Diese Methode kann helfen, schlüsselweisen Fragen in Krebstherapeutika-Bereichen zu beantworten, wie z. B. die Identifizierung von Schlüsselgenen, die an der Onkogenabhängigkeit beteiligt sind. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie die Onkogenabhängigkeit nutzt, die vielen Kinase-getriebenen Krebsarten gemeinsam ist, daher ist sie auf mehrere Tumortypen anwendbar. Obwohl diese Methode Einblick in Leukämie geben kann, Kann es auch auf andere Systeme angewendet werden, wie solide Tumoren wie Lungenkrebs, Hirntumoren, und Bauchspeicheldrüsentumoren.
Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, aufgrund mangelnder Erfahrung in der Molekularbiologie und Zellphysiologie kämpfen. Zu Beginn ernten Sie die Beinknochen von einer eingeschläferten Maus. Reinigen Sie das Gewebe von den Knochen mit einem Skalpell.
Dann legen Sie die Knochen in kalten PBS auf Eis und zerkleinern Sie die Knochen mit einem Stößel. Danach filtern Sie die Zellsuspension durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Schraubverschlussrohr mit einer 10-Milliliter-Pipette. Waschen Sie den Mörtel und Stößel mehrmals mit kalten PBS und fügen Sie die Zellsuspension auf die 50 Milliliter Rohr.
Nächste Zentrifuge das Knochenmark und entfernen Sie den Überstand mit Vakuum und Glaspipette. Setzen Sie das Zellpellet in 5 Milliliter PBS wieder auf. Mit einer Pipette, fügen Sie langsam das hängende Knochenmark an der Oberseite der Raumtemperatur Polysukrose.
Danach drehen Sie die Polysaccharose bei 400 Gs für 20 Minuten mit ausgeschalteter Bremse. Nach der Zentrifugation die trübe gesamte mono-nukleare Zellschnittstelle mit einer Pipette sammeln und in ein neues 15-Milliliter-Rohr übertragen. Bringen Sie das Volumen auf 10 Milliliter mit PBS und entfernen Sie 20 Mikroliter zum Zählen.
Nach der Zentrifugation den Überstand entsorgen und das Pellet auf Eis legen. Als nächstes setzen Sie das Zellpellet in PBS mit EDTA und BSA wieder aus. Fügen Sie CD117 Mikroperlen zur Zellsuspension hinzu und mischen Sie wirbeln.
Danach die Suspension für 10 Minuten bei 4 Grad Celsius inkubieren. Dann bringen Sie das Volumen bis zu 10 Milliliter mit mehr PBS mit EDTA und BSA und Zentrifuge bei 1200 G bei 4 Grad Celsius für 5 Minuten. Verwenden Sie ein Vakuum, um den Überstand zu entfernen und das Zellpellet in PBS mit EDTA und BSA aufzuhängen.
Dann fügen Sie 3 Milliliter PBS mit EDTA und BSA zu einem Magnetständer mit einer Magnetsäule hinzu und lassen Sie ihn in ein Sammelrohr fließen. Nachdem der Puffer beendet ist, fügen Sie die Zellsuspension hinzu, und lassen Sie sie durch die Spalte in das Auflistungsrohr fließen. Als nächstes fügen Sie 5 weitere Milliliter PBS mit EDTA und BSA in die Säule und spülen Sie sie sofort mit dem Kolben.
Entfernen Sie den Kolben und wiederholen Sie den Flush, bevor Sie die Zellen zählen. Nach dem Zentrifugieren der Zellen, entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet in vollständig IMDM für Kultur. Kultur die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid.
Kombinieren Sie zunächst die retrovirale Plasmid-DNA mit dem Verpackungsplasmid, Calciumchlorid und Wasser in einer 1,5-Milliliter-Röhre. Dann 500 Mikroliter HBS zu einem weiteren 1,5 Milliliter Rohr hinzufügen. Fügen Sie das Transfektionsgemisch tropfenweise in das Rohr, das HBS enthält, und mischen Sie gleichzeitig mit dem Wirbelwirbel, der auf die niedrigste Einstellung eingestellt ist.
Inkubieren Sie das Transfektionsgemisch bei Raumtemperatur für 20 bis 30 Minuten. Während der Inkubationszeit chloroquin in die HEK-Zellen geben und im Inkubator aufbewahren. Nach Zugabe des Transfektionsmixes inkubieren Sie die Zellen 8 Stunden lang in einem 37 Grad Celsius 5%CO2-Inkubator, der die Zellmedien verändert, indem 14 Milliliter frische DMEM10-Medien sehr langsam hinzugefügt werden.
Das langsame Pipettieren an der Wand der Schale hilft, ein Abstreifen von HEK-Zellen zu verhindern. Dann inkubieren Sie die Zellen über Nacht im 37 Grad Celsius 5%CO2-Inkubator. Verwenden Sie eine 10 Milliliter Spritze, um den viralen Überstand zu sammeln.
Befestigen Sie dann einen 0,45 Mikrometer Spritzenfilter an der Spritze. Tauchen Sie den viralen Überstand in eine neue Sammlungsröhre. Sammeln Sie den viralen Überstand etwa 16 Stunden später.
Danach zwei Milliliter rekombinantes humanes Fibronectin-Fragment in PBS zu unbehandelten 6 Brunnenkulturplatten hinzufügen. Verwenden Sie am nächsten Tag eine Pipette, um das Fibronectin von den Platten zu entfernen. Blockieren Sie die Platten mit 2%BSA in PBS und inkubieren Sie die Platten bei Raumtemperatur für 30 Minuten.
Verwenden Sie ein Vakuum, um BSA zu entfernen und die Platten mit PBS zu waschen, bevor Sie es mit einem Vakuum entfernen. Danach sofort den gefilterten viralen Überstand hinzufügen und die Platte für zwei Stunden zentrifugieren. Verwenden Sie ein Vakuum, um den Überstand zu entfernen und die Platte wieder zu drehen.
Als nächstes entfernen Sie den Überstand mit einem Vakuum und waschen Sie die viral beschichteten Brunnen mit PBS. Entfernen Sie die PBS mit einem Vakuum, fügen Sie die zuvor kultivierten c-Kip plus Mauszellen zu den viral beschichteten Brunnen hinzu. Nach der Zentrifugation die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid bebrüten.
48 Stunden nach der Transduktion die Zellen per Zentrifugation pellet und im FACS-Puffer 1 wieder aufsetzen. Zuerst die Methylcellulose mit Zytokinen für Mäuse bei Raumtemperatur auftauen. Dann aliquot 3 Milliliter Methylcellulose in einem FACS-Rohr.
100 Mikroliter der Zellsuspension mit den entsprechenden Inhibitoren zu 3 Millilitermethylcellulose hinzufügen. Dann wirbeln Sie die Federung auf hoch für 10 bis 30 Sekunden. Nachdem die meisten Luftblasen entweichen, verwenden Sie eine 1 Milliliter Spritze, um 1 Milliliter der Medien in drei Replizienplatten zu verzieren.
Legen Sie die Teller in eine große Petrischale zusammen mit einer offenen Schale mit sterilem Wasser. Dann bedecken Sie die große Petrischale und bebrüten die Zellen bei 37 Grad Celsius. Bereiten Sie Iodonitrotetrazoliumchlorid Fleck durch Lösen 10 Milligramm des Iodonitrotetrazoliumchlorid in 10 Milliliter Wasser.
Filter sterilisieren die Färbelösung mit einer Luer-Sperrspritze, die mit einem 0,2-Mikrometer-Filter ausgestattet ist. In der Gewebekulturhaube fügen Sie 100 Mikroliter der Färbelösung tropfenweise um die KBE-Platte herum. Dann bebrüten die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Zellkultur-Inkubator.
Schließlich, nachdem die Kolonien eine dunkel-rot-braune Farbe gedreht haben, verwenden Sie einen weißen Hintergrund in der sterilen Gewebekultur Haube, um Fotos von der gebeizten CFU-Platte zu machen. In diesem Protokoll wurden mehrere unvoreingenommene Genexpressionsanalysen verwendet, um die genetische Komponente zu identifizieren, die die Onkogensucht orchestriert. Um die Rolle von c-Fos und Dusp1 als therapeutisches Ziel bei Leukämie zu validieren, wurde ihre Überexpression mit Zellen bestätigt, die das BCR-ABL1-Onkogen exemitzen.
Die Analyse über RT-qPCR und Western Blotting bestätigte, dass beide durch BCR-ABL1 induziert wurden und dass ihre Expression durch den Wachstumsfaktor IL-3 verstärkt wird. YFP plus Exstesszellen wurden über FACS für weitere In-vitro- und In-vivo-Assays sortiert. Die Ergebnisse zeigten, dass das Löschen von c-Fos und Dusp1 allein die KBE-Zahlen hemmte.
Zellen, denen sowohl c-Fos als auch Dusp1 fehlten, wurden in ihrer Fähigkeit, Kolonien zu bilden, erheblich beeinträchtigt, und die Imatinib-Behandlung löschte alle KBE aus, was darauf hindeutet, dass der Verlust von c-Fos und Dusp1 synthetisch tödlich für den BCR-ABL1-Ausdruck ist. Nach dieser Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet des Krebses den Weg, um die genetischen Netzwerke und Gene zu erforschen, die die Onkogenabhängigkeit antreiben und wie diese Gene ihre besondere Reaktion bei Mausmodellen und menschlichen Patienten beeinflussen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Retroviren und Patientenproben extrem gefährlich sein kann und sichere Laborpraktiken sollten während der Durchführung dieses Verfahrens beobachtet werden.
