ونحن نشكر الدكتور مينامي ناوجيرو (جامعة كيوتو) لتوفير الفئران Oog1pro3.9 . أيد هذا البحث JSPS (كاكينهي # JP15H06275) ومؤسسة نيتو.

تم إيواء الفئران في غرفة التحكم بيئياً في 23 ± 1 درجة مئوية مع ح 12 ضوء/12 ح دورة الظلام. بروتوكولات الرعاية الحيوانية وتجارب أجريت وفقا للمبادئ التوجيهية "التجارب الحيوانية" في جامعة الطب إيشي ووافقت عليها واجب رعاية الحيوانات واستخدام اللجنة.
1-إعداد الثقافة المتوسطة وأطباق
<ol><li>إعداد الأساسية الثقافة المتوسطة، إضافة المصل الجنيني البقري (FBS، 5% v/v)، FSH (100 mIU/mL)، LH (10 mU/mL)، والبنسلين-ستربتوميسين (البنسلين، يو/مليلتر 100؛ ستربتوميسين، 100 مغ/مل) إلى الحد الأدنى الأساسية المتوسطة ألفا (MEM-ألفا) ومزيج في أنابيب 50 مل. ملاحظة: مجموع أحجام الوسائط الثقافة المطلوبة تختلف بين التجارب، ولكن 1 مل من الثقافة المتوسطة يكفي بوجه عام عن 3.5 سم أسفل الزجاج ثقافة الأطباق.</li>
	<li>صب مختبرين 1 مل من مختلطة الثقافة المتوسطة في 3.5 سم أسفل الزجاج ثقافة الأطباق وتعيين مكان مم 30 خلية إدراج الثقافة في الأطباق. وسائل الإعلام قبل الحارة والاطباق في حاضنة (5% CO2 و 37 درجة مئوية).</li>
</ol>2-إعداد أنسجة المبيض
<ol><li>فوسفات الحارة قبل مخزنة المالحة (PBS) (−) والفنزويلية-ألفا التي تحتوي على 5% FBS و 100 يو/مليلتر البنسلين والستربتوميسين 100 مغ/مل في حاضنة (5% CO2 و 37 درجة مئوية). ملاحظة: حوالي 3 مل مختبرين "برنامج تلفزيوني" (−) كل المبيض تكفي للاستخدام أثناء تشريح المبيض، ومختبرين 1 مل من MEM-ألفا كافية لتخزين عابر المبايض واحد في الأطباق 3.5 سم.</li>
	<li>
المكوس المبايض من الفئران الممثل المدني الدولي (المسماة بعد معهد أبحاث السرطان) الإناث 4-الأسبوع القديمة وقطع الأنسجة المحيطة بالمبيض باستخدام مقص وملاقط تحت مجهر مجسمة. احتياطي المبيض تمت إزالتها في الثقافة المتوسطة (راجع الخطوة 2، 1) حتى الاستخدام.
	<ol>
<li>قبل استعد مكان المبايض واحدة على ورقة تصفية مبلل مع "برنامج تلفزيوني" (−) (راجع الخطوة 2، 1) وشريحة إلى 4 قطع باستخدام شفرة مبضع تحت مجهر مجسمة. ملاحظة: المبايض فئران الممثل المدني الدولي 4-الأسبوع القديمة حوالي 2 ملم في القطر. عدد القطع يعتمد على حجم المبيض؛ بيد أن حوالي 500 ميكرومتر سميكة قطعة تسمح للملاحظات جريب السليم (في قطع أكثر سمكا من 500 مم، انخفض الأنسجة الشفافية؛ وكسر المسام antral العديد من القطع أرق من 500 ملليمتر، وفقدت).</li>
		<li>بعد التشريح، وضع العينات المبيض شرائح في مستنبت المعالجون مسبقاً في الأطباق 3.5 سم (راجع الخطوة 2، 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. زراعة أنسجة المبيض
<ol><li>إسقاط حوالي 0.5 ميليلتر من المتوسطة الثقافة الواحدة وشرائح أنسجة المبيض على إدراج الثقافة الخلية حيث سيتم أنسجة المبيض تعيين باستخدام ميكروبيبيتي.</li>
	<li>ضع كل شرائح العينة إلى انخفاض المتوسط الثقافة على إدراج الثقافة الخلية باستخدام الملقط.</li>
	<li>الثقافة أنسجة المبيض في 5% CO2 في 37 درجة مئوية.</li>
	<li>استبدال المتوسطة الثقافة مع متوسط حرارة قبل جديدة كل يومين. ملاحظة: الجدول الزمني للتغييرات متوسطة لثقافة المقاطع المبيض من الفئران الممثل المدني الدولي 4-الأسبوع القديم يرد في الشكل 1.<ol>
<li>إنتاج طفرة LH, علاج مثقف المبايض الفئران الممثل المدني الدولي 4-الأسبوع القديمة مع المتوسط التي تحتوي على 100 مو/مل FSH و LH ح 12 كل 4 أيام (الشكل 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4-المجهر الصور لاستزراع المبيض
<ol><li>بدء التصوير المبايض مثقف بعد يوم 1 عندما انضمت الأنسجة على إدراج الثقافة في الخلية، وإجراء تحليلات مجهر [كنفوكل] أو مقلوب في فترات ح 24 للسماح بنمو جريب كافية بين النقاط الزمنية. ملاحظة: الفحص المجهري [كنفوكل] متفوقة على المجهر المقلوب لمراقبة المسام في المبيض كله مثقف.</li>
</ol>5-الوقت الفاصل بين التصوير لاستزراع المبيض
<ol><li>
تحسين ظروف الوقت الفاصل بين التصوير، بما في ذلك كثافة الليزر وأوقات التعرض لنظام التصوير (الجدول 1).
	<ol>
<li>تحديد العينات المزدوجة المبيض من الفئران واحدة للاستخدام كمجموعات العلاج والتحكم. وتختلف كثافة الليزر ووقت التعرض تحقيق أفضل الصور (الجدول 1).</li>
		<li>مقارنة نمو جريب تحت كل شرط الثقافة عن طريق قياس المجالات جريب في صور عينات التحكم في فترات ح 24 وفي الوقت الفاصل بين العينات التصوير (راجع الخطوة 6). وفي الوقت نفسه، عد من بويضات أوفولاتيد في كل مجموعة المبيض واختيار أفضل الظروف الوقت الفاصل بين التصوير.</li>
	</ol>
</li>
	<li>التقاط الصور في فواصل 30 دقيقة باستخدام الوقت الفاصل بين نظام التصوير ظروف محددة (الجدول 1).</li>
</ol>6-تحليل النمو جريب
<ol><li>
لتحليل وضع جريب، قياس مجالات جريب في الصور التي تم التقاطها باستخدام برنامج إيماجيج (http://resbweb.nih.gov/ij/).
	<ol>
<li>في البداية، بتعيين حجم الصورة بواسطة النقر فوق "ضبط مقياس" تحت "تحليل" في شريط الأدوات. أدخل طول الجانب من الصورة التي تم التقاطها والأرقام المقابلة بكسل في الحقول الفارغة من "المسافة المعروفة باسم" و "المسافة بالبكسل"، على التوالي.</li>
		<li>انقر فوق "اليد الحرة" في شريط الأدوات، ومخطط المسام في الصور الميدانية مشرق الملتقطة.</li>
		<li>انقر فوق "إجراء" إطار "تحليل" في شريط الأدوات. ملاحظة: إذا هي رغبت في بيانات القياس الأخرى، انقر فوق "تعيين القياس" تحت "تحليل" في شريط الأدوات، والتحقق من المربعات المناسبة في القائمة.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7-تحليل التنمية المسام باستخدام الفئران المعدلة وراثيا
<ol><li>جمع المبايض من شريحة يوما بعد الولادة 0 و 4 (P0 و P4) أنثى الفئران المعدلة وراثيا التي تتضمن في المتسلسلات Oog1pro3.9 و R26-H2B-مشير، والثقافة على إدراج كما هو موضح في الخطوات 1.1 – 3.2، إلا إذا لم تقم بذلك P0 والمبايض P4.</li>
	<li>استبدال المتوسطة الثقافة المتوسطة الطازجة، والمعالجون مسبقاً في الأطباق 3.5 سم في حاضنة الذي يحتوي على 5% CO2 في 37 درجة مئوية كل يومين. ملاحظة: تركيز LH في الأجلين المتوسط وثقافة من المبايض P0 و P4 يمكن أن تظل ثابتة لأن لا تحدث العواصف LH في الفئران P0 و P4.</li>
	<li>تعيين المجهر لتصور فقط إيجابية AcGFP1 المسام الأولية في المبيضين P4 المستزرعة (الجدول 1). ملاحظة: المسام الأساسي والابتدائي فقط موجودة في المبيضين الماوس الإناث P4.</li>
	<li>التقاط الصور من مثقف P0 Oog1pro3.9/R26-H2B-مشري المبايض الفئران المحورة وراثيا على فترات 30 دقيقة باستخدام الإعدادات المستخدمة المبايض P4 (راجع الخطوة 5، 2).</li>
	<li>تتبع وتحليل التنمية المسام باستخدام الإشارات AcGFP1 ومشري H2B.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+quantifying+follicular+numbers+within+the+mouse+ovary.">Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary.</a> Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).</li><li>Adams, G. P., Jaiswal, R., Singh, J., Malhi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+understanding+ovarian+follicular+dynamics+in+cattle.">Progress in understanding ovarian follicular dynamics in cattle.</a> Theriogenology. 69 (1), 72-80 (2008).</li><li>Palma, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+and+biotechnology+of+follicle+development.">Biology and biotechnology of follicle development.</a> Sci World J. , (2012).</li><li>Knight, P. G., Glister, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+superfamily+members+and+ovarian+follicle+development.">TGF-beta superfamily members and ovarian follicle development.</a> Reproduction. 132 (2), 191-206 (2006).</li><li>Picton, H. M., Harris, S. E., Muruvi, W., Chambers, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+growth+and+maturation+of+follicles.">The in vitro growth and maturation of follicles.</a> Reproduction. 136 (6), 703-715 (2008).</li><li>Spears, N., de Bruin, J. P., Gosden, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+establishment+of+follicular+dominance+in+co-cultured+mouse+ovarian+follicles.">The establishment of follicular dominance in co-cultured mouse ovarian follicles.</a> J Reprod Fertil. 106 (1), 1-6 (1996).</li><li>Baker, S. J., Srsen, V., Lapping, R., Spears, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+effect+of+follicle-follicle+interactions+and+declining+follicle-stimulating+hormone+on+murine+follicle+health+in+vitro.">Combined effect of follicle-follicle interactions and declining follicle-stimulating hormone on murine follicle health in vitro.</a> Biol Reprod. 65 (4), 1304-1310 (2001).</li><li>Komatsu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Effect+of+Leukemia+Inhibitory+Factor+on+Follicular+Growth+in+Cultured+Murine+Ovarian+Tissue.">Analysis of the Effect of Leukemia Inhibitory Factor on Follicular Growth in Cultured Murine Ovarian Tissue.</a> Biol Reprod. 93 (1), 18 (2015).</li><li>Komatsu, K., Masubuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+concentration-dependent+effect+of+progesterone+on+follicle+growth+in+the+mouse+ovary.">The concentration-dependent effect of progesterone on follicle growth in the mouse ovary.</a> J Reprod Dev. 63 (3), 271-277 (2017).</li><li>Murase, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicle+dynamics:+visualization+and+analysis+of+follicle+growth+and+maturation+using+murine+ovarian+tissue+culture.">Follicle dynamics: visualization and analysis of follicle growth and maturation using murine ovarian tissue culture.</a> J Assist Reprod Genet. , 1-5 (2017).</li><li>Ishida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promoter+of+the+oocyte-specific+gene,+Oog1,+functions+in+both+male+and+female+meiotic+germ+cells+in+transgenic+mice.">The promoter of the oocyte-specific gene, Oog1, functions in both male and female meiotic germ cells in transgenic mice.</a> PLoS One. 8 (7), 68686 (2013).</li><li>Minami, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oogenesin+is+a+novel+mouse+protein+expressed+in+oocytes+and+early+cleavage-stage+embryos.">Oogenesin is a novel mouse protein expressed in oocytes and early cleavage-stage embryos.</a> Biol Reprod. 69 (5), 1736-1742 (2003).</li><li>Nilsson, E. E., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+differentiation+factor-9+stimulates+progression+of+early+primary+but+not+primordial+rat+ovarian+follicle+development.">Growth and differentiation factor-9 stimulates progression of early primary but not primordial rat ovarian follicle development.</a> Biol Reprod. 67 (3), 1018-1024 (2002).</li><li>Nilsson, E. E., Kezele, P., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukemia+inhibitory+factor+(LIF)+promotes+the+primordial+to+primary+follicle+transition+in+rat+ovaries.">Leukemia inhibitory factor (LIF) promotes the primordial to primary follicle transition in rat ovaries.</a> Mol Cell Endocrinol. 188 (1-2), 65-73 (2002).</li><li>Nilsson, E. E., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+protein-4+acts+as+an+ovarian+follicle+survival+factor+and+promotes+primordial+follicle+development.">Bone morphogenetic protein-4 acts as an ovarian follicle survival factor and promotes primordial follicle development.</a> Biol Reprod. 69 (4), 1265-1272 (2003).</li><li>Nilsson, E. E., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kit+ligand+and+basic+fibroblast+growth+factor+interactions+in+the+induction+of+ovarian+primordial+to+primary+follicle+transition.">Kit ligand and basic fibroblast growth factor interactions in the induction of ovarian primordial to primary follicle transition.</a> Mol Cell Endocrinol. 214 (1-2), 19-25 (2004).</li><li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditional+reporter+mouse+lines+at+ROSA26+locus+for+live+cell+imaging.">Establishment of conditional reporter mouse lines at ROSA26 locus for live cell imaging.</a> Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).</li><li>Lan, Z. J., Xu, X., Cooney, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+oocyte-specific+expression+of+Cre+recombinase+activity+in+GDF-9-iCre,+Zp3cre,+and+Msx2Cre+transgenic+mice.">Differential oocyte-specific expression of Cre recombinase activity in GDF-9-iCre, Zp3cre, and Msx2Cre transgenic mice.</a> Biol Reprod. 71 (5), 1469-1474 (2004).</li><li>Payer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stella-GFP+transgenic+mice:+a+novel+tool+to+study+germ+cell+development.">Generation of stella-GFP transgenic mice: a novel tool to study germ cell development.</a> Genesis. 44 (2), 75-83 (2006).</li><li>Ohinata, Y., Sano, M., Shigeta, M., Yamanaka, K., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive,+non-invasive+visualization+of+primordial+germ+cell+development+in+mice+by+the+Prdm1-mVenus+and+Dppa3-ECFP+double+transgenic+reporter.">A comprehensive, non-invasive visualization of primordial germ cell development in mice by the Prdm1-mVenus and Dppa3-ECFP double transgenic reporter.</a> Reproduction. 136 (4), 503-514 (2008).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

في هذه الدراسة، قمنا بتطوير أسلوبي جديد لدراسة التنمية جريب في المبيضين الماوس. الأسلوب الأول ينطوي على ثقافة الفئران الكبار المبيض شرائح الأنسجة متبوعاً بتحليلات للتنمية جريب، والثاني ينطوي على استخدام الوقت الفاصل بين التصوير لتصور التنمية جريب المبكرة مرحلة مستقلة تروج. سابقا، استخ?...

الماوس الإناث المبايض تحتوي على عدة آلاف من المسام1، ونضوج التبويض الدورية حوالي عشر بويضات في كل دورة السفاد. المسام وتصنف إلى عدة مراحل النمو: البدائي، والابتدائي والثانوي، أنترال، وجراب جرافيان، اعتماداً على شكل طبقة الخلايا granulosa المحيطة بكل البويضات. معظم المسام البدائية نائمة، وبعضهم يتم تفعيلها وتنمو لتصبح المسام الأولية في كل دورة السفاد2. بعد المرحلة الثانوية جرابي، تنظمه التنمية جريب أساسا gonadotropins، جرابي تحفيز هرمون (FSH) والهرمون (LH). بيد أن التنمية جريب البدائية والأولية بشكل مستقل تروج والآليات التنظيمية التي تحكم هذه المراحل تظل سيئة إينديرستود3،،من45. بالإضافة إلى عوامل النمو والهرمونات، ينظم التفاعلات بين المسام6،7المسام البدائية والأولية. ولذلك، بإجراء تحليلات لديناميات جريب في أنسجة المبيض الماوس، والتحقيق في الآليات التنظيمية المرتبطة باستخدام زرع الأنسجة المبيض8،،من910.
هنا، نحن نقدم طريقتين نموذج زراعة أنسجة المبيض. الأولى تستخدم لتحليل التنمية جريب بقياس مناطق جرابي، ويستخدم الثاني لدراسة الآلية التنظيمية أثناء المبكرة جريب من البدائية إلى المرحلة الثانوية المسام مع الفئران المعدلة وراثيا. لتحليل التنمية جريب، استخدمنا أساسا المبايض فئران الإناث 4-الأسبوع القديمة لأنها تسمح للتصور سهلة للمسام. للحث على الإباضة الدورية ونموذج التنمية في فيفو جريب، نحن استنسخت طفرة LH والاباضه الملاحظة، والكبدية المسام وإفراز الاستراديول تحت ظروف زراعة الأنسجة. تم القبض على الصور لاستزراع المبيض، وتم تحليل عمليات التنمية جريب بتتبع التغييرات في منطقة جرابي. ومع ذلك، في الحقل مشرق تحليلات مجهرية، التمييز بين المسام الأولية البدائية وأوائل الواضح. وبالتالي، قمنا بتطوير أسلوب للكشف عن المسام الصغيرة، والتمييز بين البدائي، الابتدائي، ومثقف جريب الثانوية في أنسجة المبيض باستخدام Oogenesin1 pro3 (Oog1)- 9 والمبايض R26-H2B-مشري الفئران المعدلة وراثيا في الأيام 0 و 4 بعد الولادة11. التعبير Oog1 قابلاً للاكتشاف في بويضات بعد الدخول إلى الانقسام، ويزيد تدريجيا مع التنمية المسام، مما يتيح رصد الانتقال من البدائي للمسام الأولية باستخدام الصور الوقت الفاصل بين أنسجة المبيض مثقف11 ،12. على الرغم من أن قد استخدمت الطرق المورفولوجية لدراسة العوامل التي تنشيط المسام البدائية نائمة13،14،،من1516، التنمية جريب الفسيولوجية في المبيضين صعوبة في مراقبة، ولا تزال آثار العوامل المختلفة أونتشاراكتيريزيد. وصممت أساليب الثقافة الحالية لمعالجة هذه الندرة في الوقت الحقيقي تحليلات عوامل الهدف.
في هذه الدراسة، ونحن تتبع التنمية الحبيبي باستخدام طريقة تصوير الوقت الفاصل بين وتتميز عملية التنمية جريب. لدينا أساليب مبتكرة توفر أداة غير مسبوقة للتحقيق فسيولوجيا المبايض.

<table><tbody><tr><td>Follicle stimulating hormone from human pituitary</td><td>SIGMA</td><td>F4021</td><td></td></tr><tr><td>Lutenizing hormone from equine pituitary</td><td>SIGMA</td><td>L9773</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin solution</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>168-23191</td><td></td></tr><tr><td>MEM a, GlutaMax, no nucleotides</td><td>Thermo Fisher</td><td>32561037</td><td></td></tr><tr><td>Glass bottom dish</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td>35mm dish, No. 0 coverslip, 10mm glass diameter</td></tr><tr><td>Millicell cell culture insert</td><td>Merck Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td>Diameter: 315 mm, pore size: 0.4 mm, material: hydrophilic PTTE</td></tr><tr><td>3.5cm cell culture dishes</td><td>greiner bio-one</td><td>627160</td><td></td></tr><tr><td>50ml / centrifuge tube with triple seal cap</td><td>IWAKI</td><td>2345-050</td><td></td></tr><tr><td>Low-profile disposable blades 819</td><td>Leica</td><td>14035838925</td><td></td></tr><tr><td>LSM 710</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Confocal microscope</td></tr><tr><td>CellVoyager, CV1000</td><td>Yokogawa Electric Corporation</td><td></td><td>Time-lapse imaging</td></tr><tr><td>BZ-X700</td><td>KEYENCE</td><td></td><td>Time-lapse imaging</td></tr></tbody></table>

ovarian tissue culture to visualize phenomena in mouse ovary

أوفولاتي الإناث الثدييات دورياً على عدد يكاد يكون مستمرا من بويضات خلال كل دورة السفاد. للحفاظ على مثل هذا الانتظام وتواترها، يحدث التنظيم على مستوى محور طائي جوندال الغدة النخامية وعلى تطوير المسام في المبيض. على الرغم من الدراسات النشطة، آليات التنمية المسام ليست واضحة عدة الخطوات التي تنطوي عليها من تنشيط المسام البدائية نائمة للتبويض، وبسبب تعقيد التنظيم التي تختلف في كل مرحلة من مراحل الحبيبي. للتحقيق في آليات التنمية جريب، وديناميات المسام طوال دورة السفاد، قمنا بتطوير نموذج زراعة أنسجة المبيض ماوس التي يمكن استخدامها لمراقبة التنمية المسام باستخدام مجهر. التنمية جريب منتظمة والاباضه دورية الكبدية جريب يمكن جميع تكون مستنسخة في نموذج مثقف المبيض، ويمكن أن تكون شروط الثقافة والتضمين تجريبيا. هنا، علينا أن نبدي بفائدة هذا الأسلوب في دراسة آليات تنظيمية للتنمية المسام وغيرها من الظواهر المبيض.

ويبين الشكل 1 البروتوكول المتعلق بالتغييرات في وسائل الإعلام أثناء زراعة أنسجة المبيض. وبعد هذا البرنامج، عمرها 4 الأسبوع الممثل المدني الدولي الفئران المبايض مثقف وتصويرها على فترات 24-ح استخدام الفحص المجهري [كنفوكل] (الشكل 2). خلال ثقافة ...

Watch this Scientific Journal Video about Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary at JoVE.com

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

زراعة أنسجة المبيض تصور الظواهر في المبيض الماوس

يمكن أن تستخدم كنماذج الكبدية التنمية والاباضه جريب جريب زرع الأنسجة المبيض وتشير إلى آليات تنظيمية للعمليات الدينامية المبيض.

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

ovarian-tissue-culture-to-visualize-phenomena-in-mouse-ovary

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.7K Views.  Aichi Medical University. يمكن أن تستخدم كنماذج الكبدية التنمية والاباضه جريب جريب زرع الأنسجة المبيض وتشير إلى آليات تنظيمية للعمليات الدينامية المبيض.

Video: Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together within a basement membrane. A finite pool of follicles is laid down during embryonic development, when oocytes in meiotic arrest form a close association with flattened granulosa cells, forming primordial follicles. By or shortly after birth, mammalian ovaries contain their lifetime&#8217;s supply of primordial follicles, from which point onwards there is a steady release of follicles into the growing follicular pool.
The ovary is particularly amenable to development in vitro, with follicles growing in a highly physiological manner in culture. This work describes the culture of whole neonatal ovaries containing primordial follicles, and the culture of individual ovarian follicles, a method which can support the development of follicles from an immature through to the preovulatory stage, after which their oocytes are able to undergo fertilization in vitro. The work outlined here uses culture systems to determine how the ovary is affected by exposure to external compounds. We also describe a co-culture system, which allows investigation of the interactions that occur between growing follicles and the non-growing pool of primordial follicles.

This protocol describes the primary culture/co-culture of mouse ovarian tissue, using ovaries from neonatal mice and individual ovarian follicles from prepubertal mice. The culture techniques support development in a highly physiological manner, allowing investigation of the effect of extrinsic agents on the ovary, and of interactions between ovarian follicles.

الثقافة والمشارك ثقافة ماوس المبايض وحويصلات المبيض

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ovarian cancers is still in question and might be either the ovarian surface epithelium (OSE) or the distal epithelium of the fallopian tube fimbriae2,3. Culturing the normal cells as a primary culture in vitro will enable scientists to model specific changes that might lead to ovarian cancer in the distinct epithelium, thereby definitively determining the cell type of origin. This will allow development of more accurate biomarkers, animal models with tissue-specific gene changes, and better prevention strategies targeted to this disease.
Maintaining normal cells in alginate hydrogels promotes short term in vitro culture of cells in their three-dimensional context and permits introduction of plasmid DNA, siRNA, and small molecules. By culturing organs in pieces that are derived from strategic cuts using a scalpel, several cultures from a single organ can be generated, increasing the number of experiments from a single animal. These cuts model aspects of ovulation leading to proliferation of the OSE, which is associated with ovarian cancer formation. Cell types such as the OSE that do not grow well on plastic surfaces can be cultured using this method and facilitate investigation into normal cellular processes or the earliest events in cancer formation4.
Alginate hydrogels can be used to support the growth of many types of tissues5. Alginate is a linear polysaccharide composed of repeating units of &beta;-D-mannuronic acid and &alpha;-L-guluronic acid that can be crosslinked with calcium ions, resulting in a gentle gelling action that does not damage tissues6,7. Like other three-dimensional cell culture matrices such as Matrigel, alginate provides mechanical support for tissues; however, proteins are not reactive with the alginate matrix, and therefore alginate functions as a synthetic extracellular matrix that does not initiate cell signaling5. The alginate hydrogel floats in standard cell culture medium and supports the architecture of the tissue growth in vitro.
A method is presented for the preparation, separation, and embedding of ovarian and oviductal organ pieces into alginate hydrogels, which can be maintained in culture for up to two weeks. The enzymatic release of cells for analysis of proteins and RNA samples from the organ culture is also described. Finally, the growth of primary cell types is possible without genetic immortalization from mice and permits investigators to use knockout and transgenic mice.

Culture of normal cells in their three-dimensional context represents an alternative method to study early events required for cellular transformation and tumorigenesis. This method is used to grow normal ovarian and oviductal cells to study early events in ovarian cancer formation.

ألجينات الهلاميات المائية للثقافة الجهاز ثلاثي الأبعاد من المبيضين وناقلة البيضات

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Bioengineering

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

السابق الرحم Electroporation للوعضوي النمط من الثقافة شريحة ماوس الحصين الأنسجة

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ovarian fitness is often assessed by visualizing and quantifying follicles and oocytes. Because the ovary is an opaque three-dimensional tissue, traditional approaches require laboriously slicing the tissue into numerous serial sections in order to visualize cells throughout the entire organ. Furthermore, because quantification by this method typically entails scoring only a subset of the sections separated by the approximate diameter of an oocyte, it is prone to inaccuracy. Here, a protocol is described that instead utilizes whole organ tissue clearing and immunofluorescence staining of mouse ovaries to visualize follicles and oocytes. Compared to more traditional approaches, this protocol is advantageous for visualizing cells within the ovary for numerous reasons: 1) the ovary remains intact throughout sample preparation and processing; 2) small ovaries, which are difficult to section, can be examined with ease; 3) cellular quantification is more readily and accurately achieved; and 4) the whole organ imaged.

Here, we present a protocol to quantify follicles in cultured ovaries of young mice without serial sectioning. Using whole organ immunofluorescence and tissue clearing, physical sectioning is replaced with optical sectioning. This method of sample preparation and visualization maintains organ integrity and facilitates automated quantification of specific cells.

كله جبل الفلورة وتقدير جريب المبايض الماوس مثقف

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial follicles, the storage unit of the female germline. They are non-renewable, thus their number at birth and subsequent rate of loss largely dictates the female fertile lifespan. Accurate quantification of primordial follicle numbers in women and animals is essential for determining the impact of medicines and toxicants on the ovarian reserve. It is also necessary for evaluating the need for, and success of, existing and emerging fertility preservation techniques. Currently, no methods exist to accurately measure the number of primordial follicles comprising the ovarian reserve in women. Furthermore, obtaining ovarian tissue from large animals or endangered species for experimentation is often not feasible. Thus, mice have become an essential model for such studies, and the ability to evaluate primordial follicle numbers in whole mouse ovaries is a critical tool. However, reports of absolute follicle numbers in mouse ovaries in the literature are highly variable, making it difficult to compare and/or replicate data. This is due to a number of factors including strain, age, treatment groups, as well as technical differences in the methods of counting employed. In this article, we provide a step-by-step instructional guide for preparing histological sections and counting primordial follicles in mouse ovaries using two different methods: [1] stereology, which relies on the fractionator/optical dissector technique; and [2] the direct count technique. Some of the key advantages and drawbacks of each method will be highlighted so that reproducibility can be improved in the field and to enable researchers to select the most appropriate method for their studies.

Here, we describe, compare, and contrast two different techniques for accurate follicle counting of fixed mouse ovarian tissues.

تعداد دقيق للجريب في مبايض الفئران للبالغين

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

في الجسم الحي التصوير والعلاجات العلاجية في الفأر نموذج مثلي من سرطان المبيض

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Biology

Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells entering meiotic prophase I are eliminated during Fetal Oocyte Attrition (FOA) and the first week of postnatal life. Three major mechanisms regulate the number of oocytes that survive during development and establish the ovarian reserve in females entering puberty. In the first wave of oocyte loss, 30-50% of the oocytes are eliminated during early FOA, a phenomenon that is attributed to high Long interspersed nuclear element-1 (LINE-1) expression. The second wave of oocyte loss is the elimination of oocytes with meiotic defects by a meiotic quality checkpoint. The third wave of oocyte loss occurs perinatally during primordial follicle formation when some oocytes fail to form follicles. It remains unclear what regulates each of these three waves of oocyte loss and how they shape the ovarian reserve in either mice or humans.
Immunofluorescence and 3D visualization have opened a new avenue to image and analyze oocyte development in the context of the whole ovary rather than in less informative 2D sections. This article provides a comprehensive protocol for whole ovary immunostaining and optical clearing, yielding preparations for imaging using multiphoton microscopy and 3D modeling using commercially available software. It shows how this method can be used to show the dynamics of oocyte attrition during ovarian development in C57BL/6J mice and quantify oocyte loss during the three waves of oocyte elimination. This protocol can be applied to prenatal and early postnatal ovaries for oocyte visualization and quantification, as well as other quantitative approaches. Importantly, the protocol was strategically developed to accommodate high-throughput, reliable, and repeatable processing that can meet the needs in toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

Here, we present an optimized protocol for imaging entire ovaries for quantitative and qualitative analyses using whole-mount immunostaining, multiphoton microscopy, and 3D visualization and analysis. This protocol accommodates high-throughput, reliable, and repeatable processing that is applicable for toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

التألق المناعي للمبيض الكامل ، والمقاصة ، والمجهر متعدد الفوتونات للتحليل الكمي 3D لاحتياطي المبيض النامي في الفأر

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells ...

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine system, but the complex structural relationships and three-dimensional (3D) vasculature architectures of the ovary are not well described. In order to visualize the 3D connections and architecture of blood vessels in the intact ovary, the first important step is to make the ovary optically clear. In order to avoid tissue shrinkage, we used the hydrogel fixation-based passive CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/ Immunostaining/In situ-hybridization-compatible Tissue Hydrogel) protocol method to clear an intact ovary. Immunostaining, advanced multiphoton confocal microscopy, and 3D image-reconstructions were then used for the visualization of ovarian vessels and follicular capillaries. Using this approach, we showed a significant positive correlation (P &#60;0.01) between the length of the follicular capillaries and volume of the follicular wall.

Here we present an adaptation of the passive CLARITY and 3D reconstruction method for visualization of the ovarian vasculature and follicular capillaries in intact mouse ovaries.

إعادة البناء ثلاثي الأبعاد بنية الأوعية الدموية المبيض الماوس مسح الوضوح السلبي

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...

Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors from somatic cells and cumulus cell-oocyte communication. Little is known about the ovarian microenvironment and how the cytokines and steroids produced in the surrounding milieu affect follicle progression or arrest. In vitro culture of ovarian cortex enables follicles to develop in a normalized environment that remains supported by adjacent stroma. Our objective was to determine the effect of nutritional Stair-Step diet on the ovarian microenvironment (follicle development, steroid, and cytokine production) through in vitro culture of bovine ovarian cortex. To accomplish this, ovarian cortical pieces were removed from heifers undergoing two different nutritionally developed schemes prior to puberty: Control (traditional nutrition development) and Stair-Step (feeding and restriction during development) that were cut into approximately 0.5-1 mm3 pieces. These pieces were subsequently passed through a series of washes and positioned on a tissue culture insert that is set into a well containing Waymouth&#39;s culture medium. Ovarian cortex was cultured for 7 days with daily culture media changes. Histological sectioning was performed to determine follicle stage changes before and after the culture to determine effects of nutrition and impact of culture without additional treatment. Cortex culture medium was pooled over days to measure steroids, steroid metabolites, and cytokines. There were tendencies for increased steroid hormones in ovarian microenvironment that allowed for follicle progression in the Stair-Step versus Control ovarian cortex cultures. The ovarian cortex culture technique allows for a better understanding of the ovarian microenvironment, and how alterations in endocrine secretion may affect follicle progression and growth from both in vivo and in vitro treatments. This culture method may also prove beneficial for testing potential therapeutics that may improve follicle progression in women to promote fertility.

In vitro culture of bovine ovarian cortex and the effect of nutritional Stair-step diet on ovarian microenvironment is presented. Ovarian cortex pieces were cultured for seven days and steroids, cytokines, and follicle stages were evaluated. The Stair-Step diet treatment had increased steroidogenesis resulting in follicle progression in culture.

الأبقار المبيض القشرة الأنسجة الثقافة

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors ...

Orthotopic Inoculation of Ovarian Cancer Cells into Murine Ovary: A Procedure to Establish an Ovarian Cancer Mouse Model to Study Peritoneal Dissemination of Cells

To carry out orthotopic inoculation, after anesthetizing an eight-week-old female nude mouse according to the text protocol, perform a toe pinch to verify depth of the anesthesia. Place the anesthetized mouse on an operating stage, belly side down. Then, disinfect the surgical area with several washes using a chlorhexidine-based scrub and alcohol.
Next, make an approximately 2-centimeter vertical incision near the spine, between the right costal arch and the femur. Place a sterile surgical drape around the incision site. Then, fix the incised skin surfaces with clamps to maintain the opening.
Now, make a second 1-centimeter incision at the parietal peritoneum under the first incision to open the abdominal cavity. Then, clamp the incised abdominal surfaces. With a clamp, clip the fat tissue that surrounds the ipsilateral ovary and fallopian tube to remove the ovary from the abdominal cavity.
Then, carefully place the ovary and fallopian tube on gauze before placing the mouse, belly side down, under the dissecting microscope. Transfer the cell suspension to an insulin syringe. Then, immediately and carefully inject 1 to 2 microliters of the prepared cell suspension into the ovary.
For several seconds, keep the needle in the ovary to ensure that the hydrogel sets. After gelation, the injected tumor cells will remain in the ovary. Carefully, return the ovary into the body. With sterile medical silk, suture the second incision before using wound clips to seal the skin.