يصف هذا البروتوكول طرق تصور مورفولوجيا العمود الفقري التغصني وعابري الكالسيوم في الخلايا العصبية C.elegans. يجب أن يسهل نهجنا الأساليب الجينية لاكتشاف محددات تشكل العمود الفقري ووظيفته. يتميز بروتوكولنا بالعمود الفقري المتغصن في الخلايا العصبية GABAergic.
يمكن أيضا فحص العمود الفقري في فئات أخرى من الخلايا العصبية C.elegans بهذه الطرق. يصف بروتوكولنا طرق شل حركة C.elegans الحية. من المهم بشكل خاص منع حركة الحيوانات أثناء الحصول على الصورة ، واختيار تكوينات الليزر المناسبة لإثارة النشاط العصبي وتسجيله.
للحصول على صور عالية الدقة ، أضف ثلاثة ميكرولتر من محلول التخدير ، وقم بكمية 15 إلى 20 دودة شابة على 10٪ من منصات الأغاروز. ثم ضع غطاء الغطاء لشل حركة الديدان ، وأغلق حواف الغطاء بمزيج مانع للتسرب لاصق ذائب. للحصول على دقة فائقة ، استخدم مجهر متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر مزود بفحص مجهري فائق الدقة.
احصل على Z-stacks باستخدام حجم الخطوة الموصى به من قبل برنامج الشركة المصنعة. اجمع سلسلة من المقاطع البصرية التي تغطي الحجم الكلي للعملية البطنية الظهرية D أو DD. أرسل Z-stacks لمعالجة الصور باستخدام برنامج الشركة المصنعة ، وقم بتحليل الصور بدرجة أعلى من سبعة.
للحصول على Nyquist ، استخدم مجهر متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر ، وحدد حجم البكسل الأمثل لطول موجة الضوء والفتحة العددية للعدسة الشيئية. ثم أرسل المكدس ل 3D-deconvolution باستخدام خوارزمية تلقائية. لتحليل الصور ، استخدم برنامج معالجة صور مناسب لإنشاء إسقاطات كثافة قصوى لمكدسات Z.
وعد يدويا النتوءات على تغصنات DD. ثم حدد طول تغصنات DD المسجلة لحساب كثافة العمود الفقري لكل 10 ميكرومتر من تغصنات DD. ثم صنف العمود الفقري على أنه رقيق أو فطر أو خيطي أو قصير أو متفرع.
باستخدام التقنيات التقليدية مثل الحقن المجهري ، قم بإنشاء ديدان معدلة وراثيا تعبر عن مستشعر الكالسيوم GCaMP في الخلايا العصبية DD ، و Chrimson ، رودوبسين قناة حمراء التحول في الخلايا العصبية VA قبل المشبكية. بعد ذلك ، تحت غطاء رقائقي ، قم بإعداد جميع لوحات عبر الشبكية أو ATR عن طريق إضافة 300 ميكرولتر من الثقافة البكتيرية OP50 المزروعة بين عشية وضحاها ، و 0.25 ميكرولتر من ATR إلى كل 60 ملم من لوحة أجار المغذيات المتوسطة نمو الديدان الخيطية. ثم انشر الثقافة بقضيب زجاجي معقم.
بالنسبة للوحات التحكم ، أضف 300 ميكرولتر من بكتيريا OP50 و 0.25 ميكرولتر من الإيثانول. للسماح بنمو البكتيريا ، احتضان الألواح في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة ، محمية من الضوء المحيط. لإعداد التجربة ، ضع خمس يرقات من المرحلة L4 على ATR أو لوحات التحكم المصنفة OP50 ، واحتضان الألواح في الظلام عند 23 درجة مئوية.
بعد ثلاثة أيام ، استخدم مجهر تشريح ستيريو لتأكيد تطور الفرج ، واختر ذرية المرحلة L4 من ATR ولوحات التحكم للتصوير. بعد ذلك ، ضع ميكرولتر من حبيدات 0.05 ميكرومتر على شريحة مجهر. ووضع ما يقرب من 10 يرقات L4 في الحل.
باستخدام سلك بلاتيني ، أضف كرية صغيرة من الغراء الفائق إلى المحلول. قم بتدوير المحلول برفق لتوليد خيوط خيطية من الغراء. ثم أضف ثلاثة ميكرولتر من المخزن المؤقت M9.
ثم ضع زلة غطاء وأغلق حوافها كما هو موضح سابقا. لتسجيل عابرات الكالسيوم المستثارة في العمود الفقري المتغصن ، استخدم مجهر متحد البؤر للقرص الدوار ، واضبط مرحلة المجهر لوضع أشواك DD في المستوى البؤري. ثم قم بإعداد الحصول على الفاصل الزمني لإلقاء الضوء على العينة بخط ليزر 488 نانومتر في كل إطار للكشف عن مضان GCaMP ، وخط ليزر 561 نانومتر على فترات دورية لإثارة Chrimson.
لتصوير الكالسيوم في الجسم الحي ، استخدم 2D-deconvolution ومحاذاة الصورة لتصحيح الانحرافات الطفيفة عن حركة الدودة أثناء الاكتساب. ثم حدد العمود الفقري التغصني DD على أنه منطقة الاهتمام أو عائد الاستثمار. قم بتكرار عائد الاستثمار والانتقال إلى منطقة مجاورة داخل الفيروس المتنقل لجمع إشارة الخلفية.
ثم باستخدام البرنامج المناسب ، قم بتصدير شدة GFP إلى Excel لكل نقطة زمنية ، واطرح مضان الخلفية من مضان عائد الاستثمار في العمود الفقري. حدد التغير في التألق عن طريق طرح مضان GFP في الإطار مباشرة قبل إثارة 561 نانومتر أو عند الصفر من كل نقطة زمنية بعد الإثارة أو Delta F.ثم اقسم على F صفر لتحديد دلتا F على F صفر. والرسم البياني للآثار الطبيعية.
أولا ، حدد ما إذا كانت البيانات موزعة بشكل طبيعي باستخدام اختبار Shapiro-Wilk. بالنسبة للبيانات التي لا يتم توزيعها عادة ، استخدم ANOVA غير معلمي مع تصحيح لاحق للاختبار المتعدد. بدلا من ذلك ، بالنسبة للقياسات التي تظهر التوزيع الطبيعي أو الغاوسي ، قم بإجراء اختبار ANOVA بارامتري مزدوج لكل قياس لمضان GCaMP قبل وبعد كل نبضة 561 نانومتر.
وتصحيح للمقارنات المتعددة في كل من المجموعتين. أدى وضع العلامات على العمود الفقري التغصني DD بثلاث علامات مستقلة ، mCherry الخلوية ، MYR: mRuby ، و LifeAct: GFP إلى متوسط كثافة يبلغ 3.4 أشواك تغصنية DD لكل 10 ميكرون من تغصنات DD في الشباب من النوع البري. تم استبعاد علامة GFP: Utrophin من هذا التحليل لأنها أسفرت عن كثافة عمود فقري أقل بكثير ، ربما بسبب تفاعلات utrophin مع الهيكل الخلوي الأكتين الذي يدفع تكوين العمود الفقري.
أكد نهج التصوير بالخلايا الحية أن مورفولوجيا شكل الفطر الرقيق لأشواك DD تسود في البالغين مقارنة بأشكال العمود الفقري البديلة مثل الخيطية والقصيرة والمتفرعة. تم تقييم تنشيط العمود الفقري التغصني DD عن طريق الإشارات الكولينية قبل المشبكية في الديدان المعدلة وراثيا التي تعبر عن GCaMP في الخلايا العصبية DD ، و Chrimson في الخلايا العصبية VA قبل المشبكية. تم الكشف عن رشقات نارية عابرة لإشارة GCaMP في أشواك DD مباشرة بعد التنشيط البصري الجيني ل Chrimson في الخلايا العصبية VA قبل المشبكية.
أكدت تجربة تحكم في غياب ATR أن القياس إلى إشارة GCaMP يعتمد على التنشيط البصري الجيني ل Chrimson الذي يعتمد بشكل صارم على ATR. لتصور أشواك DD ، من الأفضل تصوير الحيوانات التي توضع على جانبها مثل الأشواك التي تبرز بزوايا قائمة على مسار الضوء. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن للعلماء أيضا استخدام التلاعب الدوائي لفهم الآليات التي تدفع عابري الكالسيوم في العمود الفقري DD.
