We thank Dr. Leonid Gnatovskiy for his carefully and critical reading of the paper. This work was supported in part by grants from the National Institutes of Health (HL109054) and the Samuel and Jean Frankel Cardiovascular Center, University of Michigan (Inaugural Fund) to WZ and from the Leon H Charney Division of Cardiology, New York University School of Medicine to BL.

1. اشتقاق الفأر الجنينية تكلفة النقرة من ماوس المجالس الاقتصادية والاجتماعية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFS) طبقة المغذية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دافئ المتوسطة MEF (10٪ FBS في DMEM) إلى 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الجيلاتين المغلفة لوحات. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من 0.1٪ الجيلاتين في الماء في بئر من لوحة 6 جيدا أو 5 مل في صحن 10 سم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك لوحات أو أطباق في 37 ° C أو درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل. نطمح الجيلاتين قبل استخدامها. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد المشع MEFS بسرعة في حمام مائي 37 ° C، مع الهز لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا برفق إلى 15 مل أو 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. إضافة 5 مل من قبل تحسنت المتوسطة MEF. دوامة الخلايا ببطء وأجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا resuspend في المتوسط ​​MEF وعدد خلايا قابلة للحياة. استخدام وحدات التخزين التالية من MEF المتوسطة: 2 مل لخلايا لكل بئر من لوحة 6 جيدا و10 مل للخلايا من طبق 10 سم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة الخلايا إلى 6 لوحات جيدا أو 10 سم في أطباق 1-2× 10 6 في لوحة / طبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحات MEF / أطباق عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 لا يقل عن 24 ساعة قبل استخدامها. ملاحظة: تجاهل لوحات MEF / أطباق القديمة من أسبوع. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المجالس الاقتصادية والاجتماعية الماوس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة Isl1-لجنة المساواة العرقية. Rosa26YFP / Mef2c-لجنة المساواة العرقية. Rosa26YFP الماوس المجالس الاقتصادية والاجتماعية على MEFS حتى 90٪ متموجة. استخدام ES المتوسطة الخلية تتكون من 410 مل DMEM، 75 مل FBS، 0.1 ملي MEM NEAA، 2 مم L-الجلوتامين، 0.1 ملي البيروفات، و 100 U القلم / بكتيريا، و 0.1 ملم β المركابتويثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الجيلاتين المغلفة 6 لوحات جيدا كما هو موضح في 1.1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح المتوسطة من لوحات وشطف الخلايا مع DPBS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح DPBS وإضافة 0.4 مل 0.25٪ التربسين في بئر واحدة من لوحة 6 جيدا. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 لمدة 5 دقائق. إضافة 1 مل قبل تحسنت المتوسطة ES لوقف رد الفعل التربسين. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الخلايا والخلايا الطرد المركزي في 200 x ج ونضح المتوسطة. Resuspend الخلايا في 1 مل المتوسطة خلية ES وعدد الخلايا. &lt;/ لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> المجالس الاقتصادية والاجتماعية لوحة على لوحات الجيلاتين المغلفة في كثافة 3 × 10 4 / سم 2. احتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 لمدة 2 أيام عندما تصل المجالس الاقتصادية والاجتماعية حوالي 90٪ متموجة. تغيير المتوسطة كل يوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما المجالس الاقتصادية والاجتماعية هي 90٪ متموجة، كرر الخطوات من 1.2.2-1.2.5 تماما لإزالة مغذيات MEF. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حمل حزب الشيوعى الصينى التمايز عن طريق تشكيل EB <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد التمايز المتوسطة على النحو التالي: 36 مل IMDM، 12 مل F12 هام، و2 مم L-الجلوتامين، 0.34 مل BSA (7.5٪)، 0.25 مل N2، 0.5 مل B27، 50 ميكروغرام / مل AA، و 0.45 مم 1-thioglycerol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح المتوسطة من الخلايا وشطف مع DPBS. نضح DPBS وإضافة 0.4 مل 0.25٪ التربسين في بئر واحدة من لوحة 6 جيدا. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل التمايز المتوسطة إلى الكف عن رد فعل وماصة صعودا وهبوطا لتفريق مجموعات الخلايا إلى خلايا واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي المجالس الاقتصادية والاجتماعية في 200 x ج لمدة 5 دقائق وتجاهل المتوسطة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في resuspend 1 × 10 6 &lt;/ سوب&gt; المجالس الاقتصادية والاجتماعية في 1 مل التمايز المتوسطة. عدد الخلايا، والثقافة الخلايا في انخفاض مفرزة طبق بتري في تركيز 1 × 10 5 خلية / مل في التمايز المتوسطة عند 37 درجة مئوية لمدة الأول EB التجميع. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد يومين من تشكيل EB، ونقل EBS من الأطباق إلى 50 مل أنابيب. تدور في 200 x ج لمدة 1 دقيقة. إزالة المتوسطة وشطف EBS مع 10 مل DPBS دون الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح DPBS وإضافة 1 مل 0.25٪ التربسين. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. إضافة 4.5 مل التمايز المتوسطة لوقف التفاعل. الماصة صعودا وهبوطا لفصل EBS إلى خلايا واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 200 x ج لمدة 5 دقائق. خلايا المتوسطة و resuspend نضح في 1 مل التمايز المتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عدد الخلايا، وتمييع 2 × 10 6 خلايا إلى 1 × 10 5 خلية / مل في التمايز المتوسطة. إضافة VEGF، BMP4 وActivin ألف من المتوسط ​​في تركيز النهائي من 5 نانوغرام / مل، 0.8 نانوغرام / مل، و 5 نانوغرام / مل على التوالي. Cultuإعادة الخلايا في طبق بتري لتشكيل EB الثاني عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 40 ساعة بعد تشكيل EB الثاني، ونقل EBS إلى 50 مل أنابيب. شطف مع DPBS مرة واحدة، فصل EBS مع 1 مل 0.25٪ التربسين عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. الماصة صعودا وهبوطا لفصل EBS إلى خلايا واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الخلايا في Stempro-34 متوسطة مع 5 نانوغرام / مل VEGF، 10 نانوغرام / مل bFGF و 12.5 نانوغرام / مل FGF10. لوحة الخلايا في 2 × 10 5 / سم 2 في لوحات الجيلاتين المغلفة. الثقافة في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 32 ساعة قبل CPC العزلة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل mCPCs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح المتوسطة وشطف مع DPBS. إضافة 0.5 مل 0.25٪ التربسين لوحات الثقافة عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. إضافة 4.5 مل التمايز المتوسطة لوقف التفاعل. الماصة صعودا وهبوطا لفصل EBS إلى خلايا واحدة. جمع الخلايا عن طريق خلايا الطرد المركزي و resuspend في 2٪ FBS / PBS لFACS تنقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل المجالس الاقتصادية والاجتماعية غير متمايزة على فارز كما سيطرة سلبية. تغيير الجهد لضبط الموسيقي إلى الأمامثالثا (FSC) والتشرذم الجانب (SSC) لتحديد السكان المطلوب. استخدام الأمام مبعثر مقابل مبعثر الجانب وارتفاع مبعثر الأمام مقابل عرض لاستبعاد الحطام وصدرة. في اختيار من الفئات السكانية الفرعية، وفقا لتوزيع الضوابط ESC، رسم بوابة YFP إيجابية على الرسم البياني للقضاء على تألق ذاتي الخلية. جمع YFP + تكلفة النقرة من YFP + النابضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة لتكلفة النقرة المنقى (خلايا YFP +) في 6 لوحات جيدا مع التمايز المتوسطة (1.3.1). ثقافة 3-5 أيام إضافية عند 37 درجة مئوية لمدة التفريق بين تكلفة النقرة في العضلية وSMCS. </li></ol></li></ol> 2. اشتقاق الإنسان الجنينية تكلفة النقرة من المجالس الاقتصادية والاجتماعية البشرية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مغذيات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFS) طبقة المغذية على النحو المبين أعلاه في كثافة 2 × 10 4 / سم 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على المجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على ISL1 البشري: لجنة المساواة العرقية، pCAG-flox وقفة وflox-GFP أو طلب تقديم العروض المجالس الاقتصادية والاجتماعية بشكل روتيني على MEF باستخدام المتوسطة HESC منتظم (خروج المغلوب DMEM / F-12 385 مل، 100 مل ريال خروج المغلوب، 2 مم L-الجلوتامين، 0.1 ملي NEAA، 0.1 ملم β المركابتويثانول، 10 نانوغرام / مل FGF الأساسي). قبل التمايز القلب، ونقل المجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان في حالة حرة المغذية لا يقل عن 2 الممرات. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان في حالة التغذية المجانية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد لوحات المغلفة للثقافة المجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد matrigel في 4 درجات مئوية خلال الليل. وضع أنبوب 50 مل على الجليد وإضافة 30 مل الباردة DMEM / F12 المتوسط ​​في أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل matrigel في المتوسط ​​البارد وتخلط جيدا. إضافة 1 مل البارد matrigel-DMEM / 12 المتوسطة في بئر من لوحة 6 جيدا أو 5 مل في صحن 10 سم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك لوحات / أطباق في 4 درجات مئوية خلال الليل أو درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. نضح المتوسطة قبل استخدامها. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقسيم المجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان على لوحات: وسائل الإعلام نضح من لوحة MEF وشطف المجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان مع DPBS. ثم يضاف 1 مل dispase (1 ملغ / مل) إلى بئر من لوحة 6 جيدا. احتضان خلايا في 37 ° Cحاضنة حتى حواف المستعمرات بداية لفصل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة حل dispase. شطف مع DPBS مرتين، ثم يضاف 2.5 مل / في المتوسط ​​mTeSR جيدا أو المتوسطة MEF مكيفة إلى اللوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتخلص من الخلايا باستخدام مكشطة الخلية وبعناية الماصة صعودا وهبوطا لكسر المستعمرات ESC الإنسان في كتل صغيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل كتل ESC وتمييع 1: 3 في لوحات المغلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 مل / جيد المتوسطة mTeSR أو المتوسطة MEF مكيفة وتغيير المتوسطة يوميا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة المجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان في mTeSR المتوسطة أو المتوسطة MEF مكيفة على لوحات المغلفة لا يقل عن 2 الممرات. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حمل حزب الشيوعى الصينى التمايز من المجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تكون الخلايا ~ 90٪ متموجة، نضح المتوسطة وشطف مع DPBS. ثم احتضان hESCs في 0.5 ملغ / مل Dispase عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف hESCs مع DPBS مرتين، وإزالة الخلايا من لوحات مع رافع الخلية، resuspend ثم المشابك خلية في التمايز المتوسطة (DMEM / F12 تحتوي على 18٪ FBS، 0.1 ملي NEAA، 2 ممL-الجلوتامين، 0.1 ملم β المركابتويثانول و 50 ميكروغرام / مل حمض الاسكوربيك). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا في 6 جيدا لوحات مرفق منخفضة للغاية لتشكيل EB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير التمايز المتوسطة اليوم التالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال المتوسط ​​كل 3 أيام، والحفاظ على EBS في الثقافة تعليق. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل HCPCS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع EBS في موعد أقصاه يوم 9 من التمايز لعزل حزب الشيوعى الصينى الإنسان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح المتوسطة وشطف EBS مع DPBS مرتين. إضافة 0.5 مل 0.25٪ التربسين إلى كل بئر من لوحات ثقافة 6 جيدا عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حجم مساو من التمايز المتوسطة لوقف التفاعل. الماصة صعودا وهبوطا لفصل EBS إلى خلايا واحدة. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق و resuspend الخلايا في 2٪ FBS / DPBS. تصفية الخلايا مع 40 ميكرومتر مصفاة الخلية وFACS تنقيته-طلب تقديم العروض + خلايا CPC كما وصفها في 1.4.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة فرز HCPCS على لوحات المغلفة geltin. HCPCS الثقافة في التمايز المتوسطة لمدة 7-9 أيام على التمايز إلى خلايا cardiomyocyte والعضلات الملساء. بعد 7 أيام والطلاء، والثقافة الخلايا مع 5٪ خروج المغلوب ريال في DMEM / F12 المتوسطة المتفاوتة. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Garbern, J. C., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+stem+cell+therapy+and+the+promise+of+heart+regeneration.">Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).</li><li>Passier, R., van Laake, L. W., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-cell-based+therapy+and+lessons+from+the+heart.">Stem-cell-based therapy and lessons from the heart.</a> Nature. 453 (7193), 322-329 (2008).</li><li>Bondue, A., Blanpain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesp1:+a+key+regulator+of+cardiovascular+lineage+commitment.">Mesp1: a key regulator of cardiovascular lineage commitment.</a> Circulation Research. 107 (12), 1414-1427 (2010).</li><li>Bondue, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesp1+acts+as+a+master+regulator+of+multipotent+cardiovascular+progenitor+specification.">Mesp1 acts as a master regulator of multipotent cardiovascular progenitor specification.</a> Cell Stem Cell. 3 (1), 69-84 (2008).</li><li>Bu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+ISL1+heart+progenitors+generate+diverse+multipotent+cardiovascular+cell+lineages.">Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages.</a> Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).</li><li>Lei, I., Gao, X., Sham, M. H., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SWI/SNF+protein+component+BAF250a+regulates+cardiac+progenitor+cell+differentiation+by+modulating+chromatin+accessibility+during+second+heart+field+development.">SWI/SNF protein component BAF250a regulates cardiac progenitor cell differentiation by modulating chromatin accessibility during second heart field development.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287 (29), 24255-24262 (2012).</li><li>Lei, I., Liu, L., Sham, M. H., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SWI/SNF+in+cardiac+progenitor+cell+differentiation.">SWI/SNF in cardiac progenitor cell differentiation.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 114 (11), 2437-2445 (2013).</li><li>Wu, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+origin+of+a+bipotential+myocardial+and+smooth+muscle+cell+precursor+in+the+mammalian+heart.">Developmental origin of a bipotential myocardial and smooth muscle cell precursor in the mammalian heart.</a> Cell. 127 (6), 1137-1150 (2006).</li><li>Spater, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+HCN4++cardiomyogenic+progenitor+derived+from+the+first+heart+field+and+human+pluripotent+stem+cells.">A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).</li><li>Verzi, M. P., McCulley, D. J., De Val, S., Dodou, E., Black, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+right+ventricle,+outflow+tract,+and+ventricular+septum+comprise+a+restricted+expression+domain+within+the+secondary/anterior+heart+field.">The right ventricle, outflow tract, and ventricular septum comprise a restricted expression domain within the secondary/anterior heart field.</a> Developmental Biology. 287 (1), 134-145 (2005).</li><li>Boheler, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+into+cardiomyocytes.">Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 91 (3), 189-201 (2002).</li><li>Wada, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+human+cardiomyocyte-like+cells+from+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of human cardiomyocyte-like cells from fibroblasts by defined factors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12667-12672 (2013).</li><li>Kattman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+optimization+of+activin/nodal+and+BMP+signaling+promotes+cardiac+differentiation+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell+lines.">Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines.</a> Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).</li><li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid+enhances+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+cardiac+myocytes.">Ascorbic acid enhances differentiation of embryonic stem cells into cardiac myocytes.</a> Circulation. 107 (14), 1912-1916 (2003).</li><li>Wamstad, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+coordinated+epigenetic+regulation+of+developmental+transitions+in+the+cardiac+lineage.">Dynamic and coordinated epigenetic regulation of developmental transitions in the cardiac lineage.</a> Cell. 151 (1), 206-220 (2012).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+efficiency+of+human+pluripotent+stem+cell+genome+editing+through+replacing+TALENs+with+CRISPRs.">Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs.</a> Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).</li><li>Gaj, T., Gersbach, C. S., Barbas, T. A. L. E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZFN,+TALEN,+CRISPR/Cas-based+methods+for+genome+engineering.">ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).</li><li>Joung, J. K., Sander, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TALENs:+a+widely+applicable+technology+for+targeted+genome+editing.">TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Laflamme, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells+in+pro-survival+factors+enhance+function+of+infarcted+rat+hearts.">Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts.</a> Nature. biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+system+for+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+that+eliminates+interline+variability.">A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability.</a> PloS One. 6 (4), e18293 (2011).</li><li>Kouskoff, V., Lacaud, G., Schwantz, S., Fehling, H. J., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+development+of+hematopoietic+and+cardiac+mesoderm+during+embryonic+stem+cell+differentiation.">Sequential development of hematopoietic and cardiac mesoderm during embryonic stem cell differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (37), 13170-13175 (2005).</li><li>Xu, X. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+medium+supporting+cardiomyocyte+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">Chemically defined medium supporting cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells.</a> Differentiation: Research in Biological Diversity. 76 (9), 958-970 (2008).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling.">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-1857 (2012).</li><li>Bizy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+light+chain+2-based+selection+of+human+iPSC-derived+early+ventricular+cardiac+myocytes.">Myosin light chain 2-based selection of human iPSC-derived early ventricular cardiac myocytes.</a> Stem Cell Research. 11 (3), 1335-1347 (2013).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

This protocol combines a method using growth factors to guide mESCs differentiation and spontaneous differentiation of human ESCs into CPCs. CPC lineage marked with fluorescent reporter is used to efficiently identify and isolate CPCs by FACS. The FACS-purified CPCs retain the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle, and endothelial cells and have a comparable expression profile to the in vivo cells. Thus, these CPCs can serve as a great resource for cell based heart therapy because of their ability ...

A correction to the author list was made to: <a href="http://www.jove.com/video/52047/derivation-of-cardiac-progenitor-cells-from-embryonic-stem-cells">Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells</a>.
The following author is now listed as a co-corresponding author:
Lei Bu

A correction to the author list was made to: Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells.

Erratum: Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

لا تزال أمراض القلب السبب الرئيسي في العالم اليوم، وظلت معدلات الوفاة دون تغيير تقريبا في العقدين الماضيين (جمعية القلب الأمريكية). وهناك حاجة ماسة لوضع استراتيجيات علاجية جديدة لمنع بشكل فعال أو عكس فشل القلب. واحد استراتيجية واعدة هي العلاج القائم على الخلايا بعد التطور السريع للخلايا الجذعية علم الأحياء 1. وفي هذا الصدد، يمكن أن تكلفة النقرة متعددة القدرات تكون مصدرا ممتازا للخلية العلاج نظرا لقدرتها على التكاثر ولكن ملتزمة فقط إلى القلب النسب التمايز. لذلك، طريقة فعالة وقوية لتوليد وعزل تكلفة النقرة هو من أهمية كبيرة للدراسات العلاج بالخلايا القلب. يركز هذا البروتوكول على تكلفة النقرة الجنينية التي تم تحديدها خلال مرحلة التطور الجنيني المبكر وكيفية توليدها من المجالس الاقتصادية والاجتماعية. تم عزلها تكلفة النقرة مختلفة من قلوب الجنينية والكبار، حتى من الكوسا العظام 2. أثناء تطور الجنين، morphoge العظامالبروتينات المغنطيسية (أفضل الممارسات الإدارية)، من نوع مجنح أفراد الأسرة الموقع التكامل MMTV (Wnts) وإشارات العقدية لحث التزام Mesp1 + الأديم المتوسط ​​متعددة القدرات 3. Mesp1 + خلايا ثم تفرق في تكلفة النقرة الجنينية 4. وعادة ما يتم وضع علامة هذه تكلفة النقرة التي كتبها HCN4، NK2 علبة مثلية 5 (Nkx2-5)، Isl لLIM علبة مثلية 1 (Isl1)، T-مربع 5 (Tbx5)، والعضلية عامل محسن 2C (Mef2c)، تشكل الحقول القلب الابتدائية والثانية، و المساهمة في أجزاء كبيرة من القلب أثناء تخلق القلب 5-10. كلا Nkx2-5 + وIsl1 + / Mef2c + تكلفة النقرة قادرة على التمايز إلى العضلية، والخلايا العضلات الملساء (SMCS)، والخلايا البطانية 5-8. وبالتالي هذه تكلفة النقرة سوف تؤدي إلى الأوعية الدموية في القلب وكذلك أنسجة القلب وهم مصدر خلية مثالية لعلاج القلب خلية القاعدة. ونتيجة لذلك، كان توليد تكلفة النقرة في المختبر وتركيز البحث رئيسيا في الدراسات القلب والأوعية الدموية. منذ المجالس الاقتصادية والاجتماعية لها التوسع غير المحدود قدرةالثانية تمثل الخلايا ICM في مرحلة الكيسة الأريمية، ويعتبر التفريق بين المجالس الاقتصادية والاجتماعية في تكلفة النقرة الجنينية بعد مرحلة التطور الجنيني الطبيعي نهج منطقي وفعال للحصول على تكلفة النقرة. نهج واحد التطبيقية على نطاق واسع للحصول على تكلفة النقرة من المجالس الاقتصادية والاجتماعية هو تجميع المجالس الاقتصادية والاجتماعية في EBS 11. لتحسين كفاءة التفريق، وقد استخدمت العوامل الكيميائية ونمو محددة على أساس المعرفة للتنمية القلب 12-14. ومع ذلك، لا توجد علامات جنة البرنامج والتنسيق نهائية، لا سيما لا علامات على سطح الخلية، والتي تحظى بقبول واسع في هذا المجال. لمعالجة هذه المسألة، صممت المجالس الاقتصادية والاجتماعية للاحتفال Isl1 + أو Mef2c + تكلفة النقرة ومشتقاتها مع الصحفيين الفلورسنت باستخدام نظام لجنة المساواة العرقية / loxP. وطرقت recombinase لجنة المساواة العرقية في تحت سيطرة Isl1 / Mef2c المروج / محسن. تعديل RFP بروتين فلوري أو YFP الجين يقودها المروج التأسيسي يمكن تفعيلها من خلال استئصال توقف flox كودون مع لجنة المساواة العرقية recombinase(ISL1: لجنة المساواة العرقية، pCAG-flox وقفة وflox-GFP أو طلب تقديم العروض / Isl1-لجنة المساواة العرقية، Rosa26YFP / Mef2c-لجنة المساواة العرقية، Rosa26YFP) 5،6. وحالما يتم التفريق بين المجالس الاقتصادية والاجتماعية في تكلفة النقرة الحقل القلب الثانية، سوف Isl1 / Mef2c المروج / محسن لجنة المساواة العرقية مدفوعة تفعيل صحفيين الفلورسنت وتكلفة النقرة يمكن تغنى FACS تنقية. لفترة وجيزة، يتم استخدام EB طريقة التجميع لبدء ESC التمايز. لتعزيز كفاءة التمايز، ويتم التعامل مع الخلايا المتمايزة مع حمض الاسكوربيك (AA) وعوامل النمو مثل BMP4، Activin ألف وVEGF 13،15. هذا البروتوكول يسمح قوية وذات كفاءة التفريق CPC باستخدام كل من الفأر والمجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="415">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Name</td>
			<td style="width:156px;">Company</td>
			<td style="width:131px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Thermo scentific</td>
			<td>SH30070.03E</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Knockout SR</td>
			<td>Life technology</td>
			<td align="right">10828028</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Knockout DMEM</td>
			<td>Life technology</td>
			<td align="right">10829018</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Life technology</td>
			<td align="right">11965118</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NEAA</td>
			<td>Life technology</td>
			<td align="right">11140050</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX</td>
			<td>Life technology</td>
			<td align="right">35050061</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2</td>
			<td>Life technology</td>
			<td align="right">17502048</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27</td>
			<td>Life technology</td>
			<td align="right">12587010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Life technology</td>
			<td align="right">11765062</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IMDM</td>
			<td>Life technology</td>
			<td align="right">12440061</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen/Strep</td>
			<td>Life technology</td>
			<td align="right">15140122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pyruvate</td>
			<td>Life technology</td>
			<td align="right">11360070</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dispase</td>
			<td>Life technology</td>
			<td align="right">17105041</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stempro-34</td>
			<td>Life technology</td>
			<td align="right">10639011</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12</td>
			<td>Life technology</td>
			<td align="right">11330032</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA&#160;</td>
			<td>Life technology</td>
			<td align="right">15260037</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin&#160;</td>
			<td>Life technology</td>
			<td align="right">25200056</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ascobic Acid&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5960</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-Thioglycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1753</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VEGF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>293-VE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bmp4</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>314-BP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ActivinA</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>338-AC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">bFgf</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>233-FB</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fgf10</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>345-FG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mTeSR</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td align="right">5850</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td align="right">354277</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivation of cardiac progenitor cells from embryonic stem cells

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.

ويبين بروتوكول اشتقاق تكلفة النقرة من عدة خطوط الخلايا ES. يتم تجميع المجالس الاقتصادية والاجتماعية لتشكيل EBS على التمايز إلى تكلفة النقرة. يتم الاحتفاظ المجالس الاقتصادية والاجتماعية بشكل روتيني على مغذيات MEF (الشكل 1A، F) وتتم إزالة مغذيات قبل التمايز. على ت?...

Watch this Scientific Journal Video about Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.

اشتقاق خلايا القلب السلف من الخلايا الجذعية الجنينية

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

derivation-of-cardiac-progenitor-cells-from-embryonic-stem-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.0K Views.  University of Michigan. In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.

Video: Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

No cure has been discovered for age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex multifactorial disease with an unknown etiology, although it is largely thought to occur due to death or dysfunction of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells that underlies the retina and provides critical support for photoreceptors. RPE cell replacement strategies may hold great promise for providing therapeutic relief for a large subset of AMD patients, and RPE cells that strongly resemble primary human cells (hRPE) have been generated in multiple independent labs, including our own. In addition, the uses for iPS-RPE are not limited to cell-based therapies, but also have been used to model RPE diseases. These types of studies may not only elucidate the molecular bases of the diseases, but also serve as invaluable tools for developing and testing novel drugs. We present here an optimized protocol for directed differentiation of RPE from stem cells. Adding nicotinamide and either Activin A or IDE-1, a small molecule that mimics its effects, at specific time points, greatly enhances the yield of RPE cells. Using this technique we can derive large numbers of low passage RPE in as early as three months.

Stem cell-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells may be used for multiple applications including cell-based therapies for retinal degeneration, disease modeling, and drug studies. Here we present a simple protocol for reproducibly deriving RPE from stem cells.

اشتقاق كفاءة خلايا الظهارة الصبغية الشبكية من الخلايا الجذعية

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to primary human adult neural cultures raises unique challenges. Recent developments in induced pluripotent stem cells (iPSC) provides an alternative approach to derive neural cultures from skin fibroblasts through patient specific iPSC, but this process is labor intensive, requires special expertise and large amounts of resources, and can take several months. This prevents the wide application of this technology to the study of neurological diseases. To overcome some of these issues, we have developed a method to derive neural stem cells directly from human adult peripheral blood, bypassing the iPSC derivation process. Hematopoietic progenitor cells enriched from human adult peripheral blood were cultured in vitro and transfected with Sendai virus vectors containing transcriptional factors Sox2, Oct3/4, Klf4, and c-Myc. The transfection results in morphological changes in the cells which are further selected by using human neural progenitor medium containing basic fibroblast growth factor (bFGF) and vascular endothelial growth factor (VEGF). The resulting cells are characterized by the expression for neural stem cell markers, such as nestin and SOX2. These neural stem cells could be further differentiated to neurons, astroglia and oligodendrocytes in specified differentiation media. Using easily accessible human peripheral blood samples, this method could be used to derive neural stem cells for further differentiation to neural cells for in vitro modeling of neurological disorders and may advance studies related to the pathogenesis and treatment of those diseases.

A method was developed to directly derive human neural stem cells from hematopoietic progenitor cells enriched from peripheral blood cells.

الحث المباشر من العصبية الإنسان الخلايا الجذعية من خلايا الدم المحيطي المكونة للدم السلف

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.

This work describes an in vitro differentiation protocol to produce pigmented, mature melanocytes from human pluripotent stem cells via a neural crest and melanoblast intermediate stage using a feeder-free, 25 day protocol.

اشتقاق خالية المغذية من الخلايا الصباغية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated by transcription factors which bind genomic regulatory regions including enhancers and promoters of cardiac constitutive genes. DNA is wrapped around histones that are subjected to chemical modifications. Modifications of histones further lead to repressed, activated or poised gene transcription, thus bringing another level of fine tuning regulation of gene transcription. Embryonic Stem cells (ES cells) recapitulate within embryoid bodies (i.e., cell aggregates) or in 2D culture the early steps of cardiac development. They provide in principle enough material for chromatin immunoprecipitation (ChIP), a technology broadly used to identify gene regulatory regions. Furthermore, human ES cells represent a human cell model of cardiogenesis. At later stages of development, mouse embryonic tissues allow for investigating specific epigenetic landscapes required for determination of cell identity. Herein, we describe protocols of ChIP, sequential ChIP followed by PCR or ChIP-sequencing using ES cells, embryoid bodies and cardiac specific embryonic regions. These protocols allow to investigating the epigenetic regulation of cardiac gene transcription.

A fine tuning regulation of gene transcription underlies embryonic cell fate decision. Herein, we describe chromatin immunoprecipitation assays used to investigate epigenetic regulation of both cardiac differentiation of stem cells and cardiac development of mouse embryos.

تنظيم جينية من القلب تمايز الخلايا الجذعية الجنينية والأنسجة

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

إنتاج الخلايا الجذعية المحفزة من الفأر الأمنيوسي الخلايا السوائل عن طريق نظام ينقول

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality microscopic images is not entirely dependent upon the quality of the microscope, but also upon the methods of tissue processing, which often involve multiple critical actions or steps. Furthermore, mesenchymal cell types in the skin and other tissues represent a new challenge for tissue preparation and imaging. Here, we present a complete process, from tissue harvest to microscopy. Our technique, called &#34;horizontal whole mount,&#34; is one that novices can quickly become proficient in and that allows for antigen preservation and detection in 60-300 &#181;m-thick sections cut with a cryostat. Sections of this thickness provide enhanced visualization of tissue microarchitecture in a three-dimensional environment. In addition, the protocol preserves mesenchymal cells in a manner that enhances image quality when compared to standard cryostat or paraffin sections, thereby increasing the efficacy and reliability of immunostaining. We believe that this protocol will benefit all laboratories that visualize skin, and possibly other tissues and organs.

This work presents a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-section analysis that enables the full exploitation of confocal imaging modalities. This protocol preserves antigenicity and represents a robust system to analyze skin histology and potentially other tissue types.

أفقي جبل كامل: A معالجة الرواية والتصوير بروتوكول للثدي، ثلاثة-- الأبعاد الأنسجة عبر-- أقسام الجلد

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

التفريق بين الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية من الخلايا الجذعية Pluripotent المستحث أو الجنينية البشرية سريعة وموجهة

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

فوتوكونفيرسيون خلية واحدة في معيشة سليمة الزرد

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

التحليل الحسابي ل Germline ايليجانس كاينورهابديتيس دراسة توزيع الأنوية، والبروتينات، وسيتوسكيليتون

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies have demonstrated the wide differentiation capacity that these cells possess. The ovary represents a promising candidate for cell-based therapies due to the fact that it is rich in MSCs and that it is frequently discarded after ovariectomy surgeries as biological waste. This article describes procedures for the isolation, expansion, and differentiation of MSCs derived from the canine ovary, without the necessity of cell-sorting techniques. This protocol represents an important tool for regenerative medicine because of the broad applicability of these highly differentiable cells in clinical trials and therapeutic uses.

Herein, we describe a method for the isolation, expansion, and differentiation of mesenchymal stem cells from canine ovarian tissue.

الاشتقاق وتمايز الخلايا الجذعية الوسيطة المبيض الكلاب

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies ...