يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء الميكانيكية، مثل كيفية انتقال القوات وإحساسها داخل الخلايا وكذلك بين الخلايا وبيئتهم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالوصول إلى المعلومات على النطاق الجزيئي فيما يتعلق بكيفية استجابة البروتينات للقوى الميكانيكية داخل السياق الأصلي للخلية الحية. على الرغم من أن هذه الطريقة قد طبقت خصيصا لدراسة تركيز الالتصاق البروتين فينكولين، فإنه يمكن أيضا أن تطبق على غيرها من البروتينات الحساسة ميكانيكيا، مثل تالين، cadherins أو nesprin.
إن العرض التوضيحي المرئي لهذه الطريقة أمر بالغ الأهمية، حيث أن إعداد التصوير المناسب صعب ولكنه ضروري لنجاح التحليل. ابدأ هذا الإجراء بتعبير مستقر عن بنية مستشعر التوتر في نوع الخلية المطلوبة، كما هو مفصل في بروتوكول النص. لإعداد ركائز لبذات الخلايا، الحصول على أربعة 35 ملليمتر من الزجاج القاع الأطباق.
العمل في غطاء لثقافة الخلية، في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر، وجعل أربعة ملليلتر من 10 ميكروغرام لكل ملليلتر في الليفي في محلول ملحي معقمة الفوسفات المخزنة، أو برنامج تلفزيوني. عكس بلطف أنبوب مرة واحدة لخلط والسماح للحل الجلوس لمدة خمس دقائق في غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية. ثم ماصة واحدة ملليلتر من حل fibronectin على كل طبق الزجاج القاع.
اترك محلول الليفي على الأطباق لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. ثم الطامح حل fibronectin وشطف مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. اترك ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني على الأطباق حتى تصبح الخلايا جاهزة للبذاءات.
بعد عد الخلايا، بذور 30،000 الخلايا على كل طبق زجاجي مغلفة ليفية مع وسائل الإعلام كاملة مناسبة لحجم النهائي من 1.5 ملليلتر. السماح للخلايا للانتشار لمدة أربع ساعات بعد البذر. في ساعتين من الانتشار ، تُفطّن وسائط النمو وتشطف مرة واحدة مع وسائط التصوير.
اترك 1.5 ملليلتر من وسائط التصوير. الاحماء المجهر كما هو موضح في بروتوكول النص قبل بدء المعايرة. لمعايرة الليزر FRAP، أولاً فتح نافذة التكوين الليزر.
تعيين إعداد الإضاءة إلى إعدادات الإضاءة FRAP المناسبة للتعرض بالليزر للعينة. ثم قم بتعيين إعداد الإضاءة إلى إعدادات الإضاءة المناسبة لتصوير الفلوروفهور المُقبل فقط. حدد الهدف الذي تريد معايرته ضمن إعداد النظام الإحداثي.
قم بإلغاء تحديد نقاط المعايرة يدويًا وتحقق من عرض الصور أثناء المعايرة. تعيين الوقت يسكن إلى 10، 000 ميكرو ثانية وعدد من البقول إلى 100. الآن ضع الشريحة المعايرة، مصنوعة من بروميد الإثهيديوم مختومة بين شريحة زجاجية وزلة غطاء، في محول المرحلة مع الجانب زلة الغطاء إلى أسفل.
استخدم إعدادات الإضاءة المتقبلة للتركيز على سطح الشريحة، والتي يمكن تحديدها كسطح محوري مع إشارة ألمع. وسوف تكون العيوب الصغيرة في الطلاء مرئية للمساعدة في التركيز. نقل الشريحة إلى منطقة ذات فلورنسي موحد عبر مستوى التصوير.
انقر على إنشاء إعداد للمعايرة الأولى أو إعداد التحديث للمعايرات اللاحقة. سيقوم البرنامج بتهيئة عملية المعايرة ، وتبييض تلقائيا والكشف عن موقف نقطة ابيض. ضمان نجاح المعايرة من خلال تقييم الصورة النهائية، والتي ستكون شبكة ثلاثة في ثلاثة من النقاط المبيضة التي ينبغي توزيعها بالتساوي والتركيز.
حفظ صورة المعايرة للرجوع إليها في المستقبل. قم بإزالة شريحة المعايرة ثم قم بتخزينها بأمان. يجب أن يتم إجراء المعايرة قبل بدء كل تجربة ولكن لا تحتاج إلى أن يتم تنفيذها بين العينات.
إعداد إعداد المجهر للتصوير الخلية الحية، ويفضل مع مرحلة ساخنة والهدف، وكذلك التحكم في ثاني أكسيد الكربون. السماح لتكاويل لمدة 20 دقيقة. الآن ضع واحدة من عينات ولدت من الخلايا التي تعبر عن جهاز استشعار التوتر في حامل المجهر للتصوير.
السماح للخلايا لتكواز لمدة 10 دقائق. لضمان صحة الخلايا المصورة، حافظ على درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية في غرفة التصوير. استخدام مضخة التمرّد لتمرير مرطب 5٪ ثاني أكسيد الكربون على العينات في 15 ملليلتر في الدقيقة للحفاظ على نسبة الHH.
افتح أداة الامتلاك متعدد الأبعاد، أو MDA، ثم قم بإعدادها باستخدام معلمات التصوير من FRET، بما في ذلك مجموعات التصفية المختلفة. حفظ MDA هذا إلى "المجلد التجريبي" مع اسم MDA_FRET_date. قم بإعداد MDA آخر مع معلمات التصوير FRAP ، بما في ذلك مجموعات التصفية المختلفة ، وإعدادات Timelapse و اليومية لنبض الليزر بعد الحصول على ما قبل التبييض.
حفظ MDA هذا إلى "المجلد التجريبي" مع اسم MDA_FRAP_date. في شريط الأدوات في أعلى الشاشة، حدد دفتر اليومية، ابدأ التسجيل. افتح إطار MDA، ثم قم بتحميل حالة MDA_FRET_date واضغط على اكتساب.
ثم قم بتحميل حالة MDA_FRAP_date واضغط على اكتساب. في نهاية عملية الاكتساب، في شريط الأدوات في أعلى الشاشة، حدد دفتر اليومية، إيقاف التسجيل. حفظ هذا دفتر اليومية إلى "المجلد التجريبي" مع اسم FRETFRAP_date وإضافته إلى شريط أدوات للوصول السهل.
إغلاق إطار MDA. التنقل في العينة باستخدام الحصول على الصورة تحت الحصول على، الحصول مع الحد الأدنى من وقت التعرض ومرشح الكثافة محايدة لتحديد الخلايا ذات الاهتمام. تعيين التركيز التلقائي المستمر من خلال الانتقال إلى الأجهزة، التركيز.
التركيز يدويا على العينة حتى الوصول إلى مستوى التصوير الصحيح. انقر فوق تعيين التركيز المستمر وانتظر حتى يضبط النظام. بمجرد ضبط النظام، انقر فوق بدء التركيز المستمر.
ثم ابحث عن خلية تعبر عن مستشعر التوتر مع ترجمة واضحة إلى بنية ذات فائدة وقم بالتقاط صورة. رسم منطقة مستطيلة من الفائدة، أو ROI، لتسليط الضوء على مكان التبييض. قم بتخزين موقع عائد الاستثمار هذا.
الآن تهيئة FRETFRAP_date اليومية، والتي ستبدأ في الحصول على صور فريت، تليها تهيئة المهلة FRAP. كرر هذه الخطوات حتى يتم الحصول على 10 إلى 15 مجموعة صور. ثم تحليل البيانات فريت-FRAP كما هو مفصل في بروتوكول النص.
تظهر هنا هي نتائج تمثيلية لFRET التصوير من جهاز استشعار التوتر vinculin، بعد تجزئة والإخفاء لعزل الالتصاقات البؤري. ويمكن رؤية الاختلاف الزّامة من حمل الفينكولين عبر الخلية. يمكن أن يتأثر التصوير والتحليل FRAP بالاستقرار البؤري للتصاق.
ويمكن أن يكون من الصعب تتبع الالتصاق البؤري الذي يمر بسرعة خلال فترة التصوير. غالباً ما يشار إلى هذا بواسطة منحنى FRAP الذي يحتوي على توقف و في غير قابل للفك. بالنسبة للفينكولين البري ، هناك ارتباط عكسي بين حمولة البروتين ومعدل الدوران ، مما يشير إلى أن الفينكولين استقر بالقوة.
إدخال طفرة في فينكولين للتأثير على ربطها إلى تالين النتائج في عكس الارتباط، مشيرا إلى أن الفينكولين غير قادر على ربط التالين يزعزع استقرارها بالقوة. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر إعداد العينات بشكل صحيح، والتأكد من أن الخلايا تعبر عن المستشعر على مستويات محلية واختيار معلمات التصوير بعناية. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل الفلوروس المناعي، وقياس ديناميكيات النطاق الخلوي أو الخلايا الصعبة مع مثبطات مختلفة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل كيفية تفاعل البروتين من الاهتمام مع المكونات الأخرى دون الخلوية لتنسيق الاستجابة للقوة.
