ونحن نشكر إيلا وينيرت، هيلمز ميشيل وبادوش مارليس للمساعدة التقنية الممتازة، جيسيكا Börstler لإجراء تحليلات للبعوض Culex ، نوربرت بيكر وبيورن بلوسكوتا لتوفير البيض Aedes albopictus وفابالاهتي قوللي توفير مخزون الفيروس. مل تدعمها "الرابطة لايبنتز"؛ منح رقم شهد-2014-SGN-3.

1. إعداد البعوض الإناث
<ol><li>جمع البعوض من قفص كبير باستخدام المضخة (حوالي 400 البعوض في قفص كبير).</li>
	<li>تخدير البعوض مع ثاني أكسيد الكربون (CO2) 7 s.</li>
	<li>فرز الإناث 20 كل قنينة بلاستيكية (Ø 50 مم × 100 مم). ملاحظة: إذا استيقظ البعوض، تستخدم آخر 3 s شركة2-
</li>
	<li>تجويع البعوض بين عشية وضحاها.</li>
</ol>2-الاصطناعية الدم وجبة
ملاحظة: يتم تنفيذ كافة الخطوات في ظروف BSL-3.
<ol><li>
إعداد وجبة الدم المعدية.
	<ol>
<li>تمييع مخزون الفيروس بتركيز 1 × 108 البلاك تشكيل وحدات (بفو)/مل. ملاحظة: تحدد عن طريق إجراء زراعة الأنسجة طريقة الجرعة 50 العدوى (TCID50) تركيز المخزون وحساب بواسطة سبيرمان & Kärber10،خوارزمية11.</li>
		<li>انتهت مزيج الدم البشري (الحفاظ على الدم) من بنك الدم (غير مناسب للبشرية بعد الآن، لكن من المفيد للبعوض) مع سكر (الحل 8%)، فيلتراتيد المصل البقري (FBS) وحل عملي من مخزون فيروس (انتهت البشرية الدم: الفركتوز: FBS: حل العامل = 5:3:1:1). ملاحظة: لقد اخترنا الدم البشري، لأن هذا هو المضيف الثدييات الطبيعية المعروفة من زيكف.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تجميد ميليلتر 140 من مزيج وجبة الدم لمزيد من التحليل عن طريق TCID50.</li>
	<li>
تؤدي التغذية الاصطناعية باستخدام أساليب التغذية المختلفة، اعتماداً على هذه الأنواع:
	<ol>
<li>
بعوض الزاعجة المصرية: استخدم غشاء تغذية النظام لمدة 30 دقيقة (1 مل في علبة التغذية بالورق).</li>
		<li>
Culex spp.: توفير الدم المعدية عن طريق عصا القطن بين عشية وضحاها ولا الاحماء في الدم (300 ميليلتر للقنينة الواحدة).</li>
		<li>
Aedes albopictus: وضع قطرات اثنين (50 ميليلتر في كل) من هذا المزيج وجبة الدم إلى القنينة البلاستيكية وترك البعوض تغذية ح 2. لا الاحماء في الدم. ملاحظة: سيتم تغذية البعوض في 15 دقيقة الأولى. فترة الحضانة طويلة ضروري نظراً لأسباب تتعلق بالسلامة. هي ينضب قطرات الدم بعد 2 ح، وبذلك يتم تقليل خطر التلوث أثناء الفرز من تغذية البعوض.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تخدير البعوض مع CO2 7 s. ملاحظة: إذا استيقظ البعوض، استخدم 3 آخر ق من أول أكسيد الكربون2.</li>
	<li>الفرز والعد الكامل محتقن البعوض في قنينة جديدة.</li>
	<li>إضافة وسادة القطن، مشبعة بسكر (8% الحل) بين القنينة والمكونات.</li>
	<li>تبقى البعوض في مكان مخصص درجة حرارة 18 درجة مئوية أو 27 درجة مئوية في درجة الرطوبة % 80 لمدة 14 أو 21 يوما.</li>
	<li>تغذية البعوض مع منصات القطن المشبعة سكر. تجديد كل ح 72 مع 1.5 مل سكر (8% حل) كل قنينة (ما يصل إلى 20 من البعوض، اعتماداً على تغذية معدل، راجع الخطوة رقم 2، 5).</li>
</ol>3-فرض فحص اللعاب في يوم 14 أو 21
ملاحظة: يتم تنفيذ كافة الخطوات في ظروف BSL-3.
<ol><li>البذور 2 × 104 خلايا فيرو/كل بئر في 96 حسنا لوحة مع 200 ميليلتر من متوسط النمو (Dulbecco´s تعديل النسر المتوسطة (دميم) وتستكمل مع 3% FBS، 100 يو/مليلتر البنسلين، ستربتوميسين 100 ملغ/مل، 5 ميكروغرام/مل الامفوتريسين ب، 2 مم L-الجلوتامين ، 1% الأحماض الأمينية غير الأساسية (نيا)، بيروفات صوديوم 1%).</li>
	<li>
تحضير جهاز اللعاب:
	<ol>
<li>ضع لوحة زجاج التربيعية (20 × 20 سم) على مقاعد البدلاء في زاوية 30 درجة. ملاحظة: وهذا ضروري نظراً أونديربريسوري في مختبر السلامة. إذا كانت اللوحة الأفقي أو الرأسي، وسوف تسرب السائل.</li>
		<li>وضع شريط لاصق الوجهين مزدوجة على رأس اللوحة الزجاجية.</li>
		<li>دور الطين النمذجة حتى يبلغ قطره 0.5 سم ونعلق عليه أفقياً 1 سم بعيداً عن الشريط اللاصق على الوجهين.</li>
		<li>قطع سم 0.3 أول من غيض من تلميح تصفية 10 ميليلتر. ملاحظة: ينصح بتحضير هذا قبل البدء بالتجربة خارج المختبر السلامة الأحيائية.</li>
		<li>ملء نصائح تصفية مع 10 ميليلتر من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، درجة الحموضة 7.4).</li>
		<li>نصائح مكان عامل التصفية في الطين النمذجة مع التلميح نحو الأشرطة اللاصقة.</li>
		<li>تأمين النصائح عامل التصفية مع ضغط لطيف.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
إعداد البعوض:
	<ol>
<li>تخدير البعوض مع CO2.</li>
		<li>إزالة الساقين وأجنحة لشل البعوض.</li>
		<li>إصلاح الهيئات البعوض الحية على الشريط مثبت أعلاه معلومات عامل تصفية.</li>
		<li>مكان ململه بلطف إلى الفلتر.</li>
		<li>قم بتشغيل فحص اللعاب لمدة 30 دقيقة.</li>
		<li>إزالة نصائح التصفية وتجاهل الطين والشريط.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4-تجهيز اللعاب
ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات 4.1 – 4.6.2 تحت ظروف BSL-3.
<ol><li>طرد المحتويات في رد فعل أنابيب تحتوي على 10 ميليلتر من برنامج تلفزيوني.</li>
	<li>المزيج بلطف ونقل المحتوى إلى الآبار التي بليت جيدا 96 استعداد استخدام بئر واحدة كل عينة.</li>
	<li>احتضان اللوحة لمدة 7 أيام في 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.</li>
	<li>استخدام مجهر لفحص الخلايا لوجود تأثير سيتوباثيك (CPE).</li>
	<li>إذا كان البئر إيجابية بالنسبة للتعليم المهني المستمر، حصاد المادة طافية ميليلتر 140 بيبيتينج في أنبوب رد فعل لاستخراج الحمض النووي الريبي.</li>
	<li>
تنقية الجيش الملكي النيبالي باستخدام مجموعة أدوات استخراج الحمض النووي الريبي.
	<ol>
<li>المخزن المؤقت (تحلل الفيروسية العازلة) ميليلتر 140 مزيج من المادة طافية مع ميليلتر 560 من التتبع الآلي واحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.</li>
		<li>إضافة ميليلتر 560 من الإيثانول (96 في المائة) ودوامه العينة. ملاحظة: يتم إلغاء تنشيطه بعد هذه الخطوة العينات ويمكن تفريغها من المختبر BSL-3.</li>
		<li>بيبيت 630 ميليلتر العينة على العمود، وأجهزة الطرد المركزي مع 6,000 س ز لمدة 1 دقيقة.</li>
		<li>تجاهل فيلتراتي، بيبيت ميليلتر 630 المتبقية على العمود وكرر الطرد المركزي.</li>
		<li>أغسل الجيش الملكي النيبالي، ملزمة للغشاء للعمود، بإضافة 500 ميليلتر للغسيل المخزن المؤقت 1 إلى العمود وأجهزة الطرد المركزي في س 6,000 ز لمدة 1 دقيقة.</li>
		<li>تجاهل أنبوب جمع ووضع العمود في أنبوب مجموعة جديدة. إضافة 500 ميليلتر الغسيل العازلة 2 وأجهزة الطرد المركزي في س 12,500 ز لمدة 3 دقائق.</li>
		<li>تجاهل أنبوب جمع ووضع العمود في أنبوب رد فعل 1.5 مل.</li>
		<li>إضافة 50 ميليلتر من المخزن المؤقت شطف واحتضان لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.</li>
		<li>الطرد المركزي في 6,000 س ز لمدة 1 دقيقة وثم تجاهل العمود.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تحليل العينات "الحمض النووي الريبي زيكف" عبر RT-قبكر.</li>
</ol>5-تجهيز هيئات البعوض
ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات 5.1 – 5.5 تحت ظروف BSL-3.
<ol><li>إزالة جثث البعوض ووضع كل هيئة في أنبوب رد فعل. ملاحظة: من الممكن إيقاف التجربة في هذه المرحلة وتخزين العينات في-80 درجة مئوية.</li>
	<li>إضافة 500 ميليلتر من تجانس وسائل الإعلام (دميم دون أي سوبليمينتالس) في أنبوب رد فعل.</li>
	<li>مجانسة نص باستخدام خلاط المحرك واستخدام المدقة جديدة لكل عينة.</li>
	<li>إضافة 200 ميليلتر من هوموجيناتي إلى 96-جيدا--لوحة لتنقية. ملاحظة: من الممكن إيقاف التجربة في هذه المرحلة وتخزين العينات في-80 درجة مئوية.</li>
	<li>إلغاء تنشيط اللوحة بالحضانة لمدة 60 دقيقة عند 60 درجة مئوية.</li>
	<li>تنقية الجيش الملكي النيبالي بتنقية الحمض النووي الآلي. ملاحظة: من الممكن إيقاف التجربة في هذه المرحلة وتخزين العينات في-80 درجة مئوية.</li>
</ol>6-تحليل
<ol><li>التحديد الكمي "نسخ الرنا الفيروسي" استخدام الرايت qPCR. ملاحظة: قد بلغ نسخ الحمض النووي الريبي عبر جميع الهيئات البعوض زيكف-إيجابية ودون بما في ذلك البعوض زيكف السلبية.</li>
	<li>حساب الأشعة تحت الحمراء، يعرف بأنه عدد الهيئات البعوض زيكف الإيجابية الواحدة وعدد الإناث بنك الاحتياطي الفيدرالي.</li>
	<li>حساب TR، يعرف بأنه عدد البعوض مع اللعاب زيكف الإيجابية الواحدة وعدد من الهيئات البعوض زيكف إيجابية. لا يمكن أن يكون حساب معدل انتقال لمجموعات الأنواع ذات درجة الحرارة مع أي هيئات زيكف إيجابية.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Musso, D., Gubler, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus.">Zika Virus.</a> Clinical Microbiology Reviews. (3), 487-524 (2016).</li><li>Epelboin, Y., Talaga, S., Epelboin, L., Dusfour, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus:+An+updated+review+of+competent+or+naturally+infected+mosquitoes.">Zika virus: An updated review of competent or naturally infected mosquitoes.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 11 (11), e0005933 (2017).</li><li>Aliota, M. T., Peinado, S. A., Osorio, J. E., Bartholomay, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culex+pipiens+and+Aedes+triseriatus+Mosquito+Susceptibility+to+Zika+Virus.">Culex pipiens and Aedes triseriatus Mosquito Susceptibility to Zika Virus.</a> Emerging Infectious Diseases. (10), 1857-1859 (2016).</li><li>Turell, M. J., Linthicum, K. J., Patrican, L. A., Davies, F. G., Kairo, A., Bailey, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+competence+of+selected+African+mosquito+(Diptera:+Culicidae)+species+for+Rift+Valley+fever+virus.">Vector competence of selected African mosquito (Diptera: Culicidae) species for Rift Valley fever virus.</a> Journal of Medical Entomology. 45 (1), 102-108 (2008).</li><li>Cornel, A. J., Jupp, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+methods+for+determining+transmission+rates+in+vector+competence+studies+with+Culex+univittatus+and+West+Nile+and+Sindbis+viruses.">Comparison of three methods for determining transmission rates in vector competence studies with Culex univittatus and West Nile and Sindbis viruses.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 5 (1), 70-72 (1989).</li><li>Hurlbut, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+salivation+and+virus+transmission.">Mosquito salivation and virus transmission.</a> The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 15 (6), 989-993 (1966).</li><li>Anderson, S. L., Richards, S. L., Smartt, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+determining+arbovirus+transmission+in+mosquitoes.">A simple method for determining arbovirus transmission in mosquitoes.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 26 (1), 108-111 (2010).</li><li>Heitmann, A., Jansen, S., L&#252;hken, R., Leggewie, M., Badusche, M., Pluskota, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+transmission+of+Zika+virus+by+mosquitoes+from+central+Europe.">Experimental transmission of Zika virus by mosquitoes from central Europe.</a> Eurovsurveillance. 22 (2), (2017).</li><li>Hierholzer, J. C., Killington, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Virus Isolation and Quantitation - Virology methods manual. , (1996).</li><li>Horzinek, R. W., Marian, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kompendium+der+allgemeinen+Virologie.">Kompendium der allgemeinen Virologie.</a> Zentralblatt f&#252;r Veterin&#228;rmedizin R A. 32 (1-10), 480 (2010).</li><li>Richard, V., Paoaafaite, T., Cao-Lormeau, V. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+of+French+Polynesian+Aedes+aegypti+and+Aedes+polynesiensis+for+Zika+Virus.">Vector Competence of French Polynesian Aedes aegypti and Aedes polynesiensis for Zika Virus.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (9), (2016).</li><li>Fortuna, C., Remoli, M. E., Di Luca, M., Severini, F., Toma, L., Benedetti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+studies+on+comparison+of+the+vector+competence+of+four+Italian+Culex+pipiens+populations+for+West+Nile+virus.">Experimental studies on comparison of the vector competence of four Italian Culex pipiens populations for West Nile virus.</a> Parasites &amp; Vectors. 8, 463 (2015).</li><li>Weger-Lucarelli, J., R&#252;ckert, C., Chotiwan, N., Nguyen, C., Garcia Luna, S. M., Turell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+of+American+Mosquitoes+for+Three+Strains+of+Zika+Virus.">Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), (2016).</li><li>Dubrulle, M., Mousson, L., Moutailler, S., Vazeille, M., Failloux, A. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus+and+Aedes+mosquitoes:+saliva+is+infectious+as+soon+as+two+days+after+oral+infection.">Chikungunya virus and Aedes mosquitoes: saliva is infectious as soon as two days after oral infection.</a> PLOS ONE. 4 (6), e5895 (2009).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

لقد ثبت سابقا أن النتائج التي تم الحصول عليها بالإكراه اللعاب تتماشى مع التجارب الكلاسيكية إعادة التغذية6. ومع ذلك، سواء في إعادة تغذية التجارب أو في طريقة عرض من اللعاب القسري، من المستحيل مباشرة دليل على نشاط اللعاب أو رصد إطلاق سراح اللعاب. لإثبات النشاط اللعاب، يمكن أن تختبر عينات لمكونات أخرى موجودة في اللعاب (على سبيل المثال-، البروتينات، الكربوهيدرات، إلخ.). وعلاوة على ذلك، سيسمح قبكرس إضافية الكشف عن نسخ الرنا الفيروسي. ومع ذلك، وهذا يتطلب تقسيم عينات اللعاب لتحليلات مختلفة، مما قد يحد من حساسية في مقايسة ثقافة الخلية في حالة إعداد الجسيمات منخفضة جداً. بدوره، وهذا قد يؤدي إلى التقليل من معدلات انتقال العزم.
للنتائج استنساخه، من الضروري ضمان أن جميع البعوض البقاء على قيد الحياة حتى نهاية التجربة. ويسيطر هذا بصريا رصد نشاط حركة الجسم من البعوض. وعلاوة على ذلك، قد استخدام مبدأ المقايسة اللعاب لنوع معين من البعوض لفحصها عن طريق تغذية مراقبة الفيروسات والتي هي معروفة لإرسالها عن طريق هذه الأنواع من البعوض محددة. العكس بالعكس، قد كل الفيروسات التي أدخلت في تجربة اختبار في البعوض عرضه.
فحوصات اللعاب القسري لها العديد من المزايا. يمكن اختبار إعداد كبيرة من البعوض في وقت واحد على عينة واحدة قاعدة تحت ظروف خاضعة للرقابة الموحدة دون المتعارضة مع أنظمة رعاية الحيوان9.
الأسلوب الذي يستخدمه عدة مختبرات. ومع ذلك، قد تختلف الأجهزة الدقيقة، التي يمكن أن تؤدي إلى اختلافات في النتائج بين المختبرات. هو أحد المكونات الهامة الشعرية لجمع اللعاب، التي يمكن أن تكون مصنوعة من الزجاج14 أو15من البلاستيك. للامتثال للوائح السلامة العالية من إينسيكتاري المستوى 3 السلامة الأحيائية، استخدمنا البلاستيك تصفية نصائح بدلاً من الزجاج الشعيرات الدموية، وبالتالي تقليل مخاطر الإصابات. وعلاوة على ذلك، نصائح تصفية لها ميزة أن السائل التي تم جمعها يمكن بسهولة نقلها باستخدام ماصة.
ويستند الإعداد لفحص اللعاب القسري المقدمة هنا اثنين من المحققين العمل معا وتقاسم الواجبات. يتم تسريح من البعوض بشخص واحد، بينما الآخر في نفس الوقت تستعد الإعداد اللعاب القسري. هذا يقلل من الوقت المناولة إلى حد كبير، ويقلل من الخطر من عينة التبديل كتغيير بين التسريح-أماكن العمل واللعاب-اللوحة ليست ضرورية. وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح وضع البعوض على جهاز اللعاب القسري فورا بعد التسريح. هذا البعوض قصيرة بدلاً من التعامل مع الوقت أمر ضروري لنجاح اللعاب القسري. وأخيراً، يمكن رصد البعوض مباشرة للحركة في جميع أنحاء التجربة كلها.
فحص اللعاب المقدمة هنا تستخدم لاكتساب نظرة ثاقبة إمكانات متجه من أنواع البعوض. بيد للإجابة على بعض الأسئلة المحددة الأخرى (على سبيل المثال.، عدد لدغات البعوض التي هي بحاجة لتصيب الفقاريات)، والحيوانات التجارب قد تكون مطلوبة.

في عام 2015، Zika الفيروسات (زيكف)، ترتبط فيروسات المنقولة بالبعوض (موبوفيروس) لعائلة فيروسات مصفرة، ظهرت في كولومبيا، والبرازيل، وانتشر بسرعة عبر الأمريكتين ومنطقة البحر الكاريبي، مما تسبب في حدوث وباء مع عدد ملحوظ الحالات السريرية لصغر الرأس و متلازمة غيان – باريه1. تعتبر البعوض هذه الأنواع بعوض الزاعجة المصرية Aedes albopictus ناقلات الابتدائية والثانوية من زيكف2، ولكن الأنواع الأخرى من جنس بعوض ثبت أيضا أن يكون ناقل التجريبية اختصاص3 . على عكس الأنواع بعوضة ، ومعظم الأنواع Culex اختبارها حتى الآن ليست قادرة على نقل الفيروس4. مجرد، قدمت بيانات Culex quinquefasciatus 3من النتائج غير حاسمة. وفي الوقت الحاضر، هناك نقص في المعلومات اختصاص البعوض ناقل زيكف تحت ظروف الحرارة المعتدلة (< 20 درجة مئوية). ومع ذلك، هذه المعلومات جوهرية لتقييمات المخاطر الحيزات الممكنة إلى المناطق ذات المناخ المعتدل مثل أوروبا الوسطى.
ناقل مختصة زيكف غير قادرة على الحصول على والحفاظ على، وتضخيم وأخيراً نقل الفيروس. ولذلك، اختبار هيئات البعوض أو أجزاء من الجثث، بما في ذلك الساقين، أو الأمامي أو الرأس أو الغدد اللعابية، زيكف لا يكفي لتحديد اختصاص متجه. وملزمة لاختبار لجزيئات الفيروسات المعدية داخل اللعاب المفرج عنهم. لتقييم كفاءة ناقل، معدل الإصابة (الأشعة تحت الحمراء، وعدد من الهيئات البعوض زيكف الإيجابية الواحدة عدد من البعوض محتقن) ومعدل انتقال (TR، عدد من البعوض مع اللعاب زيكف الإيجابية الواحدة وعدد من الهيئات البعوض زيكف الإيجابية)، يجب أن تكون العزم. يمكن تحليل IRs للبعوض بسهولة عن طريق البعوض ببساطة المتجانس متبوعاً عكس المنتسخة في الوقت الحقيقي تفاعل البوليميراز المتسلسل (RT-qPCR) استهداف زيكف. وعلاوة على ذلك، يمكن وصف العدوى كذلك بتحديد أرقام نسخ الفيروسية كل البعوض. وفي المقابل، تحليل معدلات انتقال يعتمد على الكشف عن جزيئات الفيروس قابلة للتطبيق في لعاب البعوض الفردية. يمكن تحقيق هذا عن طريق تغذية البعوض المصابة في الحيوانات المضيفة عرضه، يليها تحليل فريميا في المضيف5. ومع ذلك، هذا الأسلوب يعتمد على الكائنات نموذج مناسب، ومكلف ومقيد باللوائح الرفق بالحيوان. لتجنب استخدام الحيوانات المختبرية لتحليل معدلات انتقال العدوى وتخفيض التكاليف، مصطنعة إعادة تغذية نظم استخدام الدم قطرات قد وصف6. ومع ذلك، اختبار مقياس الفردية جنبا إلى جنب مع عدد كبير من الأفراد صعبة وتستغرق وقتاً طويلاً. وصف أولاً فحص اللعاب على مقياس فردية ونشر في عام 19667 وخلال السنوات الأخيرة، أصبحت تجارب اللعاب القسري الأسلوب المفضل تقييم كفاءة ناقل من البعوض3،8 .
بناء على دراستنا اختصاص متجهة من "أوروبا الوسطى" البعوض نشرت مؤخرا9، ويصف لنا اللعاب القسري كما أفاد أندرسون وآخرون. 8 مع بعض التعديلات. يسمح هذا الأسلوب ارتفاع إنتاجية موحدة التجارب تحت شروط السلامة العالية المستوى (BSL-3)، ويتضمن تحديد الفيروس النشط بخلية الثقافة على أساس فحوصات. وتشمل التجارب الموضحة هنا 856 البعوض. وكانوا مصابين زيكف في وجبة الدم الاصطناعي وتحليلها في وقت لاحق لوجود جزيئات الفيروسات المعدية في اللعاب. اشتعلت البعوض أدخلت الشعبين تجارب شملت المختبرات عريقة Ae. مصرية و Culex pipiens بيبينس بيوتيبي موليستوس (Cx. ص موليستوس)، فضلا عن ميدان Culex بيبينس بيبينس بيوتيبي بيبينس (Cx. pipiens ص) و Culex تورينتيوم (Cx. تورينتيوم) وهما عبد اللطيف-البوبيكتوس السكان. استثناء واحد للسكان Ae. البوبيكتوس اثنين، والتي تم جمعها في إيطاليا، جمعت جميع البعوض في ألمانيا.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Inject+matic Sleeper</td>
			<td>Inject+matic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bugdorm-1 Insect Rearing Cage</td>
			<td>BugDorm Store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila cultivation tubes</td>
			<td>carl roth</td>
			<td>PK11.2</td>
			<td>plastic vial for mosquitoes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plug for drosophila cultivation tubes</td>
			<td>carl roth</td>
			<td>PK15.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant climate chamber</td>
			<td>Binder</td>
			<td>KBF-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>banked human blood, expired, not usable for medical application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont-Pincette Electronic SS</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>B40c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>BNITM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flash light aspirator</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>2809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double-sided adhesive tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>no specific provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gammex Powder-free gloves with AMT</td>
			<td>Ansell</td>
			<td></td>
			<td>for safety reasons necessary during work with pricks in the BSL3 laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RealStar Zika Virus RT-PCR-Kit</td>
			<td>altona diagnostics</td>
			<td>591013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagMax Pathogen RNA/DNA Kit</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>4462359</td>
			<td>RNA isolation of mosquito bodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiamp viral RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>52906</td>
			<td>RNA-Isolation of supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips (20 &#181;L)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>701,116,210</td>
			<td>Cut the first 3 mm of the tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hand motor mixer</td>
			<td>carl roth</td>
			<td>sold out</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro pestles for hand motor mixer</td>
			<td>carl roth</td>
			<td>CXH8.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td></td>
			<td>P0403550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L Glutamine Penicilin/Streptomycin</td>
			<td>PAN</td>
			<td>P0819100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>PAN</td>
			<td>P06-0110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fructose</td>
			<td>carl roth</td>
			<td>4981.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>PAN</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>PAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvat</td>
			<td>PAN</td>
			<td>P0443100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NAA</td>
			<td>PAN</td>
			<td>P0832100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemotek Feeder</td>
			<td>Hemotek</td>
			<td>PS6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Cycler</td>
			<td>Roche</td>
			<td>480 II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Cycler Software</td>
			<td>Roche</td>
			<td>480 SW 1.5.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeling clay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>no specific provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>King Fisher Flex Purification System</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aedes albopictus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>eggs were collected in Freiburg, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular</td>
			<td>MOTIC</td>
			<td>SMZ-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular light</td>
			<td>MOTIC</td>
			<td>MLC-150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2-Incubator</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>MIDI 40</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

forced salivation as a method to analyze vector competence of mosquitoes

ويعرف اختصاص ناقلات إمكانات الأنواع البعوض أحيل فيروسات المنقولة بالبعوض (موبوفيروس) إلى مضيف فقاريات. وتحال جزيئات الفيروس قابلة للتطبيق خلال وجبة الدم عن طريق اللعاب من بعوضة مصابة. فحوصات اللعاب القسري السماح بتحديد الإمكانات ناقلات الأمراض على أساس واحد البعوض، تجنب استخدام التجارب على الحيوانات. الأسلوب مناسبة لتحليل عدد كبير من البعوض في تجربة واحدة ضمن فترة قصيرة من الوقت. واستخدمت فحوصات اللعاب القسري لتحليل البعوض الفردية 856 محاصرين في ألمانيا، بما في ذلك اثنان مختلفة المتعايشة Culex pipiens pipiens ، Culex تورينتيوم ، فضلا عن Aedes albopictus، التي كانت مصابة تجريبيا فيروس زكى (زيكف) والمحتضنة في 18 درجة مئوية أو 27 درجة مئوية لاثنين وثلاثة أسابيع. وبينت النتائج عدم وجود اختصاص متجه للأصناف Culex مختلفة زيكف. وفي المقابل، Aedes albopictus كان عرضه زيكف، ولكن فقط في 27 درجة مئوية، مع معدلات انتقال مماثلة إلى مستعمرة مختبر بعوض الزاعجة المصرية اختبارها في نفس الوقت.

بعوض الزاعجة المصرية هو معروف كناقل مختصة زيكف على الأقل تحت الظروف المناخية المدارية12. ولذلك، استخدمنا Ae. مصرية كعنصر إيجابي لإنشاء الفحص وتحليل مصلحة الضرائب وكذلك TRs في درجة حرارة حضانة من 27 درجة مئوية ورطوبة 80%. تم تعريف الأشعة تحت الحمراء وار كما سبق وصف فورتونا وآخرون. 13-التحديات Ae. مصرية أظهرت الأشعة تحت الحمراء من 50% و 72% و TR من 42 في المائة و 31 في المائة في 14 و 21 يوما بعد العدوى (نقطة في البوصة)، على التوالي (الشكل 1A و 1B). وفي وقت لاحق، تم اختبار البعوض الأوروبية للإصابة زيكف ونقلها باستخدام الظروف المناخية المدارية، فضلا عن المناطق المعتدلة.
في درجة حرارة الحضانة 27 درجة مئوية، أظهرت جميع البعوض أنواع العدوى زيكف على 14 نقطة في البوصة، فضلا عن 21 نقطة في البوصة، باستثناء الأفراد Cx. pipiens ص و Cx. تورينتيوم ، التي كانت إيجابية على 14 نقطة في البوصة فقط. أظهرت جميع الأنواع بعوضة IRs أعلى (بين 50 في المائة و 72 في المائة) فضلا عن تركيز الجيش الملكي النيبالي الفيروسية أعلى (106 حتى 10 عينات البعوض نسخ/9 الجيش الملكي النيبالي) بالمقارنة مع الأصناف Culex المختلفة، التي كشفت عن مصلحة الضرائب التي تتراوح بين 0 % ونسبة 32 في المائة والأحمال الفيروسية من 103 إلى 10 عينات البعوض نسخ/4 الجيش الملكي النيبالي. عرض جميع أنواع بعوض اللعاب زيكف-إيجابية (TR 13-42%)، بينما لم يتضمن أي من عينات اللعاب من الأصناف Culex زيكف (الشكل 1A و 1B). من المثير للاهتمام، معدلات انتقال ب 21 نقطة في البوصة متشابهة في Ae. مصرية و عبد اللطيف. البوبيكتوس من ألمانيا (30 في المائة)، ولكن كانت أقل بكثير في Ae. البوبيكتوس من إيطاليا (13%).
حضانة البعوض المطعون في درجة حرارة معتدلة من 18 درجة مئوية وكشف عموما يحمل الفيروس أقل في الأنواع بعوضة (4–10 10،6 الحمض النووي الريبي نسخ/البعوض) وكذلك في الأصناف Culex مختلفة (102 –104 نسخ الحمض النووي الريبي/البعوضة). ومع ذلك، حرارة الحضانة 18 درجة مئوية، لم يلاحظ انتقال زيكف لأي من أنواع البعوض بالتحقيق.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57980/57980fig1.jpg"> رقم 1: معدلات انتقال العدوى من البعوض المصابة تجريبيا مع زيكف- نتائج الدراسات اختصاص ناقلات مع زيكف في أنواع مختلفة من البعوض. ستة البعوض مختلفة الأنواع كانت مصابة زيكف والمحتضنة في 27 درجة مئوية أو 18 درجة مئوية 14 (أ) أو 21 (ب) أيام. ويعرف عدد البعوض مع اللعاب زيكف الإيجابية الواحدة وعدد من الهيئات البعوض زيكف إيجابية TR. وكان العدد الإجمالي للبعوض التحقيق 856، مع حد أدنى من 30 فردا لكل الأصناف نقطة/درجة الحرارة/البعوض في الوقت. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57980/57980fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes at JoVE.com

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

أجبر اللعاب كأسلوب لتحليل اختصاص البعوض ناقل

لكفاءة السيطرة على البعوض يوضع انتقال الفيروس، المعرفة بإمكانيات مكافحة ناقلات البعوض الحامل لكل منها أهمية خاصة. يصف لنا اللعاب القسري كوسيلة لتحليل المتجهات اختصاص Aedes albopictus وثلاثة من الأصناف Culex مختلفة لانتقال الفيروس Zika.

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...

forced-salivation-as-method-to-analyze-vector-competence

Research

JoVE Journal

Biology

9.5K Views.  Bernhard Nocht Institute for Tropical Medicine. لكفاءة السيطرة على البعوض يوضع انتقال الفيروس، المعرفة بإمكانيات مكافحة ناقلات البعوض الحامل لكل منها أهمية خاصة. يصف لنا اللعاب القسري كوسيلة لتحليل المتجهات اختصاص Aedes albopictus وثلاثة من الأصناف Culex مختلفة لانتقال الفيروس Zika.

Video: Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This video protocol demonstrates a method used by the James laboratory to microinject DNA constructs into Anopheles stephensi embryos for the generation of transformed mosquitoes. Techniques for preparing microinjection needles, collecting and preparing embryos and performing the microinjection are illustrated.

Anopheles stephensi mosquitoes are vectors for malaria inhabiting India and throughout Asia. This video demonstrates the technique for performing microinjections of this species with transgenes that will confer resistance to the malaria to the mosquito. Much of the methodology demonstrated in this video is applicable to microinjection techniques of other mosquito species.

حقن آن. stephensi الجنين لتوليد الملاريا مقاومة البعوض

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This ...

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Microinjection الجنين بعوض ألف الحصول على البعوض المعدلة وراثيا

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a rotorod, animals remain in approximately the same place making repetitive movements of stepping. Thus the task provides a rich source of information on the details of foot stepping movements. Subjects were hemi-Parkinson analogue rats, produced by injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into the right nigrostriatal bundle to deplete nigrostriatal dopamine (DA). The present report provides a video analysis illustration of animals previously were filmed from frontal, lateral, and posterior views as they walked (15). Rating scales and frame-by-frame replay of the video records of stepping behavior indicated that the hemi-Parkinson rats were chronically impaired in posture and limb use contralateral to the DA-depletion. The contralateral limbs participated less in initiating and sustaining propulsion than the ipsilateral limbs. These deficits secondary to unilateral DA-depletion show that the rotorod provides a use task for the analysis of stepping movements.

The rotorod test is used to assess motor status in the walking movement of hemi-Parkinson analogue rats.

استخدام Rotorod كأسلوب للتحليل النوعي من المشي في الجرذ

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinjection الجنين اسماك الزرد إلى تحليل وظائف الجينات

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

الكروماتوجراف الدهون تقارب الحويصلة بوساطة الفرز المغناطيسي باستخدام خلية المنشط (LIMACS) : طريقة جديدة لتحليل البروتين الدهني التفاعل

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, several traits are typically characterized using molecular assays to aid in epidemiological studies. These traits include species identification, insecticide resistance, parasite infection status, and host preference. Since populations of the Anopheles gambiae complex are morphologically indistinguishable, a polymerase chain reaction (PCR) is traditionally used to identify species. Once the species is known, several downstream assays are routinely performed to elucidate further characteristics. For instance, mutations known as KDR in a para gene confer resistance against DDT and pyrethroid insecticides. Additionally, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) or Plasmodium parasite DNA detection PCR assays are used to detect parasites present in mosquito tissues. Lastly, a combination of PCR and restriction enzyme digests can be used to elucidate host preference (e.g., human vs. animal blood) by screening the mosquito bloodmeal for host-specific DNA. We have developed a multi-detection assay (MDA) that combines all of the aforementioned assays into a single multiplex reaction genotyping 33SNPs for 96 or 384 samples at a time. Because the MDA includes multiple markers for species, Plasmodium detection, and host blood identification, the likelihood of generating false positives or negatives is greatly reduced from previous assays that include only one marker per trait. This robust and simple assay can detect these key mosquito traits cost-effectively and in a fraction of the time of existing assays.

Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.

مقايسة متعدد الكشف عن الملاريا بث البعوض

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, chikungunya and Zika. Wolbachia-infected mosquitoes can be released into the field to either reduce population sizes through incompatible matings or to transform populations with mosquitoes that are refractory to virus transmission. For these strategies to succeed, the mosquitoes released into the field from the laboratory must be competitive with native mosquitoes. However, maintaining mosquitoes in the laboratory can result in inbreeding, genetic drift and laboratory adaptation which can reduce their fitness in the field and may confound the results of experiments. To test the suitability of different Wolbachia infections for deployment in the field, it is necessary to maintain mosquitoes in a controlled laboratory environment across multiple generations. We describe a simple protocol for maintaining Ae. aegypti mosquitoes in the laboratory, which is suitable for both Wolbachia-infected and wild-type mosquitoes. The methods minimize laboratory adaptation and implement outcrossing to increase the relevance of experiments to field mosquitoes. Additionally, colonies are maintained under optimal conditions to maximize their fitness for open field releases.

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes infected with Wolbachia are being released into natural populations to suppress the transmission of arboviruses. We describe methods to rear Ae. aegypti with Wolbachia infections in the laboratory for experiments and field release, taking precautions to minimize laboratory adaptation and selection.

الحفاظ على بعوض الزاعجة المصرية "البعوض مصابة" ولبخيه

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such as Zika, dengue and malaria. Assays for rapid, high-throughput analyses of unformulated novel chemistries against mosquito larvae and adults are presented. We describe protocols for single point-dose and dose response assays to evaluate the toxicity of small molecule chemistries to the Aedes aegypti vector of Zika, dengue and yellow fever,&#160;the malaria vector, Anopheles gambiae and the northern house mosquito, Culex quinquefasciatus, on contact and via ingestion. As an example, we evaluated the toxicity of amitriptyline, a small molecule antagonist of G protein-coupled receptors, via larval, adult topical and adult blood-feeding assay. The protocols provide a starting point to investigate insecticide potential. Results are discussed in the context of additional experiments to explore product applications and mechanisms for delivery.

Protocols are described for assessing the toxicity of chemistries to immature and adult mosquitoes for development as new classes of larvicides, adulticides and endectocides. The protocols enable high-throughput testing of multiple chemistries at single-point dose and subsequent evaluation via dose response assay to determine toxicity on contact or via ingestion.

بروتوكولات لاختبار السمية لرواية كيمياء مبيدات الحشرات للبعوض

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...

A Blood-Free Diet to Rear Anopheline Mosquitoes

Malaria research requires large-scale breeding and production conditions for mosquitoes (Anopheles spp.) in captivity. The sustainable and reliable production of mosquitoes is currently inhibited by the supply of fresh vertebrate blood. Alternatives to blood are required to promote efficient control strategies for malaria and other vector borne diseases that are transmitted by blood feeding insects. With this in mind, artificial liquid diets were formulated as substitutes for fresh vertebrate blood. Herein we report a blood-free artificial liquid diet that delivers feeding rates similar to blood and mimics the physiological effects of a fresh vertebrate blood meal. The diet induces ovarian and egg maturation of Anopheles mosquitoes and also produces good larval survival and development of functional adults. The formulated blood-free liquid diet is an important advance towards sustainable mosquito breeding in captivity and will reduce the maintenance costs of mosquito colonies and eliminate the need for fresh vertebrate blood.

A protocol is presented for formulation of a blood-free artificial diet to feed Anopheles mosquitoes in captivity. This diet has a similar performance to vertebrate blood and triggers oogenesis and egg maturation and produces viable adult progeny.

نظام غذائي خالي من الدم لخلفية البعوض الأنوفيلين

Malaria research requires large-scale breeding and production conditions for mosquitoes (Anopheles spp.) in captivity. The sustainable and reliable ...

Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of pathways involved in parietal epithelial cell activation could therefore be a tool to attenuate the progression of glomerular diseases. This article describes a method to culture and analyze parietal epithelial cell outgrowth of encapsulated glomeruli isolated from mouse kidney. After dissecting isolated mouse kidneys, the tissue is minced, and glomeruli are isolated by sieving. Encapsulated glomeruli are collected, and single glomeruli are cultured for 6 days to obtain glomerular outgrowth of parietal epithelial cells. During this period, parietal epithelial cell proliferation and migration can be analyzed by determining the cell number or the surface area of outgrowing cells. This assay can therefore be used as a tool to study the effects of an altered gene expression in transgenic- or knockout-mice or the effects of culture conditions on parietal epithelial cell growth characteristics and signaling. Using this method, important pathways involved in the process of parietal epithelial cell activation and consequently in glomerulosclerosis can be studied.

This article describes a method for culturing and analyzing glomerular parietal epithelial cell outgrowths of encapsulated glomeruli isolated from mouse kidney. This method can be used to study pathways involved in parietal epithelial cell proliferation and migration.

Glomerular Outgrowth كما مُجرا السابق Vivo لتحليل المسارات المشاركة في تنشيط الخلية الظهارية Parietal

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of ...