ونظراً لأوجه التشابه الصارخة بين دورة حياة وبيولوجيا طفيليات الملاريا القوارض، طفيليات الملاريا البشرية، أصبحت نماذج الملاريا القوارض لا غنى عنها لأبحاث الملاريا. ويمكن لهذه الأساليب القياسية أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بحوث الملاريا حول كيفية إجراء تحليل ظاهري لأنواع الملاريا من النوع البري وأنواع الملاريا المعدلة وراثيا. وسوف يكون من بين الاجراءات طلبة الدراسات العليا جوزد ديفيتشي ولكنور يلماز من مختبري.
تبدأ بسرعة ذوبان حفّظ حفظة مخزون الطفيليات المجمدة وعلى الفور باستخدام حقنة ملليلتر واحدة مجهزة بإبرة قياس 26 لحقن ما لا يقل عن اثنين من الفئران المانحة لكل نمط جيني intraperitoneally مع ما يقرب من 200 ميكرولتر من المخزون. بعد 24 ساعة من الحقن، استخدم إبرة قياس 24 أو 26 لخز ذيل الفأر الأول وجمع قطرات الدم على شريحة المجهر. استخدم الحافة القصيرة لشريحة أخرى لتشويه الدم بسرعة عبر الشريحة الأولى.
عندما يكون الدم قد جفت تماما، إصلاح الشرائح في 100٪ الميثانول لمدة دقيقة واحدة على الأقل. وصمة العينات الثابتة في Giemsa لمدة 10 إلى 15 دقيقة تليها واحدة أو مزدوجة غسل المياه المقطر. عندما تكون الشرائح قد جفت ، وعرض العينات تحت الهدف 100X والنفط الغمر على المجهر الخفيف لحساب العدد الإجمالي للجلث كريات الدم الحمراء المصابة في الشبكة.
بعد يومين إلى ثلاثة أيام من العدوى ، قم بتأمين فأر تخدير يصل فيه الطفيلي إلى ما بين 0.1 إلى 1٪ في وضع الوبين واستخدم ملقطًا لرفع الجلد بالقرب من قاعدة القص لتسهيل إنشاء شق جلدي. سحب الجلد عن بعضها البعض في موقع شق لفضح الحجاب الحاجز وأعلى تجويف البطن واستخدام ملقط لعقد قاعدة القفص الصدري في حين قطع من خلال الحجاب الحاجز لدخول تجويف الصدر. دبوس مرة أخرى القفص الصدري لفضح القلب واستخدام حقنة ملليلتر واحد تحتوي على ما لا يقل عن 20 ميكرولتر من الهيبارين ومجهزة بإبرة قياس 26 لثقب بلطف أنسجة القلب.
تراجع ببطء المكبس لجمع ما يقرب من ملليلتر من الدم وصرف الدم في أنبوب microcentrifuge. عندما يتم حصاد كل الدم ، تدفئة الفئران المتلقي تحت مصباح الحرارة الحمراء وتحميل حقنة الأنسولين واحدة مجهزة بإبرة قياس 27 لكل مستلم مع الجرعة المناسبة من الطفيلي. ثم ضع المتلقي الأول في تقييد وحقن جرعة واحدة كاملة من كريات الدم الحمراء المصابة في الوريد الذيل المتوسع.
بالنسبة لتغذية البعوض، اسمح لأنثى أنوفيليس ستيفنسي أو بعوض غامبيا البالغ عمرها أربعة إلى سبعة أيام بالتجويع لمدة ثماني إلى 12 ساعة لإطعام أكثر من 15 دقيقة على الأقل على الفئران المصابة المصبّعة التي تعاني من أعلى معدل للتخويل. ولتحديد عدد البويضات sporozoites لكل بعوضة، قتل 20 إلى 30 بعوضة في الفريزر لمدة لا تقل عن 10 دقائق واستخدام نطاق تشريح منظار واثنين من الإبر قياس 26 أو 27 لتشريح منتصف البعوض على شريحة زجاجية تحتوي على محلول التشريح المناسب. لتشريح منتصف المنتصف ، أمسك أولاً الجزء السفلي من البطن في مكانه بإبرة واحدة ودفع الصدر برفق شديد عند التقاطع بين البطن والصدر في اتجاه تصاعدي حتى يفصل الصدر ويتم الكشف عن منتصف ة بيضاء اللون تتدلى من الصدر.
الآن قطع منتصف المريء من نهاية استخدام نفس إبرة التي كانت تستخدم لدفع الصدر التصاعدي وبالتالي فصل ونشر منتصف. رفع midgut تشريح من وسيلة تشريح باستخدام إبرة ونقلها إلى أنبوب مملوءة 200 ميكرولترات من RPMI. عندما يتم تشريح جميع منتصفات وحصد، ضع الأنبوب الذي يحتوي على منتصف الguts في جهاز الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة في 700 مرة ز.
ثم طحن الأنسجة المحصودة مع آفة مرتين. نقل 12 ميكرولترات من محلول الأنسجة المخفف إلى مقياس الهد واحتضان مقياس الهائيات في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق للسماح للمحتويات بالاستقرار. ثم تحديد متوسط عدد sporozoites oocyst على المجهر الخفيف تحت النقيض المرحلة والتكبير 40X.
لتحديد عدد الغدد اللعابية sporozoites لكل بعوضة، في الوقت المناسب بعد التغذية، وتجميد القتل الرحيم 50 إلى 100 البعوض الإناث كما هو موضح واستخدام مجهر تشريح والجانب من إبرة قياس 26 أو 27 لعزل الغدد اللعابية. لتشريح الغدد اللعابية، أولا عقد الجزء العلوي من البطن أو الصدر في مكان مع الجانب مشطوف من إبرة واحدة ودفع بعناية الرأس بخفة جدا ويدفع قصيرة جدا عند تقاطع بين الرأس والصدر في اتجاه تصاعدي. ادفع حتى يتم فصل الرأس بعناية عن الصدر دون تمزيق الغدة اللعابية الزجاجية.
استخدام ماصة قصيرة من الزجاج باستور لرفع الغدة اللعابية تشريح من وسط تشريح ووضعها في أنبوب 1.5 ملليلتر. عندما يتم تشريح جميع الغدد اللعابية وحصادها، ضع الأنبوب الذي يحتوي على الغدد في جهاز الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة في 700 مرة ز. طحن الأنسجة المحصودة مع آفة مرتين.
ثم تحديد متوسط عدد الغدد اللعابية sporozoites كما فعلت سابقا. الطفيليات الملاريا مراسل المعدلة وراثيا هندستها للتعبير عن EGFP تحت سيطرة المروج قوية و التأسيسية المعرض إشارة الفلوريس في مراحل الدم، ookinetes، oocysts الشباب على أنوفيليس ستيفنسي midguts، وفي sporozoites معزولة عن الغدد اللعابية من الإناث Anopheles ستيفنسي. تدفق قيم نسبة الطفيليات الدموية خلايا تتوافق مباشرة مع النسب المئوية المقدرة للطفيليات التي تم الحصول عليها عن طريق رصد مسحات الدم رقيقة Giemsa ملطخة كما ثبت التأكد من صحة طريقة القياس الكمي الأخير.
بالإضافة إلى ذلك، فإن تقدير النسب المئوية لكل مرحلة من المراحل الجنسية والجنسية المختلفة يعتمد على التقييم المورفولوجي للكريات الحمراء التي لا يمكن تقييمها بواسطة قياس التدفق الخلوي. مقارنة بين الطرق الوريدية للعدوى بين المسارات الوريدية للعدوى تكشف عن انخفاض مهم إحصائياً في نسبة الطفيليات في فئة المصابين بالملكية الفكرية مقارنة بنسبة طفيلي الدم في الفئة الرابعة المصابة خلال الأيام الأربعة الأولى من العدوى مما يدل على أن الطريق الرابع للعدوى هو طريق أكثر دقة من الناحية الكمية للمقارنات مع مراحل الدم طفيليات الملاريا. وتجدر الإشارة إلى أن علاج فينيل هييدرازين يزيد بشكل كبير من عدد الخلايا التي تزيد من معدل تكوين شعيتات الذكور مما يؤدي بدوره إلى زيادة معدل الإخصاب وعدد جميع مراحل البعوض اللاحقة.
هناك ندرة في الأساليب الموحدة للتحليل الظاهري للطفيليات مرحلة الدم الملاريا القوارض وانتقالها إلى ناقل البعوض. وستساعد هذه الطرق على توفير بروتوكولات موحدة ومبسطة لدراسة مسببات الأمراض هذه ومراحل دورة حياتها.
