المساهمة الرئيسية لورقة لدينا هو أن قمنا باستكشاف المناظر الطبيعية الدقيقة والغرامة من أمراض بيتا اميلويد من الدماغ مرض الزهايمر مع تكنولوجيا التصوير من التصوير MALDI الطيفي الشامل. حققنا التطورات التكنولوجية من خلال توليد بروتوكول خاص مع حمض الفورميك قبل المعالجة من الشرائح الأنسجة. بعد MALDI-IMS، يتم إنشاء خرائط تجزئة ويتم إجراء الحسابات لاكتشاف البروتينات علامة جديدة أو الببتيدات التي يتم كولوسيد مع البلاك والأوعية الدموية تحت العنكبوتية.
الحصول على عينات القشرية البشرية لنظام الرصد الدولي من الأدمغة التي تم إزالتها ومعالجتها وتخزينها في ناقص 80 درجة مئوية في غضون ثماني ساعات بعد الوفاة. خذ عينة الدماغ من قشرة القذالي لمرضى AD والضوابط المطابقة للعمر. لقطع أقسام الأنسجة على التبريد، المركز الأول موصل أكسيد القصدير indium أو شرائح زجاج المجهر المغلفة ITO داخل كريوستات.
ادفأ عينة دماغ التشريح من ناقص 80 درجة مئوية إلى ناقص 22 درجة مئوية داخل التبريد. إرفاق شفرة جديدة يمكن التخلص منها إلى التبريد لكل تجربة. حاول دائما استخدام جزء نظيف من النصل.
وضع أدمغة التشريح المجمدة على خشبة المسرح جنبا إلى جنب مع كمية صغيرة من مجمع درجة حرارة القطع الأمثل. بالنسبة لنظام الرصد الدولي والكيمياء المناعية، قطع خمسة إلى ستة أقسام من كل عينة من الأنسجة. عندما يكون النصل قد بدأ في قطع الأنسجة، قم بتشغيل العجلة ووجه الكتلة حتى يتم كشف جميع الأنسجة.
إذا كان هناك خط صغير أو المسيل للدموع عبر القسم، انتظر في التبريد حتى تعديل درجة الحرارة تلقائيا بإصلاحه. عد بضع ثوان قبل فتح مكافحة لفة مع الأنسجة تحتها. ضع شريحة الأنسجة على الفور على الجانب المغلفة بـ ITO من الشريحة الزجاجية.
اذيب شريحة الأنسجة بوضع إصبع أسفل الشريحة على الجانب غير المغلفة بـ ITO. الأنسجة سوف تلتصق الشريحة. تأكد من أن الأنسجة مسطحة قدر الإمكان مع عدم وجود التجاعيد.
لشطف أقسام الأنسجة، غمر العينات في 40 إلى 100 ملليلتر من 70٪ الإيثانول في جرة تلطيخ الزجاج لمدة 30 ثانية لإزالة الدهون الذاتية والأملاح غير العضوية. اغسل العينات باستخدام تسلسل الغسيل المسرود في بروتوكول النص. ثم جفف العينات في فراغ لمدة 30 دقيقة.
الآن، علاج أقسام الأنسجة مع بخار حمض formic لتيون أفضل من بروتينات بيتا اميلويد من أنسجة الدماغ تشريح الجثة. للقيام بذلك، إعداد الفرن في 60 درجة مئوية وطبق زجاجي حضانة مع خمسة ملليلتر من حمض فورميك 100٪. الحفاظ على رطوبة الهواء في طبق الزجاج الحضانة في مستوى التشبع.
ضع شرائح الأنسجة في طبق زجاجي الحضانة مع تجنب الغمر في حمض الفورميك وعلاجه لمدة ست دقائق. التقاط صورة بصرية للعينات باستخدام ماسح ضوئي للفيلم أو ماسح هلام أو مجهر رقمي. تنفيذ هذه الخطوة في درجة حرارة الغرفة.
محاذاة الصورة البصرية للعينات ضرورية عندما يتم وضع الهدف العينة داخل الصك. عادة، فإنه لن يكون من الممكن التعرف على قسم الأنسجة تحت طبقة المصفوفة. لربط الصور البصرية مع العينات، وجعل علامات الدليل التي تكون مرئية في كل من الصورة البصرية وتحت طبقة المصفوفة في الكاميرا البصرية.
أسهل طريقة هي اكتشاف ثلاث علامات تصحيح على الأقل حول العينة قبل أخذ الصورة البصرية. لرش المصفوفة مع بخاخ بالموجات فوق الصوتية، وإزالة الأنسجة التي سيتم رشها من مجفف ووضعها في الغرفة. تأكد من أن الأنسجة لا تغطي نافذة الاستشعار.
ابدأ التحضير بالضغط على زر "ابدأ". عادة، وقت الإعدادية حوالي 90 دقيقة. سيتم تنظيم الإعداد تلقائيا عن طريق رصد سمك طبقة المصفوفة والرطوبة.
بدلا من ذلك، لرش حل المصفوفة على سطح الأنسجة مع بخاخ التلقائي، واستخدام نظام مضخة المذيبات تعيين في 10 psi و 0.15 ملليلتر في الدقيقة الواحدة لتقديم حل المصفوفة. سيتم تسليم تدفق مستمر من الغاز غماد ساخنة بشكل مُلتَسَن مع رذاذ حل المصفوفة. إجراء تجارب تصوير عالية الإنتاجية وعالية الدقة المكانية مع MALDI-IMS.
لقياس الطيف الكتلي، حدد مناطق الأنسجة باستخدام برنامج التحكم MALDI وبرنامج تحليل البيانات. اكتساب الأطياف في وضع خطي إيجابي مع نطاق نسبة كتلة إلى تهمة من 2،000 إلى 20،000 ودقة المكانية من 20 و 100 ميكرون. لجعل معيار المعايرة، قم بحل معيار معايرة الببتيد ومعايرة البروتين بنسبة 1 إلى 4 مع محلول CHCA و TA30 ثم قم بتخفيفه 10 مرات.
ضع ميكرولتر واحد من معيار المعايرة على الشريحة في أربعة مواقع مختلفة. باستخدام برامج علم الأنسجة الجزيئية، تراكب صور إشارة متعددة للعثور على الارتباط المكاني لإشارات مختلفة مثل مختلف الببتيدات بيتا الأميلويد في لويحات خرف والجدران الشريانية. كان اعتلال الأوعية الدماغية أو الأنماط الظاهرية CAA للمريض رقم ثلاثة أبرز في هذه الدراسة.
MALDI-IMS من أنسجة دماغ هذا المريض تصور بوضوح أن بيتا اميلويد 1-42 و أمايلويد بيتا 1-43 تم إيداعها بشكل تفضيلي كلويحات خرف في البارينتشيما الدماغية. وعلى النقيض من ذلك، تم إيداع بيتا اميلويد أقصر مثل بيتا اميلويد 1-36 إلى 1-41 بشكل تفضيلي على مناطق الأوعية الدموية leptomeningeal. لم تكن هناك إشارات هامة في السيطرة غير المرضية.
تم التحقق من توزيعات بيتا اميلويد 1-40 و اميلويد بيتا 1-42 مع الكيمياء المناعية باستخدام الأجزاء المجمدة المجاورة من الأنسجة. بيتا المضادة اميلويد 1-40 الأجسام المضادة المسمى CAA وكشفت اميلويد بيتا 1-40 هو إيداعها بشكل تفضيلي في الأوعية الدموية leptomeningeal, وهو تناقض واضح لتوزيع بيتا اميلويد 1-42 في الشلل الدماغي كما لويحات خرف. يظهر هنا هو خريطة تجزئة التي تم الحصول عليها مع تحليل جزئي k-يعني تطبيقها على نفس القسم من المريض رقم ثلاثة.
وقد نجحت طريقة التجميع هذه في تحديد الهياكل الشبيهة بالبلاك في الهياكل البارينشية والأوعية الدموية في الفضاء دون العنكبوتي. ومن المثير للاهتمام أن تجد منطقة دائرية صغيرة في parenchyma التي تم الكشف عنها فقط حول شريان صغير في parenchyma وكذلك في الفضاء subarachnoid. يتم التحقق من ذلك من خلال صور أيون واحدة من هذه الببتيدات بيتا اميلويد الفردية.
هناك حد لتتبع مجموعة واسعة من بيتا اميلويد في وقت واحد حتى لو كان استخدام الأجسام المضادة محددة. هنا، نعرض توزيع بيتا اميلويد في أدمغة الإنسان باستخدام أحدث MALDI التصوير طريقة قياس الطيف الكتلي. ونحن نعتقد أن هذه المساهمة يجعل اختراق في أبحاث مرض الزهايمر لأن هذا التقرير يقدم وصفا لمجموعة كاملة من البروتينات بيتا اميلويد في الدماغ تشريحها الإنسان.
النتيجة الأكثر إثارة للإعجاب هو أن واحد فقط من الأحماض الأمينية تغيير في محطة C من بروتين بيتا اميلويد يجعل تغييرا جذريا في توزيعها. خطوات إعداد الأنسجة حاسمة للحصول على تأين فعال من البروتينات المجمعة في أنسجة الدماغ البشري. cocrystallization متجانسة من التحليل مع المصفوفات حاسمة لحساسية عالية والتصوير خالية من القطع الأثرية.
