يحدد هذا البروتوكول الإعداد البسيط لتصوير AFM للحويصلات خارج الخلية في أشكال رطبة ومهيئة ، وجمودها الكهروستاتيكي ، ومسح السطح ، وتحديد الهوية ، وتحليل البيانات وتفسيرها. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي التثبيت الكهربائي الملائم للحويصلات على سطح الجلد وتحليل التصوير بعد ذلك لحساب تشوه الشكل الناجم عن الجمود. نتائج الحويصلات التي تم الحصول عليها تحجيم تتفق مع التصوير المبرد القياسي الذهبي الذي لا يزال تقنية مكلفة وصعبة.
إذا كنت مستخدمًا جديدًا لـ AFM ، فبدأ بتوصيف العينات الجافة قبل الانتقال إلى عينات رطبة. لأن هناك العديد من العوامل الإضافية التي يمكن أن تؤثر على حيازة عينة رطبة. للبدء، عزل العوائل خارج الخلية من السائل الحيوي كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب.
المقبل، ربط بحزم قرص الميكا إلى قرص عينة الفولاذ المقاوم للصدأ المغناطيسي. اضم القرص الميكا باستخدام شفرة حادة لفضح طبقة جديدة من المواد. في درجة حرارة الغرفة، علاج السطح العلوي من الميكا لمدة عشر ثوان مع مائة لتر صغير من عشرة مللي ميل النيكل الثاني محلول كلوريد.
هذا بتعديل شحنة السطح من السلبية إلى الإيجابية. لطخة حل كلوريد النيكل الثاني مع مسح الوبر الحرة أو ورقة النشاف. ثم، وغسل سطح الميكا ثلاث مرات مع المياه الأيونية وتجفيفه مع تيار من النيتروجين الجاف.
ضع قرص العينة AFM مع الميكا السطحي المرفق المعدل في طبق بتري. بعد ذلك ، تمييع الاكسوسومات مع PBS للحصول على تركيز بين أربعة وأربعين مليار جسيمات لكل ملليلتر من الحل. التحقق من صحة تركيز الجسيمات المخففة باستخدام تحليل تتبع الجسيمات النانوية.
شكل قطرة sessile على سطح الميكا عن طريق إفراغ 100 ميكرولترات من محلول الكوسوم المخفف من ماصة. ثم ضع الغطاء على طبق بتري وختمه مع فيلم parafen للحد من تبخر العينة. احتضان في الثلاجة لمدة اثنتي عشرة ساعة.
بعد الحضانة ، تتبخر 80 إلى 90 في المئة من العينة بعناية دون إزعاج السطح. عند هذه النقطة، سوف تكون الاحتياطات الكهربائية شلت كهربائيا على الركيزة الميكا. عند تصوير العينات المائية، شطف السطح ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
الحرص على الحفاظ على رطوبة العينة طوال عملية الشطف. بعد غسل سطح الميكا مع برنامج تلفزيوني، وإزالة 80 إلى 90 في المئة من السائل والماصات أربعين microlits من برنامج تلفزيوني الطازجة لتغطية العينة. العينة المرطبة جاهزة للتصوير.
عند تصوير EV المجفف، قم بإزالة الأملاح من السطح عن طريق شطف الركيزة ثلاث مرات بالماء غير المتأين. بعد التعرق أكبر قدر ممكن من السائل، دون لمس السطح، وتجفيف بقية مع تيار من النيتروجين الجاف. لتصوير حويصلات خارج الخلية المجففة، حدد cantilever مصممة لمسح في الهواء في وضعيات التصوير التلامسية وغير اللاصقة وقم بتركيبها على حامل المسبار.
ضع العينة على مرحلة AFM. سوف القرص عينة الفولاذ المقاوم للصدأ المغناطيسي شل العينة على خشبة المسرح. ضع حامل المسبار في AFM.
السماح بالوقت للتحضير والمرحلة لتكسير حراريا. استخدم وضع التنصت لمسح منطقة 5x5 ميكرون منقوطة في 512 خطوط بمعدل مسح واحد هيرتز. الحصول على كل من الطول ومرحلة الصور لأنها توفر معلومات مجانية عن التضاريس وخصائص سطح العينة.
سوف يزيد وقت المسح الضوئي مع مساحة صور وعدد الخطوط المحددة لتشكيل الصورة، ولكن مع انخفاض معدل المسح الضوئي. بما أن معدلات المسح السريع قد تؤثر على جودة الصورة، يجب أن تكون سرعة المسح الضوئي توازنًا بين وقت الاكتساب وجودة الصورة. لصورة حويصلات رطبة، حدد cantilever المناسبة لمسح عينات ناعمة ورطبة وقم بتركيب الـ cantilever على حامل مسبار مصمم للمسح الضوئي في السوائل.
الرطب غيض من cantilever مع برنامج تلفزيوني للحد من احتمال إدخال فقاعات الهواء إلى السائل أثناء المسح الضوئي. ثم، قم بشل العينة على مرحلة AFM. مرة واحدة في العينة توازن حراريا، صورة سطح الميكا رطب في وضع التنصت.
الحصول على كل من الطول ومرحلة الصور. لتحليل الصور المُتَخَذة، انتقل أولاً إلى أوضاع معالجة البيانات'select SPM، متبوعة بـ تلميح'، واختر تلميح النموذج'حدد الشكل الهندسي وأبعاد التلميح المستخدم لمسح العينة وانقر OK'تصحيح التحف الخاصة بتآكل التلميح عن طريق تنفيذ إعادة بناء السطح. افتح الصورة.
من القائمة، حدد معالجة البيانات'اخص أوضاع SPM متبوعة بـ تلميح'ث اختر إعادة بناء السطح'، ثم انقر فوق OK'Next، حدد معالجة البيانات، متبوعاً بالمستوى'، ثم اختر مستوى المستوى لمحاذاة مستوى التصوير ولمطابقة مستوى XY الخاص بالمختبر عن طريق إزالة الميل في الركيزة من بيانات المسح الضوئي. محاذاة الصفوف في الصورة عن طريق تحديد عملية البيانات'تليها البيانات الصحيحة'، ثم اختر محاذاة الصفوف'خيارات المحاذاة المتعددة متوفرة بما في ذلك الوسيط الذي هو خوارزمية التي تبحث عن متوسط ارتفاع كل خط مسح ويطرحه من البيانات. بعد ذلك، انتقل إلى عملية البيانات'تليها البيانات الصحيحة'، ثم اختر إزالة الندوب'سيؤدي هذا إلى إزالة أخطاء المسح الشائعة المعروفة باسم Scars'to محاذاة سطح الميكا عند ارتفاع الصفر، انتقل إلى قائمة معالجة البيانات وحدد محاذاة القاعدة'في القائمة مستوى'إسقاط لأسفل.
تحديد الحويصلات الخلوية الإضافية على السطح الممسوح ضوئياً من خلال الذهاب إلى قائمة Grains'وباستخدام علامة بواسطة Threshold'تحدد هذه الخوارزمية السطح الذي تم تعطيله كجسيمات تبرز من الركيزة السطحية الصفرية بارتفاع أعلى من العتبة المحددة من قبل المستخدم. حدد عتبة في النطاق بين نانومتر واحد وثلاثة نانومتر. هذا سيقضي على معظم التدخل الأرضي الخلفي.
وأخيرا، تنفيذ توصيف هندسي والأبعاد من حويصلات محددة باستخدام خوارزميات التوزيعات المتاحة التي يمكن الوصول إليها من قائمة Grains'. تصدير البيانات AFM من Gwyddion لتحليل متخصص من قبل أدوات حسابية أخرى وبرامج الكمبيوتر المخصصة. يؤدي تعديل سطح كلوريد النيكل إلى شلّ الخلايا الزائدة التي تعتمد على الوقت.
تركيز السطح من الحويصلات غير مُشلّس مفرط الكثافة بعد 24 ساعة من الحضانة في حين أن الحضانة 12 ساعة تؤدي إلى عدد أقل من الظفسات وبيانات المسح الضوئي التي يسهل تحليلها بدقة. تُظهر هذه الصورة AFM هيدرات MCF7 إكسوزومات كهربائية غير ثابتة على سطح الميكا المعدل. إن الصورة المقابلة لمرحلة AFM تؤكد أن الحبوب في صورة الارتفاع هي جزيئات نانوية ناعمة كما يجب أن يتوقعها غشاء الغشاء.
تظهر بيانات الارتفاع لثلاث شعونات على طول نفس الخط هنا. توضح هذه الملامح شكلًا مسطّحًا بسبب جاذبية الإكسوسومات الكهروستاتيكية إلى سطح الشحن الإيجابي للميكا المعدلة. تشويه الشكل واضح في عرض تكبير من vesicle شل الحركة والقسم العرضي لها.
لتقدير حجم كروي من الاحجام في الحل، على يمكن أن تتطابق مع وحدات التخزين المغلقة من قبل سطح مشلة ومغلفات الغشاء كروية. تم تحديد حجم توزيع العويصلات في الحل من بيانات AFM من 561 من العويصلات غير المُعاقة. أحجام الحويّات في صور CryoTEM تتفق مع نتائج AFM.
قبل تصوير الـ هضّامات الهدّام، من المهم أن تتذكر أن تشطف السطح بدقة مع برنامج تلفزيوني. هذا سوف إزالة exosomes الواردة ومنع تعلقها إلى طرف AFM. عند تصوير الاحضاجات المجففة، تأكد من استخدام المياه DI ليرتفع الركيزة.
غسل DI منع تشكيل بلورات الملح على السطح كما يجف الركيزة. إذا كان موجودا، بلورات الملح سيجعل معالجة الصور مهمة صعبة.
