החיסרון הוא של FOV קטנים יותר, מגבלות נוספות עבור התאמה אישית חומרה ותוכנה.
תוכנה:
רוב היצרנים הספינה ולהתקין מצלמות ומיקרוסקופים שלהם בתוכנה קניינית, כולל תצורת מפעילה כניסות ויציאות. התכונות והביצועים של תוכנה זו במהלך ההקלטה יכול להשתנות. כי עובר מהר תולעים עשויה להיות מאתגרת כדי לעקוב אחר, תמונה תצוגה במהלך ההקלטה צריך להיות חלקה ויציבה ב 20 הרץ. כדי לשפר את הביצועים, רצפי תמונות ניתן באופן זמני לשמור בזיכרון RAM עם קבוצות משנה בהתנהגותו הרלוונטיים הצילה בסוף הניסוי. קבצים אלה רצף תמונות בשני ערוצים ניתן להמיר לתבנית תמונה Cytometry הסטנדרטית פתוחה (.ics) עבור ייבוא לתוך התוכנה רציומטרי כימות. הביתה-TIFF הוא פורמט פתוח תמונה עדכנית יותר, למרות התקנות שונות עשויים להיות מסוגל להציל את רצפי תמונות TIFF גדול מ- 4 ג'יגה-בתים.
תכונה מרכזית של הצינור כימות הוא הדור של הערוץ יחס ולאחר מכן שגרת פילוח מוטים התמונה באמצעות קרינה פלואורסצנטית mCherry כדי למצוא תאים עניין. מכל אובייקט מצאה, את גודל אובייקט העמדה centroid XY, המינימום, כלומר, מחושבים ערכי העוצמה פלורסצנטיות המרבי לכל ערוץ (כולל את הערוץ יחס). יחד, ערכים אלה משמשים quantitate שינויים תאיים Ca2 + על כל timepoint בהקלטה. מידות האובייקט עבור כל timepoint ואז מיוצא כקובץ a.csv עבור ניתוחים שלאחר מכן.
מגבלה משמעותית של הפרוטוקול המתואר כאן הוא התלות העברת הנתונים בצורות שונות באמצעות טלאים של מוצרי תוכנה. גירוי נוסף הוא חלק של התוכנה הוא פתוח, חינם בזמן שאחרות סגורות, יקרה ומתעדכן לצר. שיפור משמעותי יהיה להשתמש או לפתח חתיכה אחת של התוכנה (אידיאלי פתוח) המספק רמות דומות של ביצועים, נוחות השימוש משלב הרכישה לניתוח. כפי שצוין לעיל, ניתוח רציומטרי מכפילה את גודל הקובץ ואת משך הזמן הנדרש להשלמת ניסוי. דור של מנהלי התקנים המצלמה בה ניתן לשלב להתאמה אישית משתמש במסגרות כמו בונסאי יאפשר אחרים זרמי נתונים שנאספו, ניתח ותמונות בתפוקה בזמן אמת, שיפור משמעותי.
לעתיד להתרחש:
בזמן שאנחנו בדרך כלל לעקוב אחר תנועות תולעת באופן ידני, מעקב אחר centroid התולעת זוהתה בהקלטות אינפרא-אדום בהיר או כהה-שדה אמור לאפשר לעיבוד צמתים מספקים לולאה סגורה ההתאמה של מיקום הבמה, אוטומטית תמונה נוספת מעקב (איור 3 ונתונים לא מוצג). רוב ההקלטות פלורסצנטיות שהושג עם שיטה זו היא האפל ונטול ביולוגית מעניין נתונים. טכניקות חיתוך רצפי תמונות לאובייקטים הרלוונטיים עיבוד תמונה שלאחר הרכישה על-חיישן או בזמן אמת לאפשר רזולוציה מרחבית מוגברת, לזרז את הצינור ניתוח נתונים, במיוחד אם Z-פרוסות נוספים נאספים עבור כל אחד timepoint להמחיש פעילות בתוך כל התאים מראש ולא postsynaptic במעגל.

מטרה מרכזית של מדעי המוח היא להבין איך נוירונים לתקשר מעגלים להתנהגות בעלי חיים נסיעה. המעגלים העצביים לשלב מגוון רמזים חושית מגוונת כדי לשנות פעילות מעגל, ובכך נהיגה שינויים התנהגותיים הכרחי עבור בעלי חיים להשיב את הסביבות שלהם. תולעים נימיות, C. elegans, יש מערכת עצבים פשוטה עם נוירונים 302 קשרים סינפטיים אשר היה ממופה לחלוטין1. בנוסף, גנים אשר קידוד חלבונים המעורבים עצבית גבוהה נשמרים בין C. elegans , יונקים2. למרות הפשטות האנטומי של מערכת העצבים שלו, הוא מציג רפרטואר מורכב מאופני שנשמרת מתן פלטפורמה פורה להבין איך נוירונים לווסת את ההתנהגות3.
C. elegans הוא נוטה היישום של מגוון רחב של גישות כמו מניפולציה גנטית, אבלציה לייזר תא, שיטות אלקטרופיזיולוגיות, וכן אין ויוו אופטי הדמיה4,5. מחקרים שנעשו לאחרונה יצרו מפות מפורטות של נוירוטרנסמיטר מרכזי איתות מערכות C. elegans כולל שימוש של רשתות עצביים GABAergic. מחקרים אלה, יחד עם לימודי מתמשך כדי למפות את הביטוי של כל עצביים G-חלבון בשילוב קולטנים למקם את מודל זה במיקום ייחודי כדי למנף את מבנה מאוד מפורט ומפות קישוריות עצביים תפקודית כדי להבין באופן מלא כיצד אלה אותות עצביים שונים דרך רצפטורים שונים, צירי זמן נסיעה בהיבטים שונים של התנהגות בעלי חיים.
ללימוד דפוסי הפעילות העצבית דינמי בכל מערכת, תנאי חיוני הוא לפתח מתודולוגיות חזקים כדי להקליט את פעילות נוירונים בודדים או מעגלים כולו במהלך התנהגויות. חשוב במיוחד amenability גישות כאלה אופטי להמחיש פעילות presynaptic שמניע שלפוחית סינפטית פיוז'ן. כתבים פלורסנט רגישה מאוד ומהירה של תאיים Ca2 +, יחד עם הזמינות הגוברת של רסיברים צילום רגיש, מהפכה את ההקלטה של התא, בפעילות הסינפטית בבעלי חיים ערה, חיה במהלך התנהגות. כי תוצאה העיקריים של הפעילות החשמלית סינפטית היא להסדיר Ca2 + ערוצים, שינויים ב- Ca תאיים2 + נחשבים בנאמנות השינויים הרלוונטיים בהתנהגותו ח בפעילות התא.
במחקר זה, אנו מציגים גישה לביצוע רציומטרי Ca2 + הדמיה בתכולה HSN מוטורי לגלוקוז לקדם התנהגות להטלת ביצים ב- C. elegans6,7. גישה זו מתבסס על הניסיונות להציג באופן חזותי Ca2 + פעילות C . elegans, המעגל להטלת ביצים במהלך התנהגות5,8,9,10,11 . השיטה מאפשרת לתאם בו זמנית את שינויי בפעילות התא/מעגל עם אירועים להטלת ביצים, וכן שינויים במצב גינקולוגיות בעלי חיים. למרות אנו משתמשים בגישה זו ללמוד פעילות תולעים בוגרות, עבודה שלא פורסמה מן המעבדה שלנו מציג שגישה זו ניתן להאריך לבעלי ילדותי הרביעית (L4) הזחל גם כן. סביר כי הפעילות של נוירונים אחרים- C. elegans לתפקד בתוך מעגלים נפרדים והתנהגויות צריך להיות נגיש באופן דומה עם טכניקה זו. השני פותח לאחרונה מהיר Ca2 + מחוונים עם שאינם חופפים ספקטרום הפליטה12,13,14,15,16, כלים optogenetic17 , ואת גנטית מקודד אופטי סממנים של מתח הממברנה18, אמור לאפשר לנו לבצע חקירות 'כל-אופטיים' חודר איך שינויים בפעילות מעגל עצבי נוהג הברית התנהגות ברורים.

ratiometric calcium imaging of individual neurons in behaving caenorhabditis elegans

זה הפך ליותר ויותר ברורה כי פעילות מעגל עצבי בחיות מתנהגות שונה באופן מהותי מן לראות בבעלי חיים מרדימים או קיבוע. כתבים פלורסנט רגישה מאוד, מקודדים גנטית של Ca2 + מהפכה את ההקלטה של התא, בפעילות הסינפטית שימוש בגישות אופטי לא פולשנית בבעלי חיים להתנהג. בשילוב עם גנטי, טכניקות optogenetic, את המנגנונים המולקולריים זה לווסת את פעילות התא ואת מעגל במהלך הברית ניתן לזהות התנהגות שונה.
כאן נתאר שיטות רציומטרי Ca2 + הדמיה של נוירונים יחיד ב להתנהג בחופשיות Caenorhabditis elegans תולעים. נדגים שיטה הרכבה פשוטה בעדינות שכבות-על תולעים גוברת על אגר רגיל של מדיה צמיחה תולעים נימיות (NGM) לחסום עם coverslip זכוכית, יאפשר לבעלי אפשרות להקליט ברזולוציה גבוהה במהלך תנועה בלתי מוגבלת והתנהגות. בטכניקה זו, אנו משתמשים רגיש Ca2 + לכתב GCaMP5 להקליט את שינויים תאיים Ca2 + בנוירונים תכולה דו-מיניים ספציפיים (HSNs) בה הם נוהגים ההתנהגות להטלת ביצים. בהבעת שיתוף mCherry, Ca2 +-חלבון פלואורסצנטי חסר רגישות, נוכל לאתר את המיקום של HSN בתוך ~ 1 מיקרומטר ונכונה עבור תנודות פלורסצנטיות נגרם על ידי שינויים במוקד או תנועה. הדמיה brightfield בו זמנית, אינפרא אדום מאפשר התנהגות הקלטה ומעקב בבעלי חיים באמצעות שלב ממונע. על ידי שילוב של זרמי נתונים וטכניקות מיקרוסקופית אלו, אפשר להקליט Ca2 + פעילות במעגל להטלת ביצים C. elegans תוך כדי התקדמות בין מצבי התנהגות לא פעיל ופעיל מעל עשרות דקות.

הטכניקה פשוטה הרכבה המתוארים כאן (איור 1) גורם שינויים מינימאליים לסביבה תרבות של L4 ו למבוגרים C. elegans תוך מתן אפשרות ברזולוציה גבוהה הקלטה מתנהג חיות דרך coverslip זכוכית (איור 4). סינכרון של מקורות אור LED, בקרי הבמה חשיפות המצלמה מאפשר עבור רכישת נתונים של מספר זרמים-מסגרות לשנייה 20 עד כדי 1 ח' ביניים ההגדלה (20 x) עם מטרות מפתח נומרי גבוהה (0.7-0.8) מספק טוב רזולוציה מרחבית של האזור סינפטית המעגל ההתנהגות להטלת ביצים, אפילו עם 4 x 4 פיקסל binning (מיקרומטר 1.25 לפיקסל). רכישת סימולטני של אותות זריחה GCaMP5 ו- mCherry (איור 4A, B) משמש להפקת ערוץ יחס על ידי פיקסל פיקסל שמפצה על שינויים בבעלי חיים תנועה ונוחות (איור 4D). התחנה הסופית presynaptic של HSN הוא כל כך גדולים כמו גופים תאים עצביים רבים C. elegans, ושינויים HSN Ca presynaptic2 + ניתן בבירור לאבחן. FOV גדול של המצלמה brightfield אינפרא-אדום מאפשר את התולעת לבצע אחריהם מעקב באופן ידני במהלך ההקלטה (איור 4E). עבור כל בעל חיים, שינויים ב- Ca תאיים2 + ישויך עם התנהגויות ניכר הדמיה brightfield כולל שחרור הביצית ושינויים גפיים (איור 4E).
כימות של HSN Ca2 + ומהירות מאשר כי תולעים שינוי ומכניקה שלהם במעבר להתנהגות להטלת ביצים... ישנם הבדלים משמעותיים במהירות תולעת לפני, במהלך, ואחרי המצב הפעיל להטלת ביצים (איור 5א). זה לא נגרם עקב רעש הגלום ההדמיה או מערכת המעקב. התקרבות לתוך האירוע להטלת ביצים, נתבונן חזק בשינוי GCaMP5 קרינה פלואורסצנטית (ΔF/F) לפני האירוע להטלת ביצים, בעוד mCherry הוא יחסית ללא שינוי (איור 5B). שינויים נמדד ביחס GCaMP5:mCherry (ΔR/R) מראים בבירור של HSN Ca2 + ארעי ~ 4 s לפני שחרור הביצית (איור 5B). חופפת התכווצות שרירים vulval, מאט נקי תולעת ומכניקה של מתרחשת כי מסתיים עם ביצה לשחרר. תוצאות קודמות הראו כי שימוש VC הנוירונים מנוע, אשר הם innervated על ידי HSNs, להראות פעילות שיא במהלך התכווצות שרירים חזקים vulval ובמהלך ביצה שחרור 8,10,27. אנחנו גם הראו כי optogenetic ההפעלה של הנוירונים VC כוננים של האטה מיידית של גפיים, רומז כי הנוירונים VC עשוי להיות מופעל על ידי התכווצות שרירים vulval, ובכך מאט גפיים עד קבלת משוב של שחרור הביצית27 .
ההדמיה, תיאר מערכת המעקב מאפשר הדמיה של הארגון המרחבי של ההתנהגות להטלת ביצים (איור 5C). כאמור מוצג, תולעים הזן ריצות מתמשכת של גפיים קדימה רק לפני למצב פעיל32. תולעים מבלים את רוב זמנם שיחור מזון על חיידקים במרכז גוש אגר. לפני הכניסה למצב פעיל, תולעים להרחיק המזון, אשר חופפת המראה של HSN Ca נדירים2 + תופעות מעבר. פעילות HSN המעברים ואז ירי פרץ, עם מספר צפופים HSN Ca2 + תופעות מעבר זה לקיים אירועים להטלת ביצים לתוך. התולעים אז לעיתים קרובות תסתובב לחדש ומכניקה קדימה, מטילים את ביציהם על הדרך חזרה לכיוון נקודת ההתחלה שלהם ליד החיידק OP50. אנחנו יכולים להניח כי שינויים O מקומית2 ו/או ריכוז CO2 עשויה להיות השפעה על איפה התולעים להחליט להטיל ביצים33,34.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig1.jpg"> איור 1. C. elegans הרכבה טכניקת דימות ברזולוציה של מעגל פעילות והתנהגות בעלי להטלת ביצים. העליון, ההר האחרון מן הצד. התחתון, ההר הסופי כפי שהוצג דרך קרקעית coverslip גדול. חיצים מציינים OP50 חיידקי מזון, בתולעים המוטנטיות וביצים, דחוקה בין גוש אגר NGM את coverslip גדול 24 מ"מ x 60 מ"מ. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig2.jpg"> איור 2 . Widefield רציומטרי Ca2 + הדמיה והתנהגות הקלטה במיקרוסקופ epifluorescence הפוך. (א) תולעת עמדה והתנהגות לכידת brightfield ויה 20 x (0.8 NA) מטרת התוכנית-עדשה אפוכרומטית באמצעות אור אינפרא-אדום (750-790 ננומטר) (חצים סגולים) הנפלטים מנורת הלוגן דרך גוש NGM. ג'ויסטיק והבמה ממונע בקר משמש כדי לשמור על התולעת בתוך שדה הראייה במהלך ההקלטה. מיקום הבמה (Δx, Δy) נשלחת למחשב על-ידי היציאה הטורית. חלבונים GCaMP5 ו- mCherry לידי ביטוי התולעת מתרגשים באמצעות 470 nm (חיצים כחולים) ו 590 nm (חיצים צהובים) דיודות פולטות אור (LED). הנפלטים GCaMP5 (ירוק חצים) mCherry (חיצים כתומים) זריחה יחד עם אור אינפרא-אדום עובר דרך מראה ודיקרואיק זוהר הלהקה רב (ראה טבלה של חומרים). קרן-הפיצול 80/20 שולח 20% של האור דרך demagnifer 0.63 x עבור לכידה על מצלמת CMOS אינפרא אדום רגיש (חץ סגול). ה-80% הנותרים של האור נשלחת דרך היציאה-הצד של המיקרוסקופ מפצל תמונה שמפריד את GCaMP5, mCherry זריחה על נפרדות חצאים של מצלמת sCMOS בעת הסרת אור אינפרא-אדום brightfield. הנתונים של שתי המצלמות מועברים למחשב באמצעות כבלים, USB3. היציאות ההדק מן המצלמה sCMOS קרינה פלואורסצנטית (כחול) משמשים לשליחת + 5V TTL מפעיל מערכת תאורה LED, המצלמה CMOS אינפרא-אדום brightfield של המכשיר רכישה דיגיטלית (DAQ). טריגר (B) 3 פלט TTL אותות שזיהה את DAQ-pin דיגיטלי #8 ושלח למחשב באמצעות חיבור USB. אלה כניסות דיגיטליות לעורר ' איפה XY' הפקודה טורי של קובץ script תוכנה הבונסאי (XY-שלב-גמר) אשר קורא X ו- Y שלב מיקום עבור כל תמונה זריחה/אינפרא-אדום GCaMP5/mCherry בשבי. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig3.jpg"> איור 3 : פריסה של התסריט תקשורת טורית-שלב בונסאי XY-שלב-גמר- העליון צומת DigitalInput (ורוד) קורא מפעילים TTL מגיע לתוך ה-pin #8 של DAQ. עבור כל חיובי TTL מתח (ירוק), DAQ גורם חותמת זמן (כחול) וכותב מחרוזת 'איפה XY?' (ורוד) הבקר השלב דרך היציאה הטורית (אפור). הצומת SerialStringRead (ורוד) קורא ש-x ו- Y לתאם התגובה של הבקר הבמה. מחרוזת זו הוא מומר מיקרון ואז הפרדתו X ו- Y שלב קואורדינטות. לבסוף נחלים ארבע אלה משולבים באמצעות הצומת zip (כחול), קובץ column.csv 4 כתוב: ספירת מסגרת TTL האותות המתקבלים (צומת טווח, ורוד) את הקואורדינטות X ו- Y, את המרווח בין timepoints עוקבות (בדרך כלל ~ 50 מילישניות כאשר הקלטה ב 20 הרץ). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig4.jpg"> איור 4 : Micrographs הנציגה של HSN פלורסצנטיות, brightfield כל חיה במהלך ההתנהגות להטלת ביצים. (A–D) הדמיה רציומטרי בו זמנית של זריחה GCaMP5 ו- mCherry, HSNs רק לפני שחרור הביצית. טרמיני presynaptic HSN מסומנים עם ראשי חץ. קרינה פלואורסצנטית מיזוג של GCaMP5 ו- mCherry (ג). (ד) GCaMP5:mCherry מאופנן בעוצמה יחס; יחס גבוה (אדום) ציון גבוה תאיים Ca2 + התחנה הסופית presynaptic. (E) Brightfield תמונה של התולעת כולו רק אחרי הביצים שכבתי. ראשי חץ מציינים את החצאים anterior ואת אחורי של הפות שממנו הביצים מוטלות. סולם בר לכל התמונות הוא 50 מיקרומטר. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig5.jpg"> איור 5 : הקלטה של מהירות2 + וגפיים HSN Ca במהלך ההתנהגות להטלת ביצים. רשמים (A) מהשינויים יחס GCaMP5:mCherry בתגובה תאיים Ca2 + תופעות מעבר (ΔR/R; אדום) יחד עם מהירות תולעת מיידי (מיקרומטר/s; כחול). אירועי כנס מסומנים באמצעות ראשי חץ. (B) עקבות של קרינה פלואורסצנטית HSN GCaMP5 (green; ΔF/F), זריחה mCherry (אדום; ΔF/F), יחס זריחה GCaMP5:mCherry (שחור; ΔR/R) ותולעת מהירות (כחול) סביב ברגע של שחרור הביצית. (ג) הארגון המרחבי של כנס והתנהגויות ומכניקה במהלך ההקלטה כל 10 דקות. המסלול תולעת הושג מן המידע הבמה XY אשר נוספה למיקום centroid HSN המתקבל ההקלטה זריחה mCherry. העיתוי של HSN שנחשולי (עיגולים אדומים), אירועים להטלת ביצים (חץ שחור), ולא את ההתחלה והסוף של ההקלטה (יהלומים ירוק וכחול) מסומנים. סולם בר הוא 1 מ מ. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans at JoVE.com

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

פרוטוקול זה מתאר את השימוש Ca2 + כתבים מקודדים גנטית כדי לרשום שינויים בפעילות העצבית מתנהג Caenorhabditis elegans תולעים.

סידן רציומטרי הדמיה של נוירונים בודדים ב מתנהג Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

ratiometric-calcium-imaging-individual-neurons-behaving

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

11.5K Views.  University of Miami School of Medicine. פרוטוקול זה מתאר את השימוש Ca2 + כתבים מקודדים גנטית כדי לרשום שינויים בפעילות העצבית מתנהג Caenorhabditis elegans תולעים.

Video: Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of neurons and circuits requires methods with the spatial selectivity and temporal resolution appropriate for mechanistic analysis of neural ensembles in the behaving animal, i.e. recording of representatively large samples of isolated single neurons. Ensemble monitoring of neuronal activity has progressed remarkably in the past decade in both small and large-brained animals, including human subjects1-11. Multiple-site recording with silicon-based devices are particularly effective because of their scalability, small volume and geometric design.
Here, we describe methods for recording multiple single neurons and local field potential in behaving rodents, using commercially available micro-machined silicon probes with custom-made accessory components. There are two basic options for interfacing silicon probes to preamplifiers: printed circuit boards and flexible cables. Probe supplying companies (<a href="http://www.neuronexustech.com/" >http://www.neuronexustech.com/</a>; <a href="http://www.sbmicrosystems.com/">http://www.sbmicrosystems.com/</a>; <a href="http://www.acreo.se/">http://www.acreo.se/</a>) usually provide the bonding service and deliver probes bonded to printed circuit boards or flexible cables. Here, we describe the implantation of a 4-shank, 32-site probe attached to flexible polyimide cable, and mounted on a movable microdrive. Each step of the probe preparation, microdrive construction and surgery is illustrated so that the end user can easily replicate the process.

We describe methods for large-scale recording of multiple single units and local field potential in behaving rodents with silicon probes. Drive fabrication, probe attachment to the drive and probe implantation processes are illustrated in sufficient details for easy replication.

בקנה מידה גדול הקלטה של ​​הנוירונים על ידי בדיקות מטלטלין סיליקון מתנהג מכרסמים

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

תגובות סידן הדמיה בנוירונים GFP-tagged של פרוסות מוח עכבר ההיפותלמוס

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

בהדמיה עצבית סיד vivo ב C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; מערכת מודל לחקר Amylopathy

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

אלקטרו הקלטה בו זמנית ובסידן הדמיה של suprachiasmatic גרעין נוירונים

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Microchambers agarose לסידן הדמיה לטווח ארוך של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse

In vivo real-time monitoring of neuronal activities in freely moving animals is one of key approaches to link neuronal activity to behavior. For this purpose, an in vivo imaging technique that detects calcium transients in neurons using genetically encoded calcium indicators (GECIs), a miniaturized fluorescence microscope, and a gradient refractive index (GRIN) lens has been developed and successfully applied to many brain structures1,2,3,4,5,6. This imaging technique is particularly powerful because it enables chronic simultaneous imaging of genetically defined cell populations for a long-term period up to several weeks. Although useful, this imaging technique has not been easily applied to brain structures that locate deep within the brain such as amygdala, an essential brain structure for emotional processing and associative fear memory7. There are several factors that make it difficult to apply the imaging technique to the amygdala. For instance, motion artifacts usually occur more frequently during the imaging conducted in the deeper brain regions because a head-mount microscope implanted deep in the brain is relatively unstable. Another problem is that the lateral ventricle is positioned close to the implanted GRIN lens and its movement during respiration may cause highly irregular motion artifacts that cannot be easily corrected, which makes it difficult to form a stable imaging view. Furthermore, because cells in the amygdala are usually quiet at a resting or anesthetized state, it is hard to find and focus the target cells expressing GECI in the amygdala during baseplating procedure for later imaging. This protocol provides a helpful guideline for how to efficiently target cells expressing GECI in the amygdala with head-mount miniaturized microscope for successful in vivo calcium imaging in such a deeper brain region. It is noted that this protocol is based on a particular system (e.g., Inscopix) but not restricted to it.

In vivo microendoscopic calcium imaging is an invaluable tool that enables real-time monitoring of neuronal activities in freely behaving animals. However, applying this technique to the amygdala has been difficult. This protocol aims to provide a useful guideline for successfully targeting amygdala cells with a miniaturized microscope in mice.

מוצלח בהדמיית סידן Vivo עם מיקרוסקופ מיניאטורי ראש הר באמיגדלה של עכבר מתנהג בחופשיות

In vivo real-time monitoring of neuronal activities in freely moving animals is one of key approaches to link neuronal activity to behavior. For this ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

אין ויוו הדמיית סידן בעכבר זית נחות

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are specialized sites of synaptic innervation modulated by activity and serve as substrates for learning and memory. Recently, dendritic spines have been described for DD GABAergic neurons as the input sites from presynaptic cholinergic neurons in the motor circuit of Caenorhabditis elegans. This synaptic circuit can now serve as a powerful new in vivo model of spine morphogenesis and function that exploits the facile genetics and ready accessibility of C. elegans to live-cell imaging. 
This protocol describes experimental strategies for assessing DD spine structure and function. In this approach, a super-resolution imaging strategy is used to visualize the intricate shapes of actin-rich dendritic spines. To evaluate the DD spine function, the light-activated opsin, Chrimson, stimulates the presynaptic cholinergic neurons, and the calcium indicator, GCaMP, reports the evoked calcium transients in postsynaptic DD spines. Together, these methods comprise powerful approaches for identifying genetic determinants of dendritic spines in C. elegans that could also direct spine morphogenesis and function in the brain.

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are important cellular features of the nervous system. Here live imaging methods are described for assessing the structure and function of dendritic spines in C. elegans.&#160;These approaches support the development of mutant screens for genes that define dendritic spine shape or function.

הדמיה של קוצים דנדריטיים בקאנורהבדיטיס אלגנס

Dendritic spines are specialized sites of synaptic innervation modulated by activity and serve as substrates for learning and memory. Recently, dendritic ...

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed orientation. Here we describe methods to label, image, and analyze the microtubule dynamics and growth during the development and regeneration of touch neurons in C. elegans. Using genetically encoded fluorescent reporters of microtubule tips, we imaged the axonal microtubules. The local changes in microtubule behavior that initiates axon regeneration following axotomy can be quantified using this protocol. This assay is adaptable to other neurons and genetic backgrounds to investigate the regulation of microtubule dynamics in various cellular processes.

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

A protocol for imaging the dynamic microtubules in vivo using fluorescently labeled End binding protein has been presented. We described the methods to label, image, and analyze the dynamic microtubules in the Posterior lateral microtubule (PLM) neuron of C. elegans.

In vivo הערכה של מיקרוטובולה דינמיקה והתמצאות ב Caenorhabditis elegans נוירונים

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...