저자는 친절 하 게 제공 하는 난소 UNESP FCAV의 개 살 균 프로그램을 인정 합니다. 이 작품은 FAPESP (프로세스 번호 2013/14293-0)와 망 토에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

이 실험은 4 개의 잡종 여성 개 개 살 균 프로그램에 선택 수술 후 기증의 난소와 함께 수행 되었다. 이 실험은 UNESP-FCAV (프로토콜 번호 026991/13)의 동물의 사용에 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.
1. 실험 준비
<ol><li>준비 하거나 메 마른 Dulbecco 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS) 칼슘 또는 마그네슘의 500 mL를 구매 합니다.</li>
	<li>준비는 콜라 나 DPBS의 1 mL에 효소의 40 µ g을 혼합 하 여 솔루션을 재고. 0.2 µ m 주사기 필터를 사용 하 여 필터링 하 고 저장 2 mL aliquots-20 ° c.에</li>
	<li>항생제의 1%와 10% 태아 혈 청 Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM) 낮은 혈당에서 배양을 준비 합니다.</li>
	<li>살 균 자료 수집:가 위, 집게, 조직 배양 플라스 크, 요리, 튜브, 그리고 5 mL와 10 mL 펫.</li>
	<li>표준 셀 문화 실험실 장비를 사용 하 여: 생물 안전 캐비닛 (BSC), 5% CO2 와 38 ° C 원심 분리기에서 설정 셀 문화 인큐베이터.</li>
	<li>BSC를 청소: 70% 소독 장갑 낀 손으로 EtOH, UV 빛을 사용 하 여.</li>
</ol>2. 난소에서 중간 엽 줄기 세포의 분리
<ol><li>수술 후, 실험실에서 그들의 도착까지 난소 원뿔 튜브에 얼음에 PBS에 계속.</li>
	<li>PBS의 10 mL로 두 100 mm 페 트리 접시를 채우십시오.</li>
	<li>튜브에서 난소를 제거 하 고 PBS 가진 첫 번째 페 트리 접시에 그들을 전송. 움직임을 혼합 함께 그들을 씻어.</li>
	<li>부드럽게 난소를 검색 하 고 다른 접시에 놓습니다. 멸 균 핀셋과가 위, 아주 작은 조각, 약 1 m m 크기에서에 조직을 말하다.</li>
	<li>난소 조직 35 mm 페 트리 접시에 전송 하 고 콜라의 2 개 mL를 추가. 좀 더 조직을 말하다.</li>
	<li>3 h는 38 ° C에 인큐베이터에서 배양 접시를 놓고 부드럽게 원형 움직임 마다 20 분 페 트리 접시를 흔들.</li>
	<li>3 h 후 인큐베이터에서 배양 접시를 제거 합니다.</li>
	<li>15 mL 튜브에 접시의 내용을 전송 합니다. 확장 미디어의 5 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>부드럽게 원심 분리 전에 튜브 반전. 원심에서 2100 x g 7 분 제거 튜브는 상쾌한 고 확장 미디어의 3 mL와 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>T25 병에 펠 릿을 전송 합니다. 5%와 인큐베이터에 병을 배치 3 h 38 ° C에서 CO2 . 참고: 프로시저의 가장 중요 한 부분은 외피의 3 h 후 미디어를 변경 하는.</li>
	<li>인큐베이터에서 병을 제거 하 고 나머지 조직으로 미디어를 제거 합니다. 병에 신선한 확장 미디어의 3 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>미디어 모든 48 h 변경 하 고 관찰 셀룰러 합류에 대 한 병. 참고: 절차의 주요 단계는 그림 1에서 볼 수 있습니다.</li>
</ol>3. 난소에서 중간 엽 줄기 세포의 확장
<ol><li>
셀 통로
	<ol>
<li>셀 합류에 도달, 병에서 미디어를 제거 합니다.</li>
		<li>PBS의 3 mL 병을 씻어. PBS를 제거 합니다.</li>
		<li>트립 신 고 3 분에 38 ° C에 인큐베이터에서 병 부드럽게 탭 분리를 셀 수 있도록 병의 1.5 mL를 추가 합니다. 참고: 셀 합류 약 5-7 d 초기 도금 후에 도달 한다.</li>
		<li>확장 미디어의 3 mL를 추가 하 고 내용을 원뿔 튜브에 전송.</li>
		<li>원심에서 2100 x g 7 분 제거 튜브는 상쾌한 고 확장 미디어의 1 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>부드럽게 튜브의 내용을 균질.</li>
		<li>세 고 인큐베이터에 다시 세포와 함께 튜브를 넣어 셀을 수행 하기 위해 샘플의 10 µ L의 약 수를 가져가 라.</li>
		<li>hemocytometer로 믹스의 장소 10 µ L.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
셀 계산
	<ol>
<li>현미경의 10 X 목표를 사용 하 고는 hemocytometer의 눈금선에 초점.</li>
		<li>5 개의 작은 사각형 (그림 2)에 있는 셀을 계산 합니다.</li>
		<li>50, 000 밀리 리터 당 셀의 수를 추정 하 여 계산된 수를 곱하면.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 난소에서 중간 엽 줄기 세포의 분화
참고: 차별화 분석 힐 외 에 설치 하는 지침에 따라 수행 했다 9.
<ol><li>잘, 3 중, 4 잘 문화 접시를 사용 하 여 당 씨 1.0 x 104 셀.</li>
	<li>확장 미디어의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>부드럽게 원형 움직임으로 접시를 교 반 하십시오.</li>
	<li>24 시간 후 문화 미디어를 바람직한 차별화 미디어 바꿉니다.</li>
	<li>대 한 osteogenic, adipogenic, 및 chondrogenic 분화, 품 어 30 d 유도 미디어 셀, 미디어 교체와 함께 모든 3 디 특정 차별화 키트가 분석이 실험의 각을 위해 사용 되었다.</li>
	<li>Neurogenic 혈통 차별화 유도 미디어 미디어 교체 매 3 d와 함께 10 일에 대 한 셀을 품 어. 여기에서 사용 하는 미디어 DMEM 낮은 포도 당, 2 mM valproic 산, 1 µ M 날린, 10 µ M 산림, 염화 칼륨 5 m m, 5 µ g/mL 인슐린, 그리고 200 µ M 자 hydroxyanisole 포함 되어 있습니다.</li>
	<li>Endoderm 선구자, 5 d 시 약 제조업체의 지침에 따라 endoderm 미디어에서 품 어.</li>
	<li>원시 생식 세포 계보 차별화 유도 미디어 미디어 교체 매 3 d와 14 d 셀을 품 어. 여기에서 사용 하는 미디어 포함 된 DMEM, 10 %FBS, 1mm 나트륨 pyruvate, 10 ng/mL LIF, 1mm 불필요 한 아미노산, 2 m L-글루타민 m, 5 µ g/mL 인슐린, 0.1 m m β-mercaptoethanol, 60 µ M putrescine, 20 µ g/mL 올려진다, 10 ng/mL 마우스 표 피 성장 인자, 인간의 1 ng/mL 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자, 40 ng/mL 인 glial 세포 선 파생 된 neurotrophic 요인, 및 15 mg/L 페니실린.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gazit, Z., Pelled, G., Sheyn, D., Kimelman, N., Gazit, D., Atala, A., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells.">Mesenchymal stem cells.</a> Handbook of Stem Cells (2nd Edition). , 513-527 (2013).</li><li>Zipori, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nature+of+stem+cells:+state+rather+than+entity.">The nature of stem cells: state rather than entity.</a> Nature Reviews Genetics. 5 (11), 873-878 (2004).</li><li>Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+surface+epithelium:+biology,+endocrinology,+and+pathology.">Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology.</a> Endocrine Reviews. 22 (2), 255-288 (2001).</li><li>Ahmed, N., Thompson, E. W., Quinn, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+interconversions+in+normal+ovarian+surface+epithelium+and+ovarian+carcinomas:+an+exception+to+the+norm.">Epithelial-mesenchymal interconversions in normal ovarian surface epithelium and ovarian carcinomas: an exception to the norm.</a> Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 581-588 (2007).</li><li>Bukovsky, A., Svetlikova, M., Caudle, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oogenesis+in+cultures+derived+from+adult+human+ovaries.">Oogenesis in cultures derived from adult human ovaries.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 3 (1), 17 (2005).</li><li>Gong, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell-like+cells+established+by+culture+of+adult+ovarian+cells+in+mice.">Embryonic stem cell-like cells established by culture of adult ovarian cells in mice.</a> Fertility and Sterility. 93 (8), 2594-2601 (2010).</li><li>Johnson, J., Canning, J., Kaneko, T., Pru, J. K., Tilly, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+stem+cells+and+follicular+renewal+in+the+postnatal+mammalian+ovary.">Germline stem cells and follicular renewal in the postnatal mammalian ovary.</a> Nature. 428 (6979), 145 (2004).</li><li>Deans, R. J., Moseley, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells:+biology+and+potential+clinical+uses.">Mesenchymal stem cells: biology and potential clinical uses.</a> Experimental Hematology. 28 (8), 875-884 (2000).</li><li>Trinda Hill, A. B. T., Therrien, J., Garcia, J. M., Smith, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal-like+stem+cells+in+canine+ovary+show+high+differentiation+potential.">Mesenchymal-like stem cells in canine ovary show high differentiation potential.</a> Cell Proliferation. 50 (6), 12391 (2017).</li><li>Dominici, M. L. B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement.">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8, 4315-4317 (2006).</li><li>Friedenstein, A. J., Piatetzky-Shapiro, I. I., Petrakova, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenesis+in+transplants+of+bone+marrow+cells.">Osteogenesis in transplants of bone marrow cells.</a> Development. 16 (3), 381-390 (1966).</li><li>Kuznetsov, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-colony+derived+strains+of+human+marrow+stromal+fibroblasts+form+bone+after+transplantation+in+vivo.">Single-colony derived strains of human marrow stromal fibroblasts form bone after transplantation in vivo.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 12 (9), 1335-1347 (1997).</li></ol>

저자는 공개 없다.

여기 증거 MSCs ovariectomy 후 생물 학적 폐기물 이라고 여겨진다 개 난소 조직 으로부터 격리 될 수 있습니다 제공 합니다. 사실은 많은 세포 유형 난소에서 찾을 수 있습니다, 우리 구와 같은 형태와 단층에서 성장 하는 셀을 성공적으로 선택, 플라스틱에 그들의 급속 한 준수에 따라 MSCs를 선택 하는 프로토콜을 제안 했다.
골 수에서 MSCs의 파생의 첫 번째 보고서는 문화<sup class="...

줄기 세포에 초점 년간 과거, 강력한 재생 의학 치료 발견의 집단 목표에 의해 연료 되었습니다 연구 노력을 실질적으로 증가 했다 출판된 연구의 수입니다. 줄기 세포는 두 개의 기본 정의 마커: 자기 혁신과 차별화. 중간 엽 줄기 세포 정기 조직 회전율에 대 한 책임은 고1배아 줄기 세포 비해 분화의 보다 제한 된 용량을가지고. 최근에, 많은 연구 다양 한 MSCs의 그리고 논의 중인 주제는 배아 및 성체 줄기 세포 간의 차이점 모든2에 존재 하는 여부.
Ovarium 표면 상피는 커밋되지 않은 세포의 층, 상대적으로 덜 분화, 두 상피와 중간 엽 마커3, 유지 하는 다른 종류의 세포에 대 한 응답에서으로 분화 하는 능력을 표현 하는 환경 신호4. 줄기 세포는 난소에서의 정확한 위치는 잘 알려진; 그러나, 그것은 bipotential 창시자 tunica albuginea에서 생식 세포5일으키 제안 되었습니다. 이러한 셀 stromal 기원6 또는에 있는 또는 난소 표면7에 인접 면역학 연구 가설 있다. 이후 중간 엽 줄기 세포 세포 접착8에 중요 한 역할을 재생 하는 수많은 수용 체를 표현, 실험 가설을 급속 한 접착을 가진 세포의 인구를 선택 하면 명확 하 게 세포의 인구를 분리 하는 것을 테스트 하도록 설계 되었습니다. 실제로 엽으로 characterizable. 최근, 우리의 그룹 문화의 첫 번째 3 h 문화 접시의 플라스틱 표면에 접착의 급속 한 접착9전시 세포의 순화 된 인구를 얻기 위하여 그들의 용량에 따라 난소 조직에서 MSCs의 파생을 했다. 여기는 난소 조직 으로부터 간 엽 줄기 세포 분리를 위한 개발된 방법에 설명합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:665px;" width="666">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">DPBS&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">14190144</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Collagenase I</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">17100017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Tissue flask</td>
			<td style="width:151px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">CLS3056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">DMEM low glucose</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">11054020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">FBS</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">12484-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">TrypLE express</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">12604021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">StemPro Adipogenesis Differentiation Kit</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">A1007001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">A1007101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">StemPro Osteogenesis Differentiation Kit</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">A1007201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">STEMdiff Definitive Endoderm Kit</td>
			<td style="width:151px;">StemCell</td>
			<td style="width:123px;">5110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">CD45</td>
			<td style="width:151px;">AbD Serotec</td>
			<td style="width:123px;">MCA 2035S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">CD34</td>
			<td style="width:151px;">AbD Serotec</td>
			<td style="width:123px;">MCA 2411GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">CD90</td>
			<td style="width:151px;">AbD Serotec</td>
			<td style="width:123px;">MCA 1036G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">CD44</td>
			<td style="width:151px;">AbD Serotec</td>
			<td style="width:123px;">MCA 1041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Nestin</td>
			<td style="width:151px;">Milipore</td>
			<td style="width:123px;">MAB353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">&#946;-Tubulin&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Milipore</td>
			<td style="width:123px;">MAB1637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">DDX4</td>
			<td style="width:151px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">PA5 -23378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">IgG- FITC</td>
			<td style="width:151px;">AbD Serotec</td>
			<td style="width:123px;">STAR80F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">IgG- FITC</td>
			<td style="width:151px;">AbD Serotec</td>
			<td style="width:123px;">STAR120F</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivation and differentiation of canine ovarian mesenchymal stem cells

중간 엽 줄기 세포 (MSCs)에 대 한 관심은 절연, 확장, 및 문화의 그들의 용이성으로 인해 지난 10 년간 증가 했다. 최근에, 연구는 이러한 세포 넓은 차별화 용량을 증명 하고있다. MSCs에서 풍부 하 고 생물학 낭비로 ovariectomy 수술 후 자주 취소 됩니다는 사실 때문 난소 세포 기반 치료를 위한 유망한 후보자를 나타냅니다. 이 문서에서는 격리, 확장에 대 한 절차를 설명 합니다 및 MSCs의 세포 분류의 필요성 없이 개 난소에서 파생 된 기술. 이 프로토콜은 임상 시험에서이 매우 구별할 세포의 광범위 한 적용으로 인해 재생 의학에 대 한 중요 한 도구 나타내고 치료 사용.

송곳 니 난소에서 중간 엽 줄기 세포 분리:
난소 MSC 격리 절차는 그림 1에 요약 됩니다. 수술, 조직 닦지, 콜라 소화, 그리고 미디어 변화는 문화의 시작 후 3 h, 후 빠른 플라스틱 접착제 속성 상 상속 MSC 인구는 성공적으로 개 난소 조직 으로부터 격리. 빠르게 수확된 셀 문화 접시?...

Watch this Scientific Journal Video about Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells

여기, 우리가 격리, 확장, 및 개 난소 조직 으로부터 간 엽 줄기 세포의 분화 하는 방법을 설명합니다.

파생 및 개 난소 중간 엽 줄기 세포의 분화

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies ...

이 절차의 전반적인 목표는 개 난소 조직에서 파생 된 중간 엽 줄기를 분리, 확장 및 차별화하는 것입니다. 이 실험은 개 살균 프로그램에서 선택 수술 후 기증 된 4 개의 mongrel 암컷 개난소와 함께 수행되었습니다. 이 실험은 상파울루 주립 대학, FVAC의 동물의 사용에 윤리위원회에 의해 승인되었다.대표적인 결과. 토론.결론.

derivation-differentiation-canine-ovarian-mesenchymal-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

5.6K 조회수.  São Paulo State University (UNESP). 이 절차의 전반적인 목표는 개 난소 조직에서 파생 된 중간 엽 줄기를 분리, 확장 및 차별화하는 것입니다. 이 실험은 개 살균 프로그램에서 선택 수술 후 기증 된 4 개의 mongrel 암컷 개난소와 함께 수행되었습니다. 이 실험은 상파울루 주립 대학, FVAC의 동물의 사용에 윤리위원회에 의해 승인되었다.대표적인 결과. 토론.결론.