Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave nos campos terapêuticos do câncer, como a identificação de genes-chave envolvidos na dependência do oncogene. A principal vantagem dessa técnica é que ela utiliza a dependência oncogênica que é comum a muitos cânceres orientados pela quinase, portanto, é aplicável a múltiplos tipos de tumores. Embora este método possa fornecer uma visão sobre a leucemia, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como tumores sólidos, como câncer de pulmão, tumores cerebrais e tumores pancreáticos.
Geralmente, indivíduos novos nesse método lutarão devido à falta de experiência em biologia molecular e fisiologia celular. Para começar, colhia os ossos da perna de um rato eutanizado. Limpe os tecidos dos ossos com um bisturi.
Em seguida, coloque os ossos em PBS frio no gelo e esmague os ossos com um pilão. Depois disso, filtre a suspensão celular através de um coador de células de 70 micrômetros em um tubo de tampa de parafuso de 50 mililitros com uma pipeta de 10 mililitros. Lave a argamassa e pilão várias vezes com PBS frio e adicione a suspensão celular ao tubo de 50 mililitros.
Em seguida, centrifufique a medula óssea e remova o sobrenatante com aspiração de vácuo e vidro. Resuspend a cápsula de célula em 5 mililitros de PBS. Usando uma pipeta, adicione lentamente a medula óssea suspensa ao topo da poli sacarose de temperatura ambiente.
Depois disso, gire a poli sacarose a 400 Gs por 20 minutos com o freio desligado. Após a centrifugação, colete a interface celular mononuclear total nebulosa com uma pipeta e transfira-a para um novo tubo de 15 mililitros. Leve o volume para 10 mililitros com PBS e remova 20 microliters para contagem.
Após a centrifugação, descarte o sobrenante e coloque a pelota no gelo. Em seguida, resuspende a pelota de célula em PBS com EDTA e BSA. Adicione microesferas CD117 à suspensão celular e vórtice para misturar.
Depois disso, incubar a suspensão por 10 minutos a 4 graus Celsius. Em seguida, leve o volume até 10 mililitros com mais PBS com EDTA e BSA e centrífuga a 1200 G's a 4 graus Celsius por 5 minutos. Use um vácuo para remover o supernasce e suspenda a pelota de célula em PBS com EDTA e BSA.
Em seguida, adicione 3 mililitros de PBS com EDTA e BSA a um suporte de ímã com uma coluna magnética e permita que ele flua em um tubo de coleta. Após o buffer terminar fluindo através da coluna, adicione a suspensão da célula e deixe fluir através da coluna para o tubo de coleta. Em seguida, adicione mais 5 mililitros de PBS com EDTA e BSA à coluna e lave-o imediatamente com o êmbolo.
Remova o êmbolo e repita a descarga antes de contar as células. Depois de centrifugar as células, remova o sobrenaspeente e suspenda a pelota celular em IMDM completo para cultura. Cultura as células durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.
Primeiro, combine o DNA plasmídeo retroviral com a embalagem plasmid, cloreto de cálcio e água em um tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, adicione 500 microliters de HBS a outro tubo de 1,5 mililitro. Adicione a mistura de transfecção em termos de gota ao tubo que contém HBS enquanto mistura simultaneamente com o vórtice definido para o ajuste mais baixo.
Incubar a mistura de transfecção à temperatura ambiente por 20 a 30 minutos. Durante o período de incubação, adicione cloroquina às células HEK e mantenha-as na incubadora. Depois de adicionar a mistura de transfecção, incubar as células por 8 horas em uma incubadora de 5% de CO2 de 37 graus Celsius mudando a mídia celular adicionando 14 mililitros de mídia DMEM10 fresca muito lentamente.
Pipetting lentamente contra a parede do prato ajuda a evitar qualquer despojo de células HEK. Em seguida, incubar as células durante a noite na incubadora de 37 graus Celsius 5% de CO2. Use uma seringa de 10 mililitros para coletar o supernatante viral.
Em seguida, conecte um filtro de seringa de 0,45 micrômetros à seringa. Mergulhe o supernatante viral em um novo tubo de coleta. Recolher o supernante viral aproximadamente 16 horas depois.
Depois disso, adicione dois mililitros de fragmento de fibronectina humana recombinante na PBS a 6 placas de cultura não tratadas. No dia seguinte, use uma pipeta para remover a fibronectina das placas. Bloqueie as placas com 2%BSA na PBS e incuba as placas em temperatura ambiente por 30 minutos.
Use um vácuo para remover bsa e lave as placas com PBS antes de removê-la com um vácuo. Depois disso, adicione imediatamente o supernatante viral filtrado e centrifugar a placa por duas horas. Use um vácuo para remover o sobrenante e gire a placa novamente.
Em seguida, remova o supernatante com um vácuo e lave os poços revestidos virais com PBS. Remova o PBS com um vácuo, adicione as células de rato c-Kip anteriormente cultivadas aos poços revestidos virais. Após a centrifugação, incubar as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
48 horas após a transdução, pelota as células através da centrifugação e resuspensá-las no buffer FACS 1. Primeiro descongele a celulose de metila com citocinas para camundongos à temperatura ambiente. Em seguida, alíquota de 3 mililitros de celulose de metila em um tubo FACS.
Adicione 100 microliters da suspensão celular com os inibidores apropriados a 3 mililitros de celulose de metila. Em seguida, vórtice a suspensão em alta por 10 a 30 segundos. Depois que a maioria das bolhas de ar escaparem, use uma seringa de 1 mililitro para emplacar 1 mililitro da mídia em três placas de réplica.
Coloque as placas em uma grande placa de Petri junto com uma placa aberta contendo água estéril. Em seguida, cubra a grande placa de Petri e incuba as células a 37 graus Celsius. Prepare a mancha de cloreto de iodonitrotetrazolium dissolvendo 10 miligramas do cloreto de iodonitrotetrazolium em 10 mililitros de água.
O filtro esteriliza a solução de coloração com uma seringa de bloqueio Luer equipada com um filtro de 0,2 micrômetro. Na capa da cultura tecidual, adicione 100 microliters da solução de coloração em forma de gota ao redor da placa da UFC. Em seguida, incubar as placas durante a noite a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura celular.
Finalmente, depois que as colônias virarem uma cor marrom vermelha escura, use um fundo branco no capô de cultura de tecido estéril para tirar fotos da placa de CFU manchada. Neste protocolo, foram utilizadas múltiplas análises de expressão genética imparcial para identificar o componente genético que orquestra o vício em oncogene. Para validar o papel de c-Fos e Dusp1 como alvo terapêutico na leucemia, sua superexpressão foi confirmada com células expressando o oncogene BCR-ABL1.
A análise via RT-qPCR e mancha ocidental confirmou que ambos foram induzidos pelo BCR-ABL1 e que sua expressão é aumentada pelo fator de crescimento IL-3. As células de expressão YFP plus foram classificadas via FACS para ensaios in vitro e in vivo. Os resultados demonstraram que a exclusão de c-Fos e Dusp1 apenas inibiram os números da UFC.
As células sem c-Fos e Dusp1 foram significativamente comprometidas em sua capacidade de formar colônias e o tratamento de Imatinib exterminou todas as CFUs indicando que a perda de c-Fos e Dusp1 é sinteticamente letal para a expressão BCR-ABL1. Após esse desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo do câncer explorarem as redes genéticas e genes que impulsionam a dependência do oncogene e como esses genes afetam sua resposta particular em modelos de camundongos e pacientes humanos. Não se esqueça que trabalhar com retrovírus e amostras de pacientes pode ser extremamente perigoso e práticas laboratoriais seguras devem ser observadas durante a realização deste procedimento.
