الكتاب يعترف البرنامج تعقيم الكلاب في أونيسب-فكاف يرجى توفير المبايض. وأيد هذا العمل منح من FAPESP (عملية رقم 2013-14293-0) والرؤوس.

وأجريت هذه التجربة مع المبايض أربعة كلاب أنثى مهجنة تبرعت بعد الجراحة الاختيارية في برنامج تعقيم الكلاب البوليسية. وأقر هذا تجربة "لجنة الأخلاقيات" في استخدام الحيوانات في أونيسب-فكاف (البروتوكول رقم 026991/13).
1-إعداد التجريبية
<ol><li>إعداد أو شراء 500 مل من مخزنة الفوسفات المالحة العقيمة دولبيكو (دببس) دون الكالسيوم أو المغنيسيوم.</li>
	<li>إعداد كولاجيناز أنا الأسهم الحل عن طريق خلط 40 ميكروغرام للانزيم في 1 مل دببس. التصفية باستخدام عامل تصفية حقنه 0.2 ميكرون، وتخزين مختبرين 2 مل في-20 درجة مئوية.</li>
	<li>تعد وسائل الإعلام ثقافة من المتوسطة (دميم) الجلوكوز تعديل النسر دولبيكو منخفضة مع المصل الجنيني 10% و 1% من المضادات الحيوية.</li>
	<li>جمع مواد معقمة: الأطباق المقص والملقط، قارورة زراعة الأنسجة، وأنابيب ماصات 10 مل و 5 مل.</li>
	<li>استخدام معدات المختبرات ثقافة الخلية القياسية: سلامة بيولوجية مجلس الوزراء (BSC)، حاضنة ثقافة خلية المحددة في 5% CO2 و 38 درجة مئوية، ومن أجهزة الطرد مركزي.</li>
	<li>تنظيف بكالوريوس العلوم: مع الأيدي القفاز، وتعقيم مع 70% EtOH، باستخدام مصابيح الأشعة فوق البنفسجية.</li>
</ol>2-عزل الخلايا الجذعية الوسيطة من المبيض
<ol><li>بعد الجراحة، وإبقاء المبيض في برنامج تلفزيوني على الجليد في أنبوب مخروطي، حتى وصولها إلى المختبر.</li>
	<li>شغل اثنان من أطباق بيتري 100 ملم مع 10 مل من برنامج تلفزيوني.</li>
	<li>إزالة المبايض من الأنبوب ونقلها إلى طبق بتري الأول مع برنامج تلفزيوني. غسلها بخلط الحركات.</li>
	<li>بلطف استرداد المبيض ووضعه في طبق آخر. مع ملاقط معقمة ومقص، فرم الأنسجة إلى قطع صغيرة جداً، حوالي 1 ملم في الحجم.</li>
	<li>نقل أنسجة المبيض إلى 35 مم طبق بيتري وإضافة 2 مل كولاجيناز. فرم الأنسجة أكثر قليلاً.</li>
	<li>ضع طبق بيتري في الحاضنة عند 38 درجة مئوية ح 3 وهزه بلطف طبق بيتري مع حركات دائرية كل 20 دقيقة.</li>
	<li>بعد ح 3، إزالة طبق بيتري من الحاضنة.</li>
	<li>نقل محتويات الطبق إلى أنبوب 15 مل. إضافة 5 مل من التوسع في وسائل الإعلام.</li>
	<li>برفق عكس الأنبوب قبل الطرد المركزي. الطرد المركزي الأنبوب في ز 2100 x للحد الأدنى 7 إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه مع 3 مل من التوسع في وسائل الإعلام.</li>
	<li>نقل بيليه إلى زجاجة T25. ضع الزجاجة في الحاضنة مع 5% CO2 في 38 درجة مئوية ح 3. ملاحظة: أهم جزء من الإجراءات لتغيير وسائل الإعلام بعد ح 3 من الحضانة.</li>
	<li>قم بإزالة الزجاجة من الحاضنة ووسائط الإعلام مع الأنسجة المتبقية. إضافة 3 مل من توسع جديدة وسائل الإعلام إلى الزجاجة.</li>
	<li>تغيير وسائل الإعلام كل 48 ساعة ومراقبة الزجاجة لالتقاء الخلوية. ملاحظة: يمكن ملاحظة الخطوات الرئيسية لهذا الإجراء في الشكل 1.</li>
</ol>3-توسيع نطاق خلايا الجذعية الوسيطة من المبيض
<ol><li>
مرور الخلية
	<ol>
<li>عندما تصل الخلايا إلى التقاء، قم بإزالة الوسائط من الزجاجة.</li>
		<li>تغسل الزجاجة مع 3 مل من برنامج تلفزيوني. قم بإزالة برنامج تلفزيوني.</li>
		<li>إضافة 1.5 مل التربسين ووضع الزجاجة في الحاضنة عند 38 درجة مئوية للحد الأدنى 3 اضغط برفق زجاجة لمساعدة الخلايا لفصل. ملاحظة: الخلايا ينبغي التوصل إلى التقاء ما يقرب من 5-7 د بعد الطلاء الأولى.</li>
		<li>أضف 3 مل من التوسع في وسائل الإعلام ونقل المحتويات إلى أنبوب مخروطي.</li>
		<li>الطرد المركزي الأنبوب في 2100 س ز للحد الأدنى 7 إزالة المادة طافية وإضافة 1 مل من التوسع في وسائل الإعلام.</li>
		<li>مجانسة محتويات الأنبوبة برفق.</li>
		<li>تأخذ قاسمة 10 ميليلتر من العينة لأداء الخلية العد ووضع الأنبوب مع الخلايا في الحاضنة.</li>
		<li>المكان 10 ميليلتر من هذا المزيج إلى هيموسيتوميتير.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
عد الخلايا
	<ol>
<li>استخدام 10 X الهدف المجهر والتركيز على خطوط الشبكة هيموسيتوميتير.</li>
		<li>عد الخلايا الموجودة في المربعات الصغيرة الخمس (الشكل 2).</li>
		<li>مضاعفة عدد الأصوات التي تم فرزها حسب 50,000 لتقدير عدد الخلايا في المليلتر.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4-التفريق بين الخلايا الجذعية الوسيطة من المبيض
ملاحظة: أجريت فحوصات التفريق وفقا للمبادئ التوجيهية المحددة في تلة et al. 9.
<ol><li>البذور 1.0 × 104 خلايا كل جيدا، في ثلاث نسخ، استخدام طبق ثقافة 4-جيدا.</li>
	<li>أضف 1 مل من التوسع في وسائل الإعلام.</li>
	<li>تحرض الطبق مع حركات دائرية بلطف.</li>
	<li>بعد 24 ساعة، استبدال الوسائط الثقافة مع وسائط الإعلام التمايز المرغوب فيه.</li>
	<li>أوستيوجينيك، أديبوجينيك، والتفريق بين تشوندروجينيك، احتضان الخلايا مع وسائط الإعلام التعريفي لمد 30، مع استبدال الوسائط واستخدمت كل مجموعات محددة التمايز دال 3 لكل من هذه الاختبارات.</li>
	<li>للتفريق بين النسب العصبية، احتضان الخلايا د 10 في وسائط الإعلام التعريفي، مع استبدال الوسائط كل 3 د. الوسائط المستخدمة هنا الواردة دميم الجلوكوز منخفضة حمض فالبرويك مم 2، 1 ميكرومتر الهيدروكورتيزون، 10 فورسكولين ميكرومتر، كلوريد البوتاسيوم 5 مم، 5 ميكروغرام/مل الأنسولين و hydroxyanisole بوتيل 200 ميكرومتر.</li>
	<li>للسلائف الأنسجة، واحتضان لمد 5 في وسائل الإعلام الأنسجة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة كاشف.</li>
	<li>للتفريق بين نسب الخلايا البدائية، احتضان الخلايا في وسائط الإعلام التعريفي لمد 14، مع استبدال الوسائط كل 3 د. الوسائط المستخدمة هنا الواردة دميم، 10% FBS، بيروفات صوديوم 1 مم، 10 نانوغرام/مل ليف، الأحماض الأمينية غير الأساسية 1 مم، 2 مم L-الجلوتامين، 5 ميكروغرام/مل الأنسولين، مم 0.1 بيتا-ميركابتوثانول، 60 ميكرومتر بوتريسسيني، 20 ميكروغرام/مل ترانسفيرين، 10 نانوغرام/مل الماوس البشرة النمو عامل، 1 نانوغرام/مليلتر البشرية عامل النمو تنتجها الخلايا الليفية الأساسية، 40 نانوغرام/مليلتر الإنسان الدبقية الخلية المستمدة من خط نيوروتروفيك عامل، والبنسلين 15 مغ/لتر.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gazit, Z., Pelled, G., Sheyn, D., Kimelman, N., Gazit, D., Atala, A., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells.">Mesenchymal stem cells.</a> Handbook of Stem Cells (2nd Edition). , 513-527 (2013).</li><li>Zipori, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nature+of+stem+cells:+state+rather+than+entity.">The nature of stem cells: state rather than entity.</a> Nature Reviews Genetics. 5 (11), 873-878 (2004).</li><li>Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+surface+epithelium:+biology,+endocrinology,+and+pathology.">Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology.</a> Endocrine Reviews. 22 (2), 255-288 (2001).</li><li>Ahmed, N., Thompson, E. W., Quinn, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+interconversions+in+normal+ovarian+surface+epithelium+and+ovarian+carcinomas:+an+exception+to+the+norm.">Epithelial-mesenchymal interconversions in normal ovarian surface epithelium and ovarian carcinomas: an exception to the norm.</a> Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 581-588 (2007).</li><li>Bukovsky, A., Svetlikova, M., Caudle, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oogenesis+in+cultures+derived+from+adult+human+ovaries.">Oogenesis in cultures derived from adult human ovaries.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 3 (1), 17 (2005).</li><li>Gong, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell-like+cells+established+by+culture+of+adult+ovarian+cells+in+mice.">Embryonic stem cell-like cells established by culture of adult ovarian cells in mice.</a> Fertility and Sterility. 93 (8), 2594-2601 (2010).</li><li>Johnson, J., Canning, J., Kaneko, T., Pru, J. K., Tilly, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+stem+cells+and+follicular+renewal+in+the+postnatal+mammalian+ovary.">Germline stem cells and follicular renewal in the postnatal mammalian ovary.</a> Nature. 428 (6979), 145 (2004).</li><li>Deans, R. J., Moseley, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells:+biology+and+potential+clinical+uses.">Mesenchymal stem cells: biology and potential clinical uses.</a> Experimental Hematology. 28 (8), 875-884 (2000).</li><li>Trinda Hill, A. B. T., Therrien, J., Garcia, J. M., Smith, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal-like+stem+cells+in+canine+ovary+show+high+differentiation+potential.">Mesenchymal-like stem cells in canine ovary show high differentiation potential.</a> Cell Proliferation. 50 (6), 12391 (2017).</li><li>Dominici, M. L. B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement.">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8, 4315-4317 (2006).</li><li>Friedenstein, A. J., Piatetzky-Shapiro, I. I., Petrakova, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenesis+in+transplants+of+bone+marrow+cells.">Osteogenesis in transplants of bone marrow cells.</a> Development. 16 (3), 381-390 (1966).</li><li>Kuznetsov, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-colony+derived+strains+of+human+marrow+stromal+fibroblasts+form+bone+after+transplantation+in+vivo.">Single-colony derived strains of human marrow stromal fibroblasts form bone after transplantation in vivo.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 12 (9), 1335-1347 (1997).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

وهنا نحن نقدم الأدلة أن MSCs يمكن أن تكون معزولة من أنسجة المبيض الكلاب البوليسية، التي تعتبر النفايات البيولوجية بعد أوفاريكتومي. يرجع ذلك إلى حقيقة أن العديد من أنواع الخلايا ويمكن الاطلاع في المبيض، اقترحنا بروتوكول لتحديد MSCs على أساس على الانضمام السريع للبلاستيك، والتي نجحت بتحديد ال...

عدد الدراسات المنشورة التي تركز على الخلايا الجذعية قد زاد زيادة كبيرة على مدى العقد الماضي، مجهود بحثي قد تم تغذيها الهدف الجماعي لاكتشاف علاجات الطب التجديدي قوية. الخلايا الجذعية لديها علامات تعريف الأساسي هما: التجديد الذاتي والتمايز. الخلايا الجذعية الوسيطة هي المسؤولة عن دوران الأنسجة العادية وقدرة أكثر تقييداً من التمايز عند مقارنة بالخلايا الجذعية الجنينية1. في الآونة الأخيرة، وقد أظهرت العديد من الدراسات مجموعة واسعة من التفريق بين MSCs، وموضوع قيد المناقشة عما إذا كانت هناك اختلافات بين الخلايا الجذعية الجنينية والكبار في كل2.
ظهارة سطح أوفاريوم هو غير ملتزم بها طبقة من الخلايا، أقل نسبيا المتباينة، التي تعبر عن كل علامات الظهارية والوسيطة3، الاحتفاظ بالقدرة على التفريق في أنواع مختلفة من الخلايا في الاستجابة إلى 4من الإشارات البيئية. الموقع الدقيق للخلايا الجذعية في المبيض ليست معروفة جيدا؛ ومع ذلك، اقترح أن المتكفل بيبوتينتيال في الباجينا الغلالة تثير الخلايا الجرثومية5. الدراسات المناعية يكون الافتراض بأن هذه الخلايا اللحمية من أصل6 أو يقع في أو الدانية إلى سطح المبيض7. أن الخلايا الجذعية الوسيطة التعبير عن مستقبلات العديدة التي تلعب دوراً هاما في الخلية الالتصاق8، تجربة صمم لاختبار فرضية أن تحديد عدد الخلايا التي تحتوي على الانضمام السريع أن عزل أن خلايا وضوح تشاراكتيريزابل كالوسيطة في الطبيعة. في الآونة الأخيرة، ذكرت مجموعتنا اشتقاق MSCs من أنسجة المبيض استناداً إلى قدرتها على الانضمام إلى سطح البلاستيك طبق الثقافة في ح 3 الأول للثقافة، من أجل الحصول على عدد سكان المنقي للخلايا العارضة التصاق السريع9. وهنا يصف لنا الطريقة المتقدمة لعزل الخلايا الجذعية الوسيطة من أنسجة المبيض.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:665px;" width="666">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">DPBS&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">14190144</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Collagenase I</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">17100017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Tissue flask</td>
			<td style="width:151px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">CLS3056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">DMEM low glucose</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">11054020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">FBS</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">12484-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">TrypLE express</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">12604021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">StemPro Adipogenesis Differentiation Kit</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">A1007001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">A1007101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">StemPro Osteogenesis Differentiation Kit</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">A1007201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">STEMdiff Definitive Endoderm Kit</td>
			<td style="width:151px;">StemCell</td>
			<td style="width:123px;">5110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">CD45</td>
			<td style="width:151px;">AbD Serotec</td>
			<td style="width:123px;">MCA 2035S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">CD34</td>
			<td style="width:151px;">AbD Serotec</td>
			<td style="width:123px;">MCA 2411GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">CD90</td>
			<td style="width:151px;">AbD Serotec</td>
			<td style="width:123px;">MCA 1036G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">CD44</td>
			<td style="width:151px;">AbD Serotec</td>
			<td style="width:123px;">MCA 1041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Nestin</td>
			<td style="width:151px;">Milipore</td>
			<td style="width:123px;">MAB353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">&#946;-Tubulin&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Milipore</td>
			<td style="width:123px;">MAB1637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">DDX4</td>
			<td style="width:151px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">PA5 -23378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">IgG- FITC</td>
			<td style="width:151px;">AbD Serotec</td>
			<td style="width:123px;">STAR80F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">IgG- FITC</td>
			<td style="width:151px;">AbD Serotec</td>
			<td style="width:123px;">STAR120F</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivation and differentiation of canine ovarian mesenchymal stem cells

وقد تزايد الاهتمام بالخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) على مدى العقد الماضي بسبب سهولة العزل والتوسع، والثقافة. في الآونة الأخيرة، أظهرت الدراسات قدرة التمييز على نطاق واسع التي تمتلك هذه الخلايا. المبيض يمثل مرشح واعدة للعلاجات المستندة إلى خلية يرجع ذلك إلى حقيقة أن غنية في MSCs، وأنه كثيرا ما يتم تجاهلها بعد العمليات الجراحية أوفاريكتومي كالنفايات البيولوجية. توضح هذه المقالة الإجراءات للعزلة، التوسع، والتفريق بين MSCs المستمدة من المبيض الكلاب البوليسية، دون الحاجة إلى فرز الخلايا التقنيات. ويمثل هذا البروتوكول أداة هامة للطب التجديدي بسبب انطباق واسع النطاق لهذه الخلايا اختلاف الغاية في التجارب السريرية والأغراض العلاجية.

عزل الخلايا الجذعية الوسيطة من الكلاب المبيض:
ويرد الإجراء عزلة MSC المبيض في الشكل 1. بعد الجراحة، وتنميق الأنسجة، والهضم كولاجيناز، وتغيير الإعلام ح 3 بعد بداية الثقافة، كان عدد سكانها MSC المفترضة مع خصا...

Watch this Scientific Journal Video about Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells

هنا، نحن تصف طريقة للعزل والتوسع، وتمايز الخلايا الجذعية الوسيطة من أنسجة المبيض الكلاب البوليسية.

الاشتقاق وتمايز الخلايا الجذعية الوسيطة المبيض الكلاب

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies ...

الهدف العام لهذا الإجراء هو عزل وتوسيع وتمييز ينبع mesenchymal تبيع مشتقة من أنسجة المبيض الكلاب. تم إجراء هذه التجربة مع مبايض أربعة أنثوية مونغيل تبرعت بعد الجراحة الاختيارية في برنامج تعقيم الكلاب. وقد وافقت لجنة الأخلاقيات المعنية باستخدام الحيوانات في جامعة ولاية ساو باولو على هذه التجربة.نتائج تمثيلية. المناقشة.الختام.

derivation-differentiation-canine-ovarian-mesenchymal-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

5.6K Views.  São Paulo State University (UNESP). الهدف العام لهذا الإجراء هو عزل وتوسيع وتمييز ينبع mesenchymal تبيع مشتقة من أنسجة المبيض الكلاب. تم إجراء هذه التجربة مع مبايض أربعة أنثوية مونغيل تبرعت بعد الجراحة الاختيارية في برنامج تعقيم الكلاب. وقد وافقت لجنة الأخلاقيات المعنية باستخدام الحيوانات في جامعة ولاية ساو باول...

Video: Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.

In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.

اشتقاق خلايا القلب السلف من الخلايا الجذعية الجنينية

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

No cure has been discovered for age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex multifactorial disease with an unknown etiology, although it is largely thought to occur due to death or dysfunction of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells that underlies the retina and provides critical support for photoreceptors. RPE cell replacement strategies may hold great promise for providing therapeutic relief for a large subset of AMD patients, and RPE cells that strongly resemble primary human cells (hRPE) have been generated in multiple independent labs, including our own. In addition, the uses for iPS-RPE are not limited to cell-based therapies, but also have been used to model RPE diseases. These types of studies may not only elucidate the molecular bases of the diseases, but also serve as invaluable tools for developing and testing novel drugs. We present here an optimized protocol for directed differentiation of RPE from stem cells. Adding nicotinamide and either Activin A or IDE-1, a small molecule that mimics its effects, at specific time points, greatly enhances the yield of RPE cells. Using this technique we can derive large numbers of low passage RPE in as early as three months.

Stem cell-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells may be used for multiple applications including cell-based therapies for retinal degeneration, disease modeling, and drug studies. Here we present a simple protocol for reproducibly deriving RPE from stem cells.

اشتقاق كفاءة خلايا الظهارة الصبغية الشبكية من الخلايا الجذعية

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have become an important cell source to address the lack of primary cardiomyocytes available for basic research and translational applications. To differentiate hiPSCs into cardiomyocytes, various protocols including embryoid body (EB)-based differentiation and growth factor induction have been developed. However, these protocols are inefficient and highly variable in their ability to generate purified cardiomyocytes. Recently, a small molecule-based protocol utilizing modulation of Wnt/&#946;-Catenin signaling was shown to promote cardiac differentiation with high efficiency. With this protocol, greater than 50%-60% of differentiated cells were cardiac troponin-positive cardiomyocytes were consistently observed. To further increase cardiomyocyte purity, the differentiated cells were subjected to glucose starvation to specifically eliminate non-cardiomyocytes based on the metabolic differences between cardiomyocytes and non-cardiomyocytes. Using this selection strategy, we consistently obtained a greater than 30% increase in the ratio of cardiomyocytes to non-cardiomyocytes in a population of differentiated cells. These highly purified cardiomyocytes should enhance the reliability of results from human iPSC-based in vitro disease modeling studies and drug screening assays.

Here, we describe a robust protocol for human cardiomyocyte derivation that combines small molecule-modulated cardiac differentiation and glucose deprivation-mediated cardiomyocyte purification, enabling production of purified cardiomyocytes for the purposes of cardiovascular disease modeling and drug screening.

اشتقاق العضلية العالية النقاء من صنع الإنسان المحفزة الخلايا الجذعية عن طريق صغير التمايز التضمين جزيء واللاحقة الجلوكوز المجاعة

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have become an important cell source to address the lack of primary cardiomyocytes ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.

This work describes an in vitro differentiation protocol to produce pigmented, mature melanocytes from human pluripotent stem cells via a neural crest and melanoblast intermediate stage using a feeder-free, 25 day protocol.

اشتقاق خالية المغذية من الخلايا الصباغية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated by transcription factors which bind genomic regulatory regions including enhancers and promoters of cardiac constitutive genes. DNA is wrapped around histones that are subjected to chemical modifications. Modifications of histones further lead to repressed, activated or poised gene transcription, thus bringing another level of fine tuning regulation of gene transcription. Embryonic Stem cells (ES cells) recapitulate within embryoid bodies (i.e., cell aggregates) or in 2D culture the early steps of cardiac development. They provide in principle enough material for chromatin immunoprecipitation (ChIP), a technology broadly used to identify gene regulatory regions. Furthermore, human ES cells represent a human cell model of cardiogenesis. At later stages of development, mouse embryonic tissues allow for investigating specific epigenetic landscapes required for determination of cell identity. Herein, we describe protocols of ChIP, sequential ChIP followed by PCR or ChIP-sequencing using ES cells, embryoid bodies and cardiac specific embryonic regions. These protocols allow to investigating the epigenetic regulation of cardiac gene transcription.

A fine tuning regulation of gene transcription underlies embryonic cell fate decision. Herein, we describe chromatin immunoprecipitation assays used to investigate epigenetic regulation of both cardiac differentiation of stem cells and cardiac development of mouse embryos.

تنظيم جينية من القلب تمايز الخلايا الجذعية الجنينية والأنسجة

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

العزل والتوسع في الجذعية الوسيطة / خلايا انسجة مشتقة من المشيمة البشرية الأنسجة

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading cause of mortality worldwide. Mesenchymal stem cells (MSCs) are a promising option for cell-based therapies to replace current, invasive techniques. MSCs can differentiate into mesenchymal lineages, including cardiac cell types, but complete differentiation into functional cells has not yet been achieved. Previous methods of differentiation were based on pharmacological agents or growth factors. However, more physiologically relevant strategies can also enable MSCs to undergo cardiomyogenic transformation. Here, we present a differentiation method using MSC aggregates on cardiomyocyte feeder layers to produce cardiomyocyte-like contracting cells.
Human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs) have been shown to have a greater differentiation potential than commonly investigated MSC types, such as bone marrow MSCs (BMSCs). As an ontogenetically younger source, we investigated the cardiomyogenic potential of first-trimester (FTM) HUCPVCs compared to older sources. FTM HUCPVCs are a novel, rich source of MSCs that retain their in utero immunoprivileged properties when cultured in vitro. Using this differentiation protocol, FTM and term HUCPVCs achieved significantly increased cardiomyogenic differentiation compared to BMSCs, as indicated by the increased expression of cardiomyocyte markers (i.e., myocyte enhancer factor 2C, cardiac troponin T, heavy chain cardiac myosin, signal regulatory protein &#945;, and connexin 43). They also maintained significantly lower immunogenicity, as demonstrated by their lower HLA-A expression and higher HLA-G expression. Applying aggregate-based differentiation, FTM HUCPVCs showed increased aggregate formation potential and generated contracting cells clusters within 1 week of co-culture on cardiac feeder layers, becoming the first MSC type to do so. 
Our results demonstrate that this differentiation strategy can effectively harness the cardiomyogenic potential of young MSCs, such as FTM HUCPVCs, and suggests that in vitro pre-differentiation could be a potential strategy to increase their regenerative efficacy in vivo.

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Here, we present a method to efficiently harness the cardiac differentiation potential of young sources of human mesenchymal stem cells in order to generate functional, contracting, cardiomyocyte-like cells in vitro.

في المختبر تمايز الخلايا الجذعية البشرية الوسيطة إلى الفنية كارديوميوسيتي مثل الخلايا

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) cells. Maintenance of hiPS cells on feeder cells or undefined matrices are susceptible to batch variances, pathogenic contamination and risk of immunogenicity. Utilizing the defined recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix in combination with xeno-free and defined media formulations reduces variability and allows for the consistent generation of hiPS cells. The Sendai virus (SeV) vector is a non-integrating RNA-based system, thus circumventing concerns associated with the potential disruptive effect on genome integrity integrating vectors can have. Furthermore, these vectors have demonstrated relatively high efficiency in the reprogramming of dermal fibroblasts. In addition, enzymatic single cell passaging of cells facilitates homogeneous maintenance of hiPS cells without substantial prior experience of stem cell culture. Here we describe a protocol that has been extensively tested and developed with a focus on reproducibility and ease of use, providing a robust and practical way to generate defined and xeno-free human hiPS cells from fibroblasts.

Robust derivation of human induced pluripotent stem (hiPS) cells was achieved by using non-integrating Sendai virus (SeV) vector mediated reprogramming of dermal fibroblasts. hiPS cell maintenance and clonal expansion was performed using xeno-free and chemically defined culture conditions with recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix and Essential E8 (E8) Medium.

التكامل الانشطار الحرة من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان المستحث باستخدام مصفوفة لامينين 521

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

التفريق بين الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية من الخلايا الجذعية Pluripotent المستحث أو الجنينية البشرية سريعة وموجهة

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

التحليل الحسابي ل Germline ايليجانس كاينورهابديتيس دراسة توزيع الأنوية، والبروتينات، وسيتوسكيليتون

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...