وأيد هذا العمل EB014869 R01 المعاهد الوطنية للصحة.

1. إعداد الخلايا للتصوير
ملاحظة: يمكن استخدام المسبار القوة المباشرة (منسقي) لأي نوع من الخلايا ملتصقة. هنا، والمعاهد الوطنية للصحة 3T3 الماوس الليفية تستخدم كخط الخلية النموذجية لهذا البروتوكول.
<ol><li>الثقافة المعاهد الوطنية للصحة 3T3 تنتجها الخلايا الليفية الخلايا في المتوسطة (دميم "تعديل النسر" دولبيكو) وتستكمل مع المصل البقري المانحة 10% و 1% ستربتوميسين البنسلين في أسفل زجاج 35 مم طبق حتى كونفلوينسي المطلوب. الحفاظ على الخلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO2.<ol>
<li>من المؤكد أن معطف جميع الأطباق أسفل الزجاج 35 ملم مع 5 ميكروغرام/مل فيبرونيكتين (أو بروتين ECM مماثلة)، قبل البذر الخلايا 3T3 المعاهد الوطنية للصحة للتصوير. ملاحظة: الخلايا يجب أن يكون كاملا تنتشر وملتصقة على الطبق للتجربة. لا توجد أي قيود من حيث كونفلوينسي لمنسقي أسلوب للعمل.</li>
	</ol>
</li>
	<li>فورا قبل التجربة، غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني تليها يغسل واحدة مع متوسط النمو الكامل.</li>
	<li>أضف 3 مل متوسط النمو الكامل للطبق أسفل الزجاج.</li>
</ol>2-الفحص المجهري، والحصول على الصور
ملاحظة: المقلوب fluorescence المجهر (أو ما يعادلها) مع ميكرومانيبولاتور مثبتة على الذراع الجانب، وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. كما يمكن تجهيزه المجهر دائرة البيئة للإبقاء على درجة حرارة 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون2 مستوى 5%. مطلوب أيضا ميكرومانيبولاتور وميكروينجيكتور تعلق بالمجهر. زيت غمر x 40/1.3 60 x أو NA/1.49 NA (أو ما يعادل أهداف) ينصح للتجارب. وينبغي أن شنت المجهر على طاولة عزل الاهتزازات.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58038/58038fig1.jpg"> الشكل 1 . التشوه النووية وتركيز المجهر أ أقصى تشوه النووية وتخفيف التشوه النووية. قبل حساب الحد الأقصى تشوه النووية، كانت أولاً تزامن حواف الأشكال النووية مرة أخرى لتصحيح لترجمة نواة مشوه. كان مضافين على شكل النواة في هذه لحظة مفرزة نصيحة ميكروبيبيتي على شكل النووية الأولى قبل أن تنسحب. وتم قياس الفرق بين الشكلين في المنطقة ك Δ1. وعرف أنه Δأ1 مقسوماً على المجال النووي الأصلي تشوه النووية الحد الأقصى. وبالمثل، معلمة ثانية، Δأ2، يمكن تعريف التي تتراكب الشكل النهائي ثابت الدولة النووية بعد مفرزة ميكروبيبيتي على الشكل النووي الأصلي. باء-التركيز الخلية عند بالطائرة، ثم قم بنقل المستوى البؤري يصل إلى الطائرة ب للبحث عن هذه المعلومة ميكروبيبيتي. أثناء التصوير، وقد ترجم في ميكروبيبيتي إلى اليمين (باتجاه السهم البرتقالي). وقد تم تعديل هذا الرقم من نيلام et al. 15- <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58038/58038fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<ol><li>قم بتشغيل ميكروينجيكتور في البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.</li>
	<li>استخدام قطارة زيت غمر، تطبيق قطره واحدة من زيت الغمر أعلى العدسة الهدف.</li>
	<li>المشبك الطبق محكم في حامل الطبق وتحميل صاحب الطبق على خشبة المسرح. ملاحظة: يجب المحافظة على الخلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO2 طوال التجربة.</li>
	<li>ضبط ارتفاع الهدف لإحضار الخلايا إلى التركيز (بالطائرة، الشكل 1B).</li>
	<li>نقل مرحلة مجهر للعثور على خلية للفائدة.</li>
	<li>قم بتدوير عصا التحكم في ميكرومانيبولاتور لنقل صاحب بيبيت إلى المرتبة الأولى. تحميل ميكروبيبيتي نصيحة قطرها 0.5 ميكرومتر على حامل بيبيت.<ol>
<li>لتجنب التصاق الخلية إلى ميكروبيبيتي، قبل علاج نصيحة ميكروبيبيتي مع 0.3 ملغ/مل الحل PLL-ز-شماعة ح 1 في درجة حرارة الغرفة. اختبار الالتصاق بلمس ميكروبيبيتي إلى النواة دون أي ضغط الشفط ومن ثم ترجمة ميكروبيبيتي بعيداً عن النواة. ويمكن تمييز نظراً لعدم التصاق من انعدام تام لتشوه النووية والترجمة. ملاحظة: الرجاء اتباع اقتراحات صنعها لفتح الحزمة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>رفع المستوى البؤري موضوعي أعلاه بالطائرة والجزء العلوي من الخلية إلى "ب الطائرة" عن طريق ضبط عنصر التحكم غرامة (الشكل 1B، راجع الخطوة 2، 4).</li>
	<li>تعيين ميكرومانيبولاتور للتحكم ردئ . جلب ميكروبيبيتي وصولاً إلى "الطائرة ب" ببطء عن طريق لمشاهدة صورة ظلية ميكروبيبيتي، حتى ميكروبيبيتي يأتي تماما في التركيز.</li>
	<li>مجرد نصيحة ميكروبيبيتي في التركيز، تعيين في ميكرومانيبولاتور للمراقبة الدقيقة .</li>
	<li>أدنى الهدف للطائرة الاستوائي للخلية (ألف طائرة، الشكل 1B) وأقل ميكروبيبيتي إلى حوالي 15 ميكرون فوق الطائرة A (الشكل 1B، ميكروبيبيتي متقطع).</li>
	<li>تعيين الضغط التعويض (فج) في ميكروينجيكتور للضغط المطلوب؛ انتظر عدة ثوان للضغط من أجل تحقيق الاستقرار. ملاحظة: هذه النقطة مجموعة الضغط الأمثل يعتمد على نوع الخلية والأهداف المحددة لهذه التجربة. لمعظم الحالات، سيكون 300 hPa نقطة انطلاق جيدة.</li>
	<li>ضمان أن لا انسداد في ميكروبيبيتي باستخدام الإعداد نظيفة على لوحة ميكرومانيبولاتور والتحقق للتأكد من ظهور فقاعات الهواء من طرف ميكروبيبيتي.</li>
	<li>إدراج التلميح في الخلية بخفض تدريجيا في ميكروبيبيتي حتى التلميح طفيفة لمس السطح النووية. ملاحظة: عند تخفيض ميكروبيبيتي، سوف تصبح صورة ظلية طرف ميكروبيبيتي واضح أنها تأتي إلى التركيز. قبل ميكروبيبيتي تلامس النواة، زيادة التركيز الموضوعي ومحاذاة الحافة ميكروبيبيتي مع نواة (إحداثيات س ص نفس، أعلى z-طائرة). إرجاع التركيز إلى الطائرة الاستوائية من النواة (ألف طائرة، الشكل 1B) وتدريجيا أقل نصيحة ميكروبيبيتي.</li>
	<li>إنشاء ختم بين نصيحة ميكروبيبيتي والغشاء النووي عن طريق قطع أنابيب الإمداد بضغط من النظام microinjection، مما يفتح نهاية الأنبوب ميكروبيبيتي في الغلاف الجوي. هذه الخطوة بإنشاء ضغط سلبي يساوي فج على السطح النووي.</li>
	<li>الحصول على الصور مع برنامج جمع الصور مجاهر. إقامة أفي-اقتناء (فيديو) أو nd-اقتناء (صور) في برنامج جمع الصور. ملاحظة: لتصوير أي الحصول على البرمجيات، قم بإعداد تصوير الفيديو في الوقت الحقيقي أو امتلاك الوقت الفاصل بين الصورة مع فاصل زمني قصير.</li>
	<li>تبديل إلى فلوري المقابلة التصوير قناة (أي التجارة والنقل، طلب تقديم العروض، إلخ) والبدء في التصوير.</li>
	<li>ترجمة نصيحة ميكروبيبيتي بعيداً عن جسم الخلية (بالحق، الشكل 1B) حتى ينفصل النواة من ميكروبيبيتي. ملاحظة: سحب الحافة على طول x-الاتجاه الإيجابي (إلى اليمين في طريقة العرض للحقل). معدل سحب يمكن برمجتها والتحكم بجهاز الكمبيوتر أو يمكن نقل مقبض التحكم يدوياً. أننا لم نجد أي علاقة متبادلة بين سحب معدل وتشوه النووية15 تشير إلى استجابة مرنة أساسا إلى القوة.</li>
</ol>3-بيانات التحليل
<ol><li>القيام بتحليل الصورة مع أي برنامج معالجة الصور الأساسية المتاحة. يمكن قياس مدى تشوه النووية سلالة طول (Ɛ) أو سلالة المنطقة (الشكل 1A). التحديد الكمي لسلالة طول استخدام المعادلة 1، حيث L و L0 تمثل أطوال النواة في تشوه الحد الأقصى والموقف المبدئي، على التوالي. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58038/58038eq1.jpg">(المعادلة 1)</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+envelope+environment+and+its+cancer+connections.">The nuclear envelope environment and its cancer connections.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).</li><li>Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+structure+in+cancer+cells.">Nuclear structure in cancer cells.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (9), 677-687 (2004).</li><li>Bank, E. M., Gruenbaum, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+lamina+and+heterochromatin:+a+complex+relationship.">The nuclear lamina and heterochromatin: a complex relationship.</a> Biochemical Society Transactions. 39 (6), 1705-1709 (2011).</li><li>Lammerding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamins+A+and+C+but+not+lamin+B1+regulate+nuclear+mechanics.">Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (35), 25768-25780 (2006).</li><li>Dahl, K. N., Engler, A. J., Pajerowski, J. D., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power-law+rheology+of+isolated+nuclei+with+deformation+mapping+of+nuclear+substructures.">Power-law rheology of isolated nuclei with deformation mapping of nuclear substructures.</a> Biophysical Journal. 89 (4), 2855-2864 (2005).</li><li>Crisp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+the+nucleus+and+cytoplasm:+role+of+the+LINC+complex.">Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex.</a> Journal of Cell Biology. 172 (1), 41-53 (2006).</li><li>Sosa, B. A., Rothballer, A., Kutay, U., Schwartz, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LINC+complexes+form+by+binding+of+three+KASH+peptides+to+domain+interfaces+of+trimeric+SUN+proteins.">LINC complexes form by binding of three KASH peptides to domain interfaces of trimeric SUN proteins.</a> Cell. 149 (5), 1035-1047 (2012).</li><li>Tapley, E. C., Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connecting+the+nucleus+to+the+cytoskeleton+by+SUN-KASH+bridges+across+the+nuclear+envelope.">Connecting the nucleus to the cytoskeleton by SUN-KASH bridges across the nuclear envelope.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 57-62 (2013).</li><li>Arsenovic, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nesprin-2G,+a+Component+of+the+Nuclear+LINC+Complex,+Is+Subject+to+Myosin-Dependent+Tension.">Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension.</a> Biophysical Journal. 110 (1), 34-43 (2016).</li><li>Rowat, A. C., Lammerding, J., Ipsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+the+cell+nucleus+and+the+effect+of+emerin+deficiency.">Mechanical properties of the cell nucleus and the effect of emerin deficiency.</a> Biophysical Journal. 91 (12), 4649-4664 (2006).</li><li>Rowat, A. C., Foster, L. J., Nielsen, M. M., Weiss, M., Ipsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+elastic+properties+of+the+nuclear+envelope.">Characterization of the elastic properties of the nuclear envelope.</a> Journal of the Royal Society Interface. 2 (2), 63-69 (2005).</li><li>Pagliara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxetic+nuclei+in+embryonic+stem+cells+exiting+pluripotency.">Auxetic nuclei in embryonic stem cells exiting pluripotency.</a> Nature Materials. 13 (6), 638-644 (2014).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+mechanical+characterization+of+the+cell+nucleus+by+atomic+force+microscopy.">In situ mechanical characterization of the cell nucleus by atomic force microscopy.</a> ACS Nanotechnology. 8 (4), 3821-3828 (2014).</li><li>Krause, M., Te Riet, J., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+compressibility+of+tumor+cell+nuclei+by+combined+atomic+force-confocal+microscopy.">Probing the compressibility of tumor cell nuclei by combined atomic force-confocal microscopy.</a> Physical Biology. 10 (6), 065002 (2013).</li><li>Neelam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+force+probe+reveals+the+mechanics+of+nuclear+homeostasis+in+the+mammalian+cell.">Direct force probe reveals the mechanics of nuclear homeostasis in the mammalian cell.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5720-5725 (2015).</li><li>Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+plasticity+of+the+nucleus+in+stem+cell+differentiation.">Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15619-15624 (2007).</li><li>Lammerding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamin+A/C+deficiency+causes+defective+nuclear+mechanics+and+mechanotransduction.">Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction.</a> Journal of Clinical Investigation. 113 (3), 370-378 (2004).</li><li>Chancellor, T. J., Lee, J., Thodeti, C. K., Lele, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actomyosin+tension+exerted+on+the+nucleus+through+nesprin-1+connections+influences+endothelial+cell+adhesion,+migration,+and+cyclic+strain-induced+reorientation.">Actomyosin tension exerted on the nucleus through nesprin-1 connections influences endothelial cell adhesion, migration, and cyclic strain-induced reorientation.</a> Biophysical Journal. 99 (1), 115-123 (2010).</li><li>Neelam, S., Dickinson, R. B., Lele, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+approaches+for+understanding+the+nuclear+force+balance+in+living,+adherent+cells.">New approaches for understanding the nuclear force balance in living, adherent cells.</a> Methods. 94, 27-32 (2016).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

قياس تكامل الميكانيكية نواة مع سيتوسكيليتون تحد للأساليب الأكثر حداثة، مثل ميكروبيبيتي تطلع16، لأنها تتطلب أما نواة معزولة (حيث النواة decoupled من cytoskeleton) أو النواة في الخلايا مع وقف التنفيذ (حيث توجد القوات خارج الخلية، مثل قوي الجر،). طبق النواة القوة عن طريق تطبيق سلالة بياكسي?...

الأمراض مثل السرطان تنطوي على تعديلات على الشكل النووي وهيكل1،2، التي تقترن عادة ب 'تليين'3،نواة4. المقاومة النووية إلى تشوه الميكانيكية اتسمت عموما بتطبيق قوة على نواة معزولة5.
النواة في الخلايا متصل جزيئيا cytoskeleton "رابط نوكليوسكيليتون" وسيتوسكيليتون (اللغوي) مجمع6،7،،من89. نتيجة لذلك تم دمج النواة ميكانيكيا مع سيتوسكيليتون، ومن خلال خلية التحتية الالتصاقات، المصفوفة خارج الخلية. ميكانيكيا السبر النواة داخل الخلايا ملتصقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة هذا التكامل الميكانيكية. وتشمل أساليب التلاعب بالنوى في الخلايا الحية ميكروبيبيتي تطلع10،11، والقوة الذرية مجهرية12،،من1314. ونحن مؤخرا وصف قوة مباشرة تحقيق (منسقي) الذي ينطبق على القوات الميكانيكية مباشرة على النواة في خلية ملتصقة معيشة15.
هنا، فإننا مخطط الإجراء المتعلق باستخدام نظام microinjection التي تتوفر عادة في مرافق الفحص المجهري لتطبيق قوة ميكانيكية نانو نطاق معروفة، مباشرة إلى النواة في زنزانة ملتصقة. فيمتوتيب (القطر ميكروبيبيتي نصيحة 0.5 ميكرومتر) شنت ومتصلا بالنظام microinjection بأنبوب. تلميح، المتمركزة بزاوية 45 درجة بالنسبة إلى سطح الطبق الثقافة، خفضت حتى المتاخمة لسطح النووية. ثم قطع الأنبوب وفتحه في الغلاف الجوي، مما يخلق ضغط شفط سلبي على السطح النووي والأختام نصيحة ميكروبيبيتي ضد السطح النووية. من خلال ترجمة طرف ميكروبيبيتي، النواة مشوهاً وفي نهاية المطاف (تبعاً لحجم القوة المطبقة)، بعيدة عن ميكروبيبيتي. هذه المفرزة عند تساوي القوى (مقاومة) استعادة، تمارسه خلية ونواة قوة الشفط تطبقها ميكروبيبيتي. يمكن إجراء التحليل بقياس تشريد النواة، سلالة طول (المعادلة 1)، أو سلالة المنطقة (الشكل 1A).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:843px;" width="843">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">FluoroDish</td>
			<td style="width:71px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;">FD35</td>
			<td style="width:355px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:299px;">SYTO 59</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S11341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Femtotips&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf</td>
			<td align="right">930000043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">InjectMan NI2</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>discontinued, current equivalent model: InjectMan 4</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">FemtoJet</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>Current model FemtoJet 4i</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Plan Fluor oil immersion 40x</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Apo TIRF oil immersion 60x</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:299px;">Donor Bovine Serum (DBS)</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">16030074</td>
			<td>NIH 3T3 serum</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s (DMEM)</td>
			<td style="width:71px;">Mediatech cellgro</td>
			<td style="width:119px;">MT10013CVRF</td>
			<td>NIH 3T3 medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Mediatech</td>
			<td style="width:119px;">MT30004CIRF</td>
			<td>NIH 3T3 medium supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Immersion Oil Type LDF Non-Fluorescing</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td align="right" style="width:119px;">77007</td>
			<td>Immersion oil for objective lens&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a direct force probe for measuring mechanical integration between the nucleus and the cytoskeleton

تحديد الخواص الميكانيكية للنواة ردها إلى القوات الميكانيكية المتولدة في الخلايا. نظراً لأن النواة جزيئيا المستمر مع سيتوسكيليتون، يلزم أساليب التحقيق سلوكها الميكانيكي في الخلايا ملتصقة. وهنا نناقش المسبار القوة المباشرة (منسقي) كأداة لتطبيق القوة مباشرة إلى النواة في خلية حية ملتصقة. أننا نعلق ميكروبيبيتي ضيقة على السطح النووي مع الشفط. وتترجم في ميكروبيبيتي بعيداً عن النواة، الذي يسبب النواة تشوه وترجمة. عند استعادة قوة مساوية لقوة الشفط، النواة يفصل ويرتاح الاستيكالي. لأن الضغط شفط هو يعرف على وجه التحديد، المعروف قوة على السطح النووي. هذا الأسلوب وكشفت أن قوات نانو الحجم كافية لتشوه وترجمة النواة في خلايا ملتصقة، وحددت العناصر سيتوسكيليتال التي تمكن النواة مقاومة القوات. يمكن استخدامها منسقي تشريح مساهمات المكونات الخلوية والنووية للخصائص الميكانيكية النووية في الخلايا الحية.

ويبين الشكل 2 ألف إرغام المعاهد الوطنية للصحة 3T3 الماوس تنتجها الخلايا الليفية نواة. كما تتم ترجمة نصيحة ميكروبيبيتي إلى اليمين، النواة تبعثر ويفصل في نهاية المطاف من طرف ميكروبيبيتي. ويعتبر سلالة طول نواة يزيد مع زيادة قوة الشفط (الشكل 2). ...

Watch this Scientific Journal Video about A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton at JoVE.com

A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton

تحقيق قوة مباشرة لقياس التكامل الميكانيكية بين النواة وسيتوسكيليتون

في هذا البروتوكول، يصف لنا طريقة ميكروبيبيتي لمباشرة تطبيق قوة الخاضعة للرقابة على النواة في خلية حية. ويسمح هذا الفحص الاستجواب للخصائص الميكانيكية النووية في الخلية الحية، وملتصقة.

The mechanical properties of the nucleus determine its response to mechanical forces generated in cells. Because the nucleus is molecularly continuous ...

a-direct-force-probe-for-measuring-mechanical-integration-between

Research

JoVE Journal

Biochemistry

15.0K Views.  University of Florida. في هذا البروتوكول، يصف لنا طريقة ميكروبيبيتي لمباشرة تطبيق قوة الخاضعة للرقابة على النواة في خلية حية. ويسمح هذا الفحص الاستجواب للخصائص الميكانيكية النووية في الخلية الحية، وملتصقة.

Video: A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the excitability of neurons. The subcellular distribution of these channels in pyramidal neurons of hippocampal area CA1 is regulated by tetratricopeptide repeat-containing Rab8b interacting protein (TRIP8b), an auxiliary subunit. Genetic knockout of HCN pore forming subunits or TRIP8b, both lead to an increase in antidepressant-like behavior, suggesting that limiting the function of HCN channels may be useful as a treatment for Major Depressive Disorder (MDD). Despite significant therapeutic interest, HCN channels are also expressed in the heart, where they regulate rhythmicity. To circumvent off-target issues associated with blocking cardiac HCN channels, our lab has recently proposed targeting the protein-protein interaction between HCN and TRIP8b in order to specifically disrupt HCN channel function in the brain. TRIP8b binds to HCN pore forming subunits at two distinct interaction sites, although here the focus is on the interaction between the tetratricopeptide repeat (TPR) domains of TRIP8b and the C terminal tail of HCN1. In this protocol, an expanded description of a method for purifying TRIP8b and executing a high throughput screen to identify small molecule inhibitors of the interaction between HCN and TRIP8b, is described. The method for high throughput screening utilizes a Fluorescence Polarization (FP) -based assay to monitor the binding of a large TRIP8b fragment to a fluorophore-tagged eleven amino acid peptide corresponding to the HCN1 C terminal tail. This method allows &#39;hit&#39; compounds to be identified based on the change in the polarization of emitted light. Validation assays are then performed to ensure that &#39;hit&#39; compounds are not artifactual.

The interaction between HCN channels and their auxiliary subunit has been identified as a therapeutic target in Major Depressive Disorder. Here, a fluorescence polarization-based method for identifying small molecule inhibitors of this protein-protein interaction, is presented.

طريقة لتحديد الصغيرة جزيء مثبطات التفاعل البروتين البروتين بين HCN1 وTRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. Hydrogen-Deuterium Exchange (HDX) measured at rapid time scales is uniquely suited to detect structures and hydrogen bonding networks that are briefly populated, allowing for the characterization of transient conformers in native ensembles. Coupling of HDX to mass spectrometry offers several key advantages, including high sensitivity, low sample consumption and no restriction on protein size. This technique has advanced greatly in the last several decades, including the ability to monitor HDX labeling times on the millisecond time scale. In addition, by incorporating the HDX workflow onto a microfluidic platform housing an acidic protease microreactor, we are able to localize dynamic properties at the peptide level. In this study, Time-Resolved ElectroSpray Ionization Mass Spectrometry (TRESI-MS) coupled to HDX was used to provide a detailed picture of residual structure in the tau protein, as well as the conformational shifts induced upon hyperphosphorylation.

Conformational flexibility plays a critical role in protein function. Herein, we describe the use of time-resolved electrospray ionization mass spectrometry coupled to hydrogen-deuterium exchange for probing the rapid structural changes that drive function in ordered and disordered proteins.

وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. Atomic force microscopy (AFM) can address this problem by enabling stretching and relaxation of single protein molecules, which gives direct evidence of specific unfolding and refolding characteristics. AFM-based single-molecule force-spectroscopy (AFM-SMFS) provides a means to consistently measure high-energy conformations in proteins that are not possible in traditional bulk (biochemical) measurements. Although numerous papers were published to show principles of AFM-SMFS, it is not easy to conduct SMFS experiments due to a lack of an exhaustively complete protocol. In this study, we briefly illustrate the principles of AFM and extensively detail the protocols, procedures, and data analysis as a guideline to achieve good results from SMFS experiments. We demonstrate representative SMFS results of single protein mechanical unfolding measurements and we provide troubleshooting strategies for some commonly encountered problems.

We describe the detailed procedures and strategies to measure the mechanical properties and mechanical unfolding pathways of single protein molecules using an atomic force microscope. We also show representative results as a reference for selection and justification of good single protein molecule recordings.

التحليل الطيفي لجزيئات البروتين وحيد باستخدام مجهر قوة ذرية قوة

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which may be essential for a given protein&#39;s role both physiologically and pathologically. Enrichment of PTMs is often necessary when investigating the PTM status of a target protein, because PTMs are often transient and relatively low in abundance. Many pitfalls are encountered when enriching for a PTM of a target protein, such as buffer incompatibility, the target protein antibody is not IP-compatible, loss of PTM signal, and others. The degree of difficulty is magnified when investigating multiple PTMs like acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3, and tyrosine phosphorylation for a given target protein. Studying a combination of these PTMs may be necessary, as crosstalk between PTMs is prevalent and critical for protein regulation. Often, these PTMs are studied in different lysis buffers and with unique inhibitor compositions. To simplify the process, a unique denaturing lysis system was developed that effectively isolates and preserves these four PTMs; thus, enabling investigation of potential crosstalk in a single lysis system. A unique filter system was engineered to remove contaminating genomic DNA from the lysate, which is a problematic by-product of denaturing buffers. Robust affinity matrices targeting each of the four PTMs were developed in concert with the buffer system to maximize the enrichment and detection of the endogenous states of these four PTMs. This comprehensive PTM detection toolset streamlines the process of obtaining critical information about whether a protein is modified by one or more of these PTMs.

Investigating multiple, endogenous post-translational modifications for a target protein can be extremely challenging. Techniques described here utilize an optimized lysis buffer and filter system developed with specific PTM-targeting, affinity matrices to detect the acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3, and tyrosine phosphorylation modifications for a target protein using a single, streamlined system.

استخدام نظام إثراء إيمونوبريسيبيتيشن شاملة لتحديد ملف تعريف تعديل بوستترانسلاشونال ذاتية للبروتينات المستهدفة

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content is rather low in all organisms, amounting in plants to about 0.009% of dry weight. To date, one of the most accurate methods for measuring iron concentration in plant tissues is flame absorption atomic spectroscopy. However, this approach is time-consuming and expensive and requires specific equipment not commonly found in plant laboratories. Therefore, a simpler, yet accurate method that can be routinely used is needed. The colorimetric Prussian Blue method is regularly used for qualitative iron staining in animal and plant histological sections. In this study, we adapted the Prussian Blue method for quantitative measurements of iron in tobacco leaves. We validated the accuracy of this method using both atomic spectroscopy and Prussian Blue staining to measure iron content in the same samples and found a linear regression (R2 = 0.988) between the two procedures. We conclude that the Prussian Blue method for quantitative iron measurement in plant tissues is precise, simple, and inexpensive. However, the linear regression presented here may not be appropriate for other plant species, due to potential interactions between the sample and the reagent. Establishment of a regression curve is thus needed for different plant species.

We present a simple and reliable protocol for measuring iron content in plant tissues using the colorimetric Prussian Blue method.

أسلوب قياس ألوان لقياس محتوى الحديد في النباتات

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For a long time, the gene expression studies were dominated by research on the transcriptional level. However, the steady-state levels of mRNAs do not correlate well with protein production, and the translatability of mRNAs varies greatly depending on the conditions. In some organisms, like the parasite Leishmania, the protein expression is regulated mostly at the translational level. Recent studies demonstrated that protein translation dysregulation is associated with cancer, metabolic, neurodegenerative and other human diseases. Polysome profiling is a powerful method to study protein translation regulation. It allows to measure the translational status of individual mRNAs or examine translation on a genome-wide scale. The basis of this technique is the separation of polysomes, ribosomes, their subunits and free mRNAs during centrifugation of a cytoplasmic lysate through a sucrose gradient. Here, we present a universal polysome profiling protocol used on three different models - parasite Leishmania major, cultured human cells and animal tissues. Leishmania cells freely grow in suspension and cultured human cells grow in adherent monolayer, while mouse testis represents an animal tissue sample. Thus, the technique is adapted to all of these sources. The protocol for the analysis of polysomal fractions includes detection of individual mRNA levels by RT-qPCR, proteins by Western blot and analysis of ribosomal RNAs by electrophoresis. The method can be further extended by examination of mRNAs association with the ribosome on a transcriptome level by deep RNA-seq and analysis of ribosome-associated proteins by mass spectroscopy of the fractions. The method can be easily adjusted to other biological models.

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

The overall goal of polysome profiling technique is analysis of translational activity of individual mRNAs or transcriptome mRNAs during protein synthesis. The method is important for studies of protein synthesis regulation, translation activation and repression in health and multiple human diseases.

Polysome التنميط في الليشمانياوالخلايا البشرية والخصية الماوس

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and functions. It gave us the opportunity to explore a multiplicity of biophysical mechanisms, e.g., how bacterial adhesins bind to host surface receptors in more detail. Among other factors, the success of SMFS experiments depends on the functional and native immobilization of the biomolecules of interest on solid surfaces and AFM tips. Here, we describe a straightforward protocol for the covalent coupling of proteins to silicon surfaces using silane-PEG-carboxyls and the well-established N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) chemistry in order to explore the interaction of pilus-1 adhesin RrgA from the Gram-positive bacterium Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) with the extracellular matrix protein fibronectin (Fn). Our results show that the surface functionalization leads to a homogenous distribution of Fn on the glass surface and to an appropriate concentration of RrgA on the AFM cantilever tip, apparent by the target value of up to 20% of interaction events during SMFS measurements and revealed that RrgA binds to Fn with a mean force of 52 pN. The protocol can be adjusted to couple via site specific free thiol groups. This results in a predefined protein or molecule orientation and is suitable for other biophysical applications besides the SMFS.

This protocol describes the covalent immobilization of proteins with a heterobifunctional silane coupling agent to silicon-oxide surfaces designed for the atomic force microscopy based single molecule force spectroscopy which is exemplified by the interaction of RrgA (pilus-1 tip adhesin of S. pneumoniae) with fibronectin.

تجميد التساهمية من البروتينات للتحليل الطيفي قوة جزيء واحد

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane proteins and other molecules, and diverse luminal content inherited from a parent cell, which includes RNAs, proteins, and DNAs. The characterization of the hydrodynamic sizes of EVs, which depends on the size of the vesicle and its coronal layer formed by surface decorations, has become routine. For exosomes, the smallest of EVs, the relative difference between the hydrodynamic and vesicles sizes is significant. The characterization of vesicles sizes by the cryogenic transmission electron microscopy (cryo-TEM) imaging, a gold standard technique, remains a challenge due to the cost of the instrument, the expertise required to perform the sample preparation, imaging and data analysis, and a small number of particles often observed in images. A widely available and accessible alternative is the atomic force microscopy (AFM), which can produce versatile data on three-dimensional geometry, size, and other biophysical properties of extracellular vesicles. The developed protocol guides the users in utilizing this analytical tool and outlines the workflow for the analysis of EVs by the AFM, which includes the sample preparation for imaging EVs in hydrated or desiccated form, the electrostatic immobilization of vesicles on a substrate, data acquisition, its analysis, and interpretation. The representative results demonstrate that the fixation of EVs on the modified mica surface is predictable, customizable, and allows the user to obtain sizing results for a large number of vesicles. The vesicle sizing based on the AFM data was found to be consistent with the cryo-TEM imaging.&#160;

A step-by-step procedure is described for label-free immobilization of exosomes and extracellular vesicles from liquid samples and their imaging by atomic force microscopy (AFM). The AFM images are used to estimate the size of the vesicles in the solution and characterize other biophysical properties.&#160;

تصوير الحويصلات خارج الخلية عن طريق الفحص المجهري للقوة الذرية

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced contrast due to optical sectioning. The conventional approach is to use high numerical aperture microscope TIRF objectives for both excitation and collection, severely limiting the field of view and throughput. We present a novel approach to generating TIRF excitation for imaging with optical waveguides, called chip-based nanoscopy. The aim of this protocol is to demonstrate how chip-based imaging is performed in an already built setup. The main advantage of chip-based nanoscopy is that the excitation and collection pathways are decoupled. Imaging can then be done with a low magnification lens, resulting in large field of view TIRF images, at the price of a small reduction in resolution. Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) were imaged using direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM), showing a resolution comparable to traditional super-resolution microscopes. In addition, we demonstrate the high-throughput capabilities by imaging a 500 &#181;m x 500 &#181;m region with a low magnification lens, providing a resolution of 76 nm. Through its compact character, chip-based imaging can be retrofitted into most common microscopes and can be combined with other on-chip optical techniques, such as on-chip sensing, spectroscopy, optical trapping, etc. The technique is thus ideally suited for high throughput 2D super-resolution imaging, but also offers great opportunities for multi-modal analysis.

Chip-based super-resolution optical microscopy is a novel approach to fluorescence microscopy and offers advantages in cost effectiveness and throughput. Here, the protocols for chip preparation and imaging are shown for TIRF microscopy and localization-based super-resolution microscopy.

عاليه الانتاجيه الكلي الداخلية انعكاس الفلورية والتوجيه العشوائي البصرية أعاده البناء المجهري باستخدام رقاقه فوتوسونيك

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this enzyme can hydrolyze dNTPs into their corresponding nucleosides and inorganic triphosphates. Due to its critical role in nucleotide metabolism, its association to several pathologies, and its role in therapy resistance, intense research is currently being carried out for a better understanding of both the regulation and cellular function of this enzyme. For this reason, development of simple and inexpensive high-throughput amenable methods to probe small molecule interaction with SAMHD1, such as allosteric regulators, substrates, or inhibitors, is vital. To this purpose, the enzyme-coupled malachite green assay is a simple and robust colorimetric assay that can be deployed in a 384-microwell plate format allowing the indirect measurement of SAMHD1 activity. As SAMHD1 releases the triphosphate group from nucleotide substrates, we can couple a pyrophosphatase activity to this reaction, thereby producing inorganic phosphate, which can be quantified by the malachite green reagent through the formation of a phosphomolybdate malachite green complex. Here, we show the application of this methodology to characterize known inhibitors of SAMHD1 and to decipher the mechanisms involved in SAMHD1 catalysis of non-canonical substrates and regulation by allosteric activators, exemplified by nucleoside-based anticancer drugs. Thus, the enzyme-coupled malachite green assay is a powerful tool to study SAMHD1, and furthermore, could also be utilized in the study of several enzymes which release phosphate species.

SAMHD1 is a deoxynucleoside triphosphate triphosphohydrolase with critical roles in human health and disease. Here we present a versatile enzyme-coupled SAMHD1 activity assay, deployed in a 384-well microplate format, that allows for the evaluation of small molecules and nucleotide analogues as SAMHD1 substrates, activators, and inhibitors.

فحص نشاط مقترن بإنزيم عالي الإنتاجية لفحص تفاعل الجزيء الصغير مع dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...