يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات علاجات السرطان ، مثل تحديد الجينات الرئيسية المشاركة في الاعتماد على الـ oncogene. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه يستخدم الاعتماد على الولكوجين التي هي مشتركة لكثير من أنواع السرطان التي يحركها كيناز ولذلك فإنه ينطبق على أنواع متعددة من الأورام. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في سرطان الدم، ويمكن أيضا أن تطبق على أنظمة أخرى، مثل الأورام الصلبة مثل سرطان الرئة، وأورام الدماغ، وأورام البنكرياس.
عموما، سوف الأفراد جديدة لهذه الطريقة النضال بسبب نقص الخبرة في علم الأحياء الجزيئية وعلم وظائف الأعضاء الخلوية. للبدء، حصاد عظام الساق من فأر القتل الرحيم. تنظيف الأنسجة من العظام مع مشرط.
ثم ضع العظام في PBS الباردة على الجليد وسحق العظام مع الحشرات. بعد هذا، تصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية ميكرومتر 70 في أنبوب قبعة المسمار 50 ملليلتر مع ماصة 10 ملليلتر. غسل هاون وحشرات عدة مرات مع برنامج تلفزيوني الباردة وإضافة تعليق الخلية إلى أنبوب 50 ملليلتر.
المقبل الطرد المركزي نخاع العظام وإزالة عظمى مع فراغ وماصة زجاجية. Resuspend بيليه الخلية في 5 ملليلتر من برنامج تلفزيوني. باستخدام ماصة، ببطء إضافة نخاع العظام المعلقة إلى الجزء العلوي من درجة حرارة الغرفة بولي السكروز.
بعد ذلك، تدور بولي السكروز في 400 GS لمدة 20 دقيقة مع الفرامل إيقاف. بعد الطرد المركزي، وجمع واجهة خلية أحادية النووية مجموع غائم مع ماصة ونقلها إلى أنبوب جديد 15 ملليلتر. جلب وحدة التخزين إلى 10 ملليلتر مع برنامج تلفزيوني وإزالة 20 ميكرولترات للعد.
بعد الطرد المركزي، والتخلص من عظمى ووضع بيليه على الجليد. المقبل ، resuspend بيليه الخلية في برنامج تلفزيوني مع EDTA وBSA. أضف ميكروبات CD117 إلى تعليق الخلية، ودوامة للمزج.
بعد هذا، احتضان تعليق لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. ثم جلب حجم يصل إلى 10 ملليلتر مع برنامج تلفزيوني أكثر مع EDTA وBSA والطرد المركزي في 1200 G في 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. استخدام فراغ لإزالة عظمى وتعليق بيليه الخلية في برنامج تلفزيوني مع EDTA وBSA.
ثم إضافة 3 ملليلتر من برنامج تلفزيوني مع EDTA وBSA إلى موقف المغناطيس مع عمود مغناطيسي والسماح لها بالتدفق إلى أنبوب جمع. بعد انتهاء المخزن المؤقت المتدفقة خلال العمود، إضافة تعليق الخلية والسماح لها بالتدفق خلال العمود في أنبوب التجميع. أضف بعد ذلك 5 ملليلترات إضافية من PBS مع EDTA و BSA إلى العمود ومسحها على الفور مع المكبس.
إزالة المكبس وتكرار تدفق قبل عد الخلايا. بعد الطرد المركزي للخلايا، وإزالة supernatant وتعليق بيليه الخلية في IMDM كاملة للثقافة. ثقافة الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
أولا، الجمع بين الحمض النووي البلازميد الفيروسي مع بلازميد التعبئة والتغليف، كلوريد الكالسيوم والماء في أنبوب 1.5 ملليلتر. ثم إضافة 500 ميكرولترات من HBS إلى آخر 1.5 ملليلتر أنبوب. إضافة الخليط transfection قطرة الحكمة إلى أنبوب يحتوي على HBS في حين الاختلاط في وقت واحد مع دوامة تعيين إلى أدنى الإعداد.
احتضان خليط transfection في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 إلى 30 دقيقة. خلال فترة الحضانة، إضافة الكلوروكين إلى خلايا HEK والاحتفاظ بها في الحاضنة. بعد إضافة مزيج transfection، احتضان الخلايا لمدة 8 ساعات في حاضنة 37 درجة مئوية 5٪ ثاني أكسيد الكربون تغيير وسائط الخلية عن طريق إضافة 14 ملليلتر من وسائل الإعلام DMEM10 الطازجة ببطء شديد.
الأنابيب ببطء ضد جدار الطبق يساعد على منع أي تجريد من خلايا HEK. ثم احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في حاضنة 37 درجة مئوية 5٪ ثاني أكسيد الكربون. استخدام حقنة 10 ملليلتر لجمع افرا فيروسية.
ثم قم بتوصيل فلتر حقنة ميكرومتر 0.45 إلى الحقنة. يغرق المابير الفيروسية في أنبوب جمع جديد. جمع المابير الفيروسية ما يقرب من 16 ساعة في وقت لاحق.
بعد هذا، إضافة ملليلتر اثنين من جزء الليفية البشرية المؤتلف في برنامج تلفزيوني إلى غير المعالجة 6 لوحات ثقافة جيدا. في اليوم التالي، استخدم ماصة لإزالة الليفي من الأطباق. كتلة لوحات مع 2٪ BSA في برنامج تلفزيوني واحتضان لوحات في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
استخدام فراغ لإزالة BSA وغسل لوحات مع برنامج تلفزيوني قبل إزالته مع فراغ. بعد هذا، على الفور إضافة مصفاة الفيروسية الفائقة والطرد المركزي لوحة لمدة ساعتين. استخدام فراغ لإزالة افرانح وتدور لوحة مرة أخرى.
بعد إزالة supernatant مع فراغ وغسل الآبار المغلفة الفيروسية مع برنامج تلفزيوني. إزالة برنامج تلفزيوني مع فراغ، إضافة إلى زراعة سابقا ج كيب بالإضافة إلى خلايا الماوس إلى الآبار المغلفة الفيروسية. بعد الطرد المركزي، احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
بعد 48 ساعة من النقل، بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليقها في FACS العازلة 1. أولاً ذوبان السليلوز الميثيل مع السيتوكينات للفئران في درجة حرارة الغرفة. ثم aliquot 3 ملليلتر من السليلوز الميثيل في أنبوب FACS.
إضافة 100 ميكرولترات من تعليق الخلية مع مثبطات مناسبة ل3 ملليلتر من السليلوز الميثيل. ثم دوامة تعليق على ارتفاع لمدة 10 إلى 30 ثانية. بعد معظم فقاعات الهواء الهروب، واستخدام حقنة 1 ملليلتر لوحة 1 ملليلتر من وسائل الإعلام في ثلاث لوحات تكرار.
ضع الأطباق في طبق بيتري كبير مع طبق مفتوح واحد يحتوي على مياه معقمة. ثم تغطية طبق بيتري كبيرة واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية. إعداد ايودونتروتترازوليوم وصمة عار كلوريد عن طريق حل 10 ملليغرام من كلوريد iodonitrotetrazolium في 10 ملليلتر من الماء.
تصفية تعقيم حل تلطيخ مع حقنة قفل Luer مجهزة مرشح 0.2 ميكرومتر. في غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة، إضافة 100 ميكرولترات من حل تلطيخ قطرة الحكمة حول لوحة CFU. ثم احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حاضنة ثقافة الخلية.
وأخيرا، بعد أن تحولت المستعمرات لون بني أحمر داكن، واستخدام خلفية بيضاء في غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة العقيمة لالتقاط صور للوحة CFU الملون. في هذا البروتوكول، تم استخدام العديد من تحليلات التعبير الجيني غير المتحيزة لتحديد المكون الجيني الذي ينسق إدمان الـ oncogene. للتحقق من دور c-Fos وDusp1 كهدف علاجي في سرطان الدم ، تم تأكيد فرط التعبير عنهما مع الخلايا التي تعبر عن BCR-ABL1 oncogene.
وأكد التحليل عن طريق RT-qPCR وغرب النشاف أن كلا من تم الناجمة عن BCR-ABL1 وأن يتم زيادة التعبير عن طريق عامل النمو IL-3. تم فرز YFP بالإضافة إلى الخلايا المعبرة عن طريق FACS لمزيد من المختبر وفي مقايسات الجسم الحي. وأظهرت النتائج أن حذف ج-فوس ودوسب 1 وحده يمنع أرقام الاتحاد.
وقد تعرضت الخلايا التي تفتقر إلى كل من C-Fos وDusp1 للخطر بشكل كبير في قدرتها على تشكيل مستعمرات، كما أن علاج Imatinib قضى على جميع وحدات CFUs التي تشير إلى أن فقدان C-Fos وDusp1 قاتل اصطناعيًا للتعبير BCR-ABL1. بعد هذا التطور، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال السرطان لاستكشاف الشبكات الجينية والجينات التي تقود الاعتماد على البكوجين وكيف تؤثر هذه الجينات على استجابتها الخاصة في نماذج الماوس والمرضى البشريين. لا تنس أن العمل مع الفيروسات الرجعية وعينات المرضى يمكن أن تكون خطرة للغاية ويجب مراعاة ممارسات المختبرات آمنة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
