Bu yöntem, onkogen bağımlılığı ile ilgili temel genlerin belirlenmesi gibi kanser terapötik alanlarında anahtar soruların cevapyardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, birçok kizaz kaynaklı kanserlerde yaygın olan onkogen bağımlılığını kullanmasıdır, bu nedenle birden fazla tümör tipi için geçerlidir. Bu yöntem lösemi içine içgörü sağlayabilir rağmen, aynı zamanda diğer sistemlere uygulanabilir, akciğer kanseri gibi katı tümörler, beyin tümörleri, ve pankreas tümörleri.
Genel olarak, bu yönteme yeni bireyler moleküler biyoloji ve hücresel fizyoloji deneyim eksikliği nedeniyle mücadele edecek. Başlamak için, bir ötenazi farebacak kemikleri hasat. Kemiklerdeki dokuları neşterle temizleyin.
Sonra buz üzerinde soğuk PBS kemikleri yerleştirin ve bir havaneli ile kemikleri ezmek. Bundan sonra, hücre süspansiyonuna 70 mikrometrelik hücresüzlüksüzlük ten 10 mililitrelik pipetle 50 mililitrelik bir vidalı tüpe süzün. Harcı ve havaneleyi soğuk PBS ile birden fazla kez yıkayın ve hücre süspansiyonuna 50 mililitrelik tüpekleyin.
Sonraki santrifüj kemik iliği ve vakum ve cam pipet ile supernatant çıkarın. Hücre peletini 5 mililitre PBS'de yeniden askıya alın. Bir pipet kullanarak, yavaş yavaş oda sıcaklığında poli-sakaroz üstüne askıya kemik iliği ekleyin.
Bundan sonra, fren kapalı 20 dakika boyunca 400 Gs poli-sakaroz spin. Santrifüjden sonra, bir pipet ile bulutlu toplam mono-nükleer hücre arayüzü toplamak ve yeni bir 15 mililitrelik tüp aktarın. PBS ile 10 mililitre hacmi getirin ve saymak için 20 mikrolitre kaldırın.
Santrifüjden sonra, supernatant atın ve buz üzerine pelet yerleştirin. Daha sonra, EDTA ve BSA ile PBS hücre pelet resuspend. Hücre süspansiyonuna CD117 mikroboncukları ve karıştırmak için girdap ekleyin.
Bundan sonra, 4 santigrat derece 10 dakika boyunca süspansiyon kuluçka. Daha sonra hacmi 10 mililitreye kadar EDTA ve BSA ile daha fazla PBS ve 1200 G'de 4 santigrat derecede 5 dakika santrifüj ile getirin. Supernatant kaldırmak ve EDTA ve BSA ile PBS hücre pelet askıya almak için bir vakum kullanın.
Daha sonra EDTA ve BSA ile 3 mililitre PBS ekleyin manyetik kolonlu bir mıknatıs standına ve bir toplama tüpüne akmasına izin verin. Arabellek sütundan akan bittikten sonra, hücre süspansiyonu ekleyin ve sütundan toplama tüpüne akmasına izin verin. Sonraki sütuna EDTA ve BSA ile PBS 5 mililitre daha ekleyin ve hemen piston ile floş.
Pistonu çıkarın ve hücreleri saymadan önce floşu tekrarlayın. Hücreleri santrifüj ettikten sonra, supernatant çıkarın ve kültür için tam IMDM hücre pelet askıya. Kültür hücreleri bir gecede 37 santigrat derecede %5 karbondioksitle.
İlk olarak, 1,5 mililitrelik bir tüp içinde ambalaj plazmid, kalsiyum klorür ve su ile retroviral plazmid DNA birleştirin. Daha sonra başka bir 1,5 mililitrelik tüp hbs 500 mikrolitre ekleyin. Aynı anda en düşük ayara ayarlanmış girdap ile karıştırırken HBS içeren tüpe transfeksiyon karışımı damla akıllıca ekleyin.
Transfeksiyon karışımını oda sıcaklığında 20-30 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçka döneminde, HEK hücrelerine klorokin ekleyin ve kuvözde tutun. Transfeksiyon karışımını ekledikten sonra, hücreleri 37 santigrat derecede 8 saat kuluçkaya yatırın 5%5 CO2 kuluçka makinesi, 14 mililitre taze DMEM10 ortamını çok yavaş bir şekilde ekleyerek hücre ortamını değiştirerek değiştirin.
Çanak duvara yavaş yavaş pipetleme HEK hücrelerinin herhangi bir sıyırma önlemeye yardımcı olur. Sonra hücreleri bir gecede 37 santigrat derece %5 CO2 kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın. Viral supernatant toplamak için 10 mililitrelik şırınga kullanın.
Sonra şırınga için 0,45 mikrometre şırınga filtresi takın. Viral supernatant'ı yeni bir toplama tüpüne daldırın. Yaklaşık 16 saat sonra viral supernatant toplamak.
Bundan sonra, tedavi edilmemiş 6 iyi kültür plakaları için PBS rekombinant insan fibronektin parçası iki mililitre ekleyin. Ertesi gün, plakalardan fibronectin kaldırmak için bir pipet kullanın. PBS'de %2 BSA ile plakaları bloke edin ve plakaları oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın.
BSA kaldırmak için bir vakum kullanın ve bir vakum ile çıkarmadan önce PBS ile plakaları yıkayın. Bundan sonra, hemen filtrelenmiş viral supernatant ekleyin ve iki saat boyunca plaka santrifüj. Supernatant kaldırmak ve plaka tekrar döndürmek için bir vakum kullanın.
Daha sonra bir vakum ile supernatant çıkarın ve PBS ile viral kaplı kuyuları yıkayın. Bir vakum ile PBS çıkarın, viral kaplı kuyulara daha önce kültürlü c-Kip artı fare hücreleri ekleyin. Santrifüjden sonra hücreleri 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın.
Transdüksiyondan 48 saat sonra, hücreleri santrifüj yoluyla peletleyin ve FACS tampon 1'de yeniden askıya alın. Önce oda sıcaklığında fareler için sitokinlerle metil selüloz eritin. Sonra bir FACS tüpünde 3 mililitre metil selüloz.
Metil selüloz 3 mililitre uygun inhibitörleri ile hücre süspansiyon 100 mikrolitre ekleyin. Sonra süspansiyonu 10-30 saniye boyunca yükseklere doğru itin. Hava kabarcıkları kaçış çoğu sonra, üç çoğaltma plakaları medya 1 mililitre plaka için 1 mililitreşyon şırınga kullanın.
Steril su içeren bir açık çanak ile birlikte büyük bir Petri kabında plakaları yerleştirin. Sonra büyük Petri kabını kapatın ve hücreleri 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. 10 mililitre suda 10 miligram iyodonitrotetrazolium klorür eriterek iyodonitrotetrazolium klorür lekesini hazırlayın.
Filtre, 0,2 mikrometre filtre ile donatılmış luer kilit şırıngaile boyama çözeltisini sterilize edin. Doku kültürü başlık, CFU plaka etrafında damla-bilge boyama çözeltisi 100 mikrolitre ekleyin. Sonra bir hücre kültürü kuluçka makinesinde tabakları bir gecede 37 derecede kuluçkaya yatırın.
Son olarak, koloniler koyu kırmızı kahverengi renk döndü sonra, lekeli CFU plaka fotoğraf çekmek için steril doku kültürü başlık beyaz bir arka plan kullanın. Bu protokolde, onkogen bağımlılığını düzenleyen genetik bileşeni tanımlamak için birden fazla tarafsız gen ekspresyonu analizi kullanılmıştır. Lösemide tedavi hedefi olarak c-Fos ve Dusp1'in rolünü doğrulamak için, aşırı ekspresyonu BCR-ABL1 onkogenesini ifade eden hücrelerle doğrulandı.
RT-qPCR ve western blotting ile yapılan analizler, her ikisinin de BCR-ABL1 tarafından indüklendirilmiş olduğunu ve ekspresyonların büyüme faktörü IL-3 ile artırıldığını doğrulamıştır. YFP artı ifade hücreleri daha fazla in vitro ve in vivo tahliller için FACS üzerinden sıralandı. Sonuçlar, c-Fos ve Dusp1'in silinmesinin tek başına CFU sayılarını inhibe ettiğini göstermiştir.
Hem c-Fos hem de Dusp1'den yoksun hücreler koloni oluşturma yetenekleriaçısından önemli ölçüde tehlikeye girdi ve C-Fos ve Dusp1 kaybının BCR-ABL1 ekspresyonu için sentetik olarak ölümcül olduğunu gösteren Tüm CPU'ları yok etti. Bu gelişmeden sonra bu teknik, kanser alanında araştırmacıların onkogen bağımlılığını yönlendiren genetik ağları ve genleri ve bu genlerin fare modellerinde ve insan hastalarda ki özel tepkilerini nasıl etkilediğini keşfetmelerinin önünü açmıştır. Retrovirüsler ve hasta numuneleri ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken laboratuvar uygulamalarına uyulması gerektiğini unutmayın.
