Основной вклад нашей работы заключается в том, что мы исследовали точный и тонкий ландшафт амилоидной бета-патологии мозга болезни Альцгеймера с помощью технологии визуализации масс-спектрометрии изображений MALDI. Мы достигли технологических достижений, генерируя специальный протокол с предварительной обработкой кислоты слайдов тканей. После MALDI-IMS генерируются карты сегментации и выполняются расчеты, чтобы обнаружить новые маркерные белки или пептиды, колокализованные с налетом и субарахноидальная сосудоустратура.
Получить человеческие корковые образцы для IMS из мозгов, которые были удалены, обработаны и хранятся при температуре минус 80 градусов по Цельсию в течение восьми часов после смерти. Возьмите образец мозга из затылочной коры пациентов АД и возрастных элементов управления. Чтобы сократить ткани разделов на криостат, первое место проводящих оксида олова индия или ITO покрытием микроскопа стеклянные слайды внутри криостата.
Разогреть образец мозга вскрытия от минус 80 градусов по Цельсию до минус 22 градусов по Цельсию внутри криостата. Прикрепите новое одноразовое лезвие к криостату для каждого эксперимента. Всегда старайтесь использовать чистую часть лезвия.
Положите замороженные мозги вскрытия на сцене вместе с небольшим количеством оптимального соединения температуры резки. Для IMS и иммуногистохимии, вырезать пять-шесть разделов из каждого образца ткани. Когда лезвие только начинает резать ткани, поверните колесо и лицом к блоку, пока все ткани подвергаются.
Если есть небольшая полоса или разрыв по всей секции, подождите в криостате, пока регулировка температуры автоматически фиксирует его. Подсчитайте несколько секунд, прежде чем открыть анти-ролл с тканью под ним. Немедленно поместите кусочек ткани на стороне стеклянной горки с покрытием ITO.
Оттепель ткани ломтик, положив палец под слайд на стороне, не-ITO покрытием. Ткань будет прилипать к слайду. Убедитесь, что ткань как можно более плоская без морщин.
Чтобы промыть секции тканей, погрузите образцы в 40-100 миллилитров 70%этанола в стеклянную банку для окрашивания в течение 30 секунд, чтобы удалить эндогенные липиды и неорганические соли. Вымойте образцы с помощью последовательности стирки, перечисленной в текстовом протоколе. Затем высушите образцы в вакууме в течение 30 минут.
Теперь, лечить ткани разделов с паров миновой кислоты для лучшей ионизации амилоидных бета-белков из вскрытия ткани мозга. Для этого подготовьтесь к духовке при температуре 60 градусов по Цельсию и инкубационо-стеклянному блюду с пятью миллилитров 100%-процентной кислоты. Держите влажность воздуха в инкубационом стеклянном блюде на уровне насыщения.
Поместите ткани слайды в инкубационо-стеклянной тарелке, избегая погружения в кремовую кислоту и лечить в течение шести минут. Сделайте оптическое изображение образцов с помощью сканера пленки, сканера геля или цифрового микроскопа. Выполните этот шаг при комнатной температуре.
Выравнивание оптического изображения образцов необходимо при размещении образцовой цели внутри прибора. Как правило, невозможно распознать участок ткани под матричным слоем. Чтобы соотнести оптические изображения с образцами, сделайте направляющий знак, который виден как на оптическом изображении, так и под матричным слоем в оптической камере.
Самый простой способ заключается в том, чтобы обнаружить по крайней мере три коррекции жидкости знаки вокруг образца, прежде чем принимать оптическое изображение. Чтобы распылить матрицу с помощью ультразвукового опрыскивателя, удалите ткань, которая будет распылена из децикатора и поместите его в камеру. Убедитесь, что ткань не закрывает окно датчика.
Начните подготовку, нажав кнопку «Пуск». Как правило, время подготовки составляет около 90 минут. Препарат будет регулироваться автоматически с помощью мониторинга толщины и влажности матричного слоя.
Кроме того, чтобы распылить матричный раствор на поверхности ткани с помощью автоматического опрыскивателя, используйте систему растворителя насоса, установленную на 10 пси и 0,15 миллилитров в минуту, чтобы доставить матричное решение. Постоянный поток газа с подогревом оболочки будет поставляться в связи с матричный раствор спрей. Выполните эксперименты по визуализации с высокой пропускной способностью и высоким пространственным разрешением с помощью MALDI-IMS.
Для измерения масс-спектрометрии определите области тканей с помощью программного обеспечения для управления MALDI и программного обеспечения для анализа данных. Приобретайте спектры в положительном линейном режиме с диапазоном соотношения массы и заряда от 2000 до 20 000 и пространственным разрешением 20 и 100 микрон. Чтобы сделать калибровку стандартной, растворите стандарт калибровки пептида и стандарт калибровки белка в соотношении один к четырем с раствором CHCA и TA30, а затем разбавляйте его 10 раз.
Поместите один микролитер стандарта калибровки на слайде в четырех разных местах. Используя программное обеспечение молекулярной гистологии, наложить несколько изображений сигнала, чтобы найти пространственную корреляцию различных сигналов, таких как различные амилоидные бета пептиды колокализации в старческими бляшками и артериальных стенок. Церебральная амилоидная ангиопатия или фенотипы CAA пациента номер три были наиболее заметными в этом исследовании.
MALDI-IMS ткани мозга этого пациента четко визуализированы, что амилоидная бета 1-42 и амилоидная бета 1-43 были преимущественно отложены в качестве старческого бляшек в церебральной паренхиме. В отличие от этого, короткие амилоидные бета, такие как амилоидная бета 1-36 до 1-41 были преимущественно отложены на лептоменингеальных сосудистых областях. Существенных сигналов в не патологическом контроле не было.
Распределения амилоидной бета 1-40 и амилоидной бета 1-42 были дополнительно проверены с помощью иммуногистохимии с использованием соседних замороженных участков тканей. Анти-амилоидная бета 1-40 антитела помечены CAA и показали амилоид бета 1-40 преимущественно откладывается в лептоменингеальных кровеносных сосудов, что явно контрастирует с распределением амилоидной бета 1-42 в мозговой паренхимы, как старческий бляшек. Здесь показана карта сегментации, полученная с помощью анализа к-средств, применяемого к тому же разделу с пациента номер три.
Этот метод кластеризации успешно идентифицировал структуры, похожие на бляшки в паренхиме и сосудистых структурах в субарахноидальное пространство. Интересно найти небольшую круглую область в паренхиме, которая обнаруживается только вокруг небольшого артериола в паренхиме, а также в субарахноидном пространстве. Это проверено одиночными ионные изображения этих отдельных амилоидных бета пептидов.
Существует предел для отслеживания широкого спектра амилоидных бета-версий одновременно, даже если с использованием конкретных антител. Здесь мы показываем распределение амилоидной бета-версии в мозге человека с помощью передового метода масс-спектрометрии изображений MALDI. Мы считаем, что этот вклад делает прорыв в исследовании болезни Альцгеймера, потому что этот доклад предлагает характеристику полного набора амилоидных бета-белков в организме человека.
Наиболее впечатляющим выводом является то, что только одна аминокислота изменения в терминале C амилоидного бета-белка делает резкое изменение в их распределении. Шаги по подготовке тканей имеют решающее значение для получения эффективной ионизации агрегированных белков в тканях мозга человека. Однородная кокристаллизация аналита с матрицами, решающими для высокой чувствительности и изображения без артефактов.
