私たちの論文の主な貢献は、MALDIイメージング質量分析のイメージング技術を用いて、アルツハイマー病脳のアミロイドベータ病理の正確で細かい景観を探求したことです。組織スライドの前処理を行うギ酸を用いた特別なプロトコルを生成し、技術の進歩を達成しました。MALDI-IMSに続いて、セグメンテーションマップが生成され、プラークおよびくも膜下血管系と共局化した新規マーカータンパク質またはペプチドを発見するための計算が行われる。
IMSのヒト皮質標本を、死後8時間以内に取り出し、処理し、マイナス80度で保存した脳から取得する。AD患者の後頭部皮質と年齢に一致したコントロールから脳標本を取る。クライオスタット上の組織切片を切断するために、第一位の導電性インジウム酸化スズまたはITOコーティング顕微鏡ガラスは、クライオスタットの内側にスライドします。
検死脳標本をマイナス80度から低温検査中にマイナス22度まで温めます。すべての実験のためにクライオスタットに新しい使い捨てブレードを取り付けます。常にブレードのきれいな部分を使用してみてください。
少量の最適な切断温度化合物と一緒にステージ上に凍結解剖脳を置きます。IMSおよび免疫組織化学の場合、各組織サンプルから5〜6切片を切断する。ブレードがティッシュを切り始めたばかりのら、車輪を回し、すべての組織が露出するまでブロックに向かいます。
セクション全体に小さな筋や涙がある場合は、温度調整が自動的に修正されるまでクライオスタットで待ちます。下の組織でアンチロールを開く前に数秒を数えます。すぐに、ガラススライドのITOコーティング側に組織スライスを置きます。
非ITOコーティング側のスライドの下に指を置くことによって、組織スライスを解凍します。組織はスライドに固執します。ティッシュはしわなしでできるだけ平らであることを確認してください。
組織切片をすすくい、ガラス染色瓶に70%エタノールの40〜100ミリリットルのサンプルを浸し、内因性脂質および無機塩を除去する。テキストプロトコルに記載されている洗浄シーケンスを使用してサンプルを洗浄します。その後、真空中で30分間乾燥させます。
さて、検死脳組織からのアミロイドベータタンパク質のより良いイオン化のためにギ酸蒸気で組織切片を治療する。これを行うには、オーブンを摂氏60度で準備し、5ミリリットルの100%ギ酸をインキュベーショングラス皿に準備します。インキュベーションガラス皿の空気湿度を飽和度に保ちます。
培養ガラス皿に組織スライドを入れ、ギ酸中の水没を避け、6分間治療します。フィルムスキャナー、ゲルスキャナー、またはデジタル顕微鏡を使用してサンプルの光学画像を撮影します。このステップは室温で実行します。
サンプルターゲットが機器の内部に配置される場合、サンプルの光学画像の位置合わせが必要です。通常、マトリックス層の下の組織部を認識することはできない。光学画像をサンプルと関連付けるには、光学画像とカメラ光学のマトリックス層の下の両方に表示されるガイドマークを作成します。
最も簡単な方法は、光学画像を撮影する前に、サンプルの周りに少なくとも3つの補正流体マークを見つけることです。超音波噴霧器でマトリックスをスプレーするには、デシケータから噴霧する組織を取り出し、チャンバーに置きます。組織がセンサーのウィンドウを覆っていないか確認してください。
[スタート]ボタンを押して準備を開始します。通常、準備時間は約90分です。準備はマトリックス層の厚さおよび湿気の監視によって自動的に調節される。
あるいは、自動噴霧器で組織表面にマトリックス溶液を噴霧するために、1分あたり10 psiと0.15ミリリットルに設定された溶媒ポンプシステムを使用してマトリックス溶液を送達する。加熱されたシースガスの一定の流れはマトリックスの解決のスプレーと共同で渡される。MALDI-IMS を使用して、ハイスループットおよび高空間分解能イメージング実験を行います。
質量分析測定では、MALDI制御ソフトウェアとデータ解析ソフトウェアを使用して組織領域を定義します。質量対電荷比の範囲が2,000~20,000、空間分解能が20~100ミクロンの正の線形モードでスペクトルを取得します。校正規格を作るために、ペプチド校正標準とタンパク質較正標準をCHCAおよびTA30溶液と1~4倍の比率で溶解し、それを10倍希釈します。
4つの異なる場所のスライドにキャリブレーション標準の1マイクロリットルを置きます。分子構造ソフトウェアを用いて、複数のシグナル画像を重ね、異なるアミロイドベータペプチドが老人斑や動脈壁に同局化するなどの様々なシグナルの空間的相関を見つける。患者番号3の脳アミロイド血管症またはCAAフェノタイプは、この研究で最も顕著であった。
この患者の脳組織のMALDI-IMSは、アミロイドベータ1-42およびアミロイドベータ1-43が脳のパレンチマにおいて老人斑として優先的に沈着したことを明確に可視化した。対照的に、アミロイドβ1-36〜1-41のような短いアミロイドベータは、レプトメニンゲ血管領域に優先的に沈着した。非病理学的制御には有意なシグナルはなかった。
アミロイドβ1-40およびアミロイドβ1-42の分布は、組織の隣接する凍結切片を用いて免疫組織化学でさらに検証された。抗アミロイドβ1-40抗体標識CAAおよびアミロイドβ1-40は、レプトメニンゲザル血管に優先的に沈着しており、これは、老人斑としての脳小板中のアミロイドベータ1-42の分布とは対照的である。ここに示されているのは、患者番号3から同じセクションに適用される二分k-平均分析で得られたセグメンテーションマップである。
このクラスタリング法は、くも膜下腔内のパレンチマおよび血管構造におけるプラーク様構造の同定に成功した。パレンチマの小さな動脈の周りだけでなく、くも膜下の空間で検出されるパレンチマの小さな円形の領域を見つけることは興味深いです。これは、これらの個々のアミロイドベータペプチドの単一のイオン画像によって検証される。
特定の抗体を使用する場合でも、アミロイドベータの広い範囲を同時に追跡する限界があります。ここでは、最先端のMALDIイメージング質量分析法を用いてヒト脳におけるアミロイドベータの分布を示す。この報告書は、ヒト検死された脳におけるアミロイドベータタンパク質の完全なセットの特徴付けを提供するので、この貢献はアルツハイマー病研究にブレークスルーを行うと考えています。
最も印象的な発見は、アミロイドベータタンパク質のC末端で1つのアミノ酸変化だけがその分布に劇的な変化を起こしていることである。組織調製工程は、ヒト脳組織中の凝集タンパク質の有効なイオン化を得るために重要である。高感度および人工物のないイメージングに不可欠なマトリックスを有する検体の均質な同結晶化。
