وأيد هذا العمل بمنحه SBIR (1R44EY027654-01A1).

وأجريت جميع الإجراءات مع الفئران وفقا لبروتوكولات وافق عليها مستشفى أوكلاند معهد بحوث الحيوان الرعاية واستخدام اللجنة الأطفال والتقيد برابطة البحوث في بيان الرؤية و "طب العيون" (آرفو) لاستخدام للحيوانات في العيون والرؤية للبحث.
1-الأنسجة التحضير إيمونوستاينينج
<ol><li>Euthanize فئران C57 BL/6J في يوم الجنينية (ه) 16، يوم بعد الولادة (ف) 0, P15 و P90 بثاني أكسيد الكربون (CO2) متبوعاً بقطع الرأس (الفئران E16 و P0).</li>
	<li>عيون الفأر فورا انوكليتي ثقب بإبرة 29 1/2 في الجهة الظهرية من العين. احتضان لمدة 5 دقائق (دقيقة) في 1 مل من 4% بارافورمالدهيد (PFA) في المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (1 x PBS) pH 8.0 في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>جعل الكؤوس العين من P0, P15 و P90، تشريح خارج القرنية والعدسة مع مقص العيون الجميلة في حين العيون في 4% منهاج عمل بيجين. ملاحظة: تخطي هذه الخطوة لعيون E16 كالعيون صغيرة جداً.</li>
	<li>إصلاح العين الكؤوس (P0 و P15 و P90) وعيون كله (E16) في 4% منهاج العمل لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم يغسل الكؤوس العين والعيون كلها مرتين في 1 مل من س 1 برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>كريوبروتيكت العين كوب وعيون كله في 1xPBS، pH 8.0 تحتوي على السكروز 10% لمدة ساعة واحدة. الاحتفاظ في السكروز 20% في 1 x برنامج تلفزيوني لمدة ساعة واحدة وتشبع ثم في السكروز 30% في برنامج تلفزيوني س 1 بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.</li>
	<li>في اليوم التالي، تضمين الكؤوس العين والعيون كلها الأمثل خفض درجة الحرارة مجمع (OCT)، (500 ميليلتر) في كريومولدس وتجميد المفاجئة في حمام الثلج الجاف/إيثانول، وتخزينها في-80 درجة مئوية.</li>
	<li>إزالة القوالب مع الكؤوس العين جزءا لا يتجزأ وعيون كل من-80 درجة مئوية، والسماح لحجته إلى-20 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة قبل كريوسيكتيونينج.</li>
	<li>قطع المقاطع العرضية الشبكية (12 ميكرومتر سميكة) موازية للمحور تيمبوروناسال عن طريق رأس العصب البصري باستخدام كريوستات في-20 درجة مئوية.</li>
	<li>تحميل المقاطع الشبكية على شرائح المجهر53 ومخزن في-80 درجة مئوية.</li>
</ol>2-إيمونوستاينينج مع الأجسام المضادة 5 mC و 5-مؤسسة حمد الطبية
<ol><li>تطويق المقاطع الشبكية التي شنت على الشرائح بقلم حاجز مسعور. القلم حاجز الماء يقلل حجم الأجسام المضادة المطلوبة لوصمة عار في الأنسجة.</li>
	<li>تغسل أجزاء الشبكية مرة واحدة مع 200 ميليلتر 1 x برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق.</li>
	<li>بيرميبيليزي المقاطع الشبكية مع 200 ميليلتر من 0.1% X-100 تريتون في 1 x برنامج تلفزيوني (برنامج تلفزيوني-تي) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>تؤذي المقاطع الشبكية لمدة 30 دقيقة مع 200 ميليلتر من طازجة 2 حمض الهيدروكلوريك (HCl) ن في س 1 برنامج تلفزيوني في حاضنة 37 درجة مئوية. ملاحظة: مطلوب معايرة دقيق المعاملة HCl لتحسين إشارة 5mC.</li>
	<li>وتشمل دائماً replicates البيولوجية (3-4) حين الأمثل 5mC إشارة54. ملاحظة: قمنا باسترجاع مستضد في 4 نقاط زمنية (15 دقيقة، 30 دقيقة، ح 1 وح 2) والحضانة وجدت 30 دقيقة الأمثل لإشارة 5mC. حضانة أطول مع HCl يحط هيكل النوى مما يؤدي إلى عدم القدرة على ترجمة 5mC إشارة إلى النواة.</li>
	<li>بعد تمسخ، تحييد المقاطع الشبكية بإضافة 100 ميليلتر من 0.1 متر تريس-HCl (pH 8.3) في أقسام الشبكية لمدة 10 دقائق.</li>
	<li>احتضان الفروع في 500 ميليلتر من عرقلة الحل (مصل الماعز العادية بريمن 5% في 0.1% X-100 تريتون في برنامج تلفزيوني 1 x) عن ح 1 في درجة حرارة الغرفة في غرفة رطوبة.</li>
	<li>وبعد تجميد، إضافة مكافحة--5mC؛ الأجسام المضادة 5hmC المخفف 1: 500 في عرقلة حل للمقاطع الشبكية.</li>
	<li>احتضان الشبكية المقاطع بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في دائرة الرطوبة.</li>
	<li>الغسيل اليوم التالي، المقاطع الشبكية 3 مرات (10-15 دقيقة في كل مرة) مع 0.1% PBS-T واحتضان ثم في عرقلة الحل مع الأجسام المضادة الثانوية المقابلة (الماعز المضادة الأرانب والماعز الماوس المضادة مفتش، تضعف؛ 1: 1000)، التي تحتوي على DAPI (4 ', 6- دياميدينو-2-فينيليندولي) الحل (1 ميكروغرام/مل) في درجة حرارة الغرفة ح 1 في عرقلة الحل. ملاحظة: تجنب تجفيف الأقسام خلال جميع مراحل إيمونوديتيكشن.</li>
	<li>يغسل الشرائح الوقت الثلاثة مع 1 مل من 0.1% برنامج تلفزيوني-ت.</li>
	<li>بعد الغسيل الأخير، جبل المقاطع مع المتوسطة تصاعد مائي تحت ساترة وختم مع طلاء الأظافر عديم اللون.</li>
</ol>3-[كنفوكل] إيمونوهيستوتشيميستري
<ol><li>توجيه الفروع أن يكون الجانب ظهارة صباغ الشبكية كأس البصرية دائماً تواجه طريقة واحدة (مثلاً أعلى) للاتساق.</li>
	<li>تنفيذ التقاط الصورة إيمونوستينيد الشبكية أقسام في 63 X (التكبير عدسة الهدف) مع 2 X أو 3 X التكبير.</li>
	<li>إنشاء عدة مقاطع بصرية لكل صورة مختارة (z-مكدسات) في جميع القنوات 3 (الأحمر والأخضر والأزرق RGB) استخدام 0.35 ميكرومتر خطوة. ملاحظة: التكبير النهائي من عينة تصور في العاشر 10-20 (التكبير عدسة الهدف) سيكون 63 X، على التوالي، عندما جنبا إلى جنب مع 10x (تستخدم عادة) في عدسة العين. تصور مضغوطة مكدس البصرية لتحديد موقع إشارة 5mC و 5hmC</li>
</ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

مثلايشن الحمض النووي وهيدروكسيميثيليشن هي دينامية وعكسها الحمض النووي التعديلات، التي مودولاتيثي مجموعة متنوعة من الآليات البيولوجية في دولة نامية، وكذلك كما هو الحال في الخلايا بوستميتوتيك. هنا، يمكننا وصف أسلوب استنساخه للكشف عن 5mC و 5hmC الحمض النووي إجراء تعديلات في الموقع بتقنية المناعي (باستخدام الأجسام المضادة 5mC ومكافحة--5hmC) في الأجزاء المجمدة ثابتة بارافورمالدهيد الشبكية الماوس، وتوفير المبادئ التوجيهية لتحسين وتوحيد النتائج، خاصة عند مقارنة عينات مختلفة عدة. أننا في وقت سابق تستخدم هذا الأسلوب لتحديد التغييرات 5mC في الشبكية الماوس مع استهداف الشبكية الخاصة Dnmt1و Dnmt3a و Dnmt3b الحمض النووي ميثيلترانسفيراسي الجينات، وأبلغ الاستنفاد (المتوقع) لعلامات 5mC في شبكية العين على7 .
أن الخطوة الحاسمة في الكشف المناعي 5mC هو الأمثل لعلاج أقسام نسيجية مع HCl: أقل من 15 دقيقة المعالجة المسبقة لا يتوقع أن تسفر عن نتائج استنساخه، بينما يدمر العلاج المفرط مع قائمة توافق الأجهزة النووية الهندسة المعمارية. وجدنا أفضل نتيجة بعد الاحتضان 30 دقيقة مع HCl. نوصي باستخدام دائماً HCl المخفف الطازج وحل منهاج العمل 4% تقدم طازجة للحمض النووي تمسخ والشبكية تثبيت الأنسجة.
لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها النتائج، نوصي لتشمل ثلاثة أو أربعة replicates البيولوجية حين الأمثل لإشارة 5mC. في حين تعيين كل فرد من المناعي تلطيخ قد تولد نتائج مختلفة قليلاً (مناطق heterochromatic مشرقة أكثر أو أقل)، الذي من المتوقع في توزيع المناعي النووية الأسلوب، و 5mC و 5hmC ضمن مجموعة فردية المقاطع من المتوقع أن تكون الغاية استنساخه، لطالما يتم اتباع البروتوكول.
هذا الأسلوب أيضا لديه الحد كما لاحظنا استمرار التفاوت في توزيع 5mC في نواة خلية مستقبله داخل نفس القسم. وجدنا بعض الأنوية أظهر إشارة قوية 5mC في حين أظهرت نواة الخلية المجاورة لا توجد إشارة 5mC. هذا سبب القيد في تعرية مستضد 5mC بمعاملة HCl في الأجزاء المجمدة.
أهمية هذا الأسلوب يتيح التعريب 5mC دون علاج ك الدناز وبروتيناز مما يؤدي إلى المحافظة على أفضل من تشروموسينتيرس. يعد هذا الأسلوب المتوقع للعمل بقوة على أي مقاطع من جميع الأنسجة الحيوانية الفقارية، 5mC تحمل علامات 5hmC، والمجهزة بنهج مماثل، ليس فقط الماوس الشبكية، لطالما يتم اتباع البروتوكول.

التنظيم جينية للتنمية والتوازن بوستميتوتيك الشبكية الماوس هو منطقة مثيرة للبحوث، التي وعود لتحقيق فهم رواية البيولوجية آليات التحكم في تحديد مصير ريتينوجينيسيس والخلية، الخلية نوع معين وظيفة التمثيل الغذائي، فضلا عن الأمراض المحمولة، موت الخلايا وتجديد1،2،3،4،،من56،،من78 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13-يخضع الكروماتين التغيرات الدينامية في التنمية، وكذلك استجابة لإشارات متغير خارجي سواء كان ذلك التأكيد، الأيض أو خلية الموت المحفزات6،،من1415، 16 , 17 , 18-في نويات الماوس، تنقسم الكروماتين euchromatin نشطة وغير نشطة heterochromatin6،،من1920. نواة الطور البيني، يتواجد يوتشروماتين في المنطقة الداخلية من النواة بينما heterochromatin خطوط على هامش النووي ونويه. هذا النمط يسمى التقليدية، وهو الغاية المصانة في حقيقيات النوى. على النقيض من ذلك، قد نوى رود في الحيوانات الليلية مثل الماوس وفار مقلوب نمط حيث تحتل النواة هيتيروتشروماتين في وسط محاط بتشكيل6،شل الأبعد18، يوتشروماتين 20. عند الولادة، وقد نوى رود الهندسة النووية التقليدية. انعكاس نويات رود يحدث أثناء التطوير قبل إعادة عرض للهندسة النووية التقليدية. أثناء هذه العملية، يفصل heterochromatin الطرفية من هامش النووي وتشروموسينتيرس تلتحم معا لنموذج تشروموسينتير واحد في المركز نواة6،18.
المجينية الحمض النووي مثلايشن تشارك في مراقبة المطابقة الكروماتين المحلية21. مثلايشن الحمض النووي يحدث في 5 ' موقف من بقايا السيتوزين دينوكليوتيديس البد أن يتم إثراء في منطقة المروج العديد من الجينات في الماوس جينومات22،،من2324،25،26 كذلك في إينتيرجينيك ومناطق إنترون، التي تحمل العناصر التنظيمية27. مثلايشن جزر البد في المروجين الدانية21،24 وتسلسل البد في الجينات القدرة على27،28 المهم في تنظيم الدولة الحيوية من الكروماتين الثنائي التكافؤ، التي تحتوي على العديد العوامل الإنمائية الجينات/النسخ تلعب دوراً هاما في التنمية والسرطان والشيخوخة29،30،،من3132،،من3334 . المشاركة ثلاثة الحمض ميثيلترانسفيراسيس (دنمتس) في مثلايشن الحمض النووي خلال الماوس التنمية35. يتم التعبير عن جميع دنمتس الثلاثة خلال الماوس التنمية الشبكية36 والتغييرات الخاصة بالشبكية في دنمت الجينات أثر التنمية الشبكية2،7. هيدروكسيميثيلسيتوسيني (5hmC) هو نتاج الأكسدة ديميثيلاتيون 5-ميثيلسيتوسيني (5mC). الثلاثة الإنزيمات إزفاء (TET) أحد عشر العشر المشاركة في 5mC ديميثيليشن37،،من3839. تعديل هيدروكسيميثيل-C هو المخصب المروجين والهيئات الجينات وتسلسل الجينوم إينتيرجينيك داخل الجينات الغنية والمناطق بنشاط يدون27،40.
وهناك مجموعة متنوعة من وصف النهج لتحديد الأنماط المتغيرة مثلايشن الحمض النووي في الخلايا41،42،،من4344،،من4546، البعض منهم تمكن التحديد الكمي للتغيرات العالمية من مثلايشن الحمض النووي بينما تركز على التغييرات الدقيقة في المناطق الغنية البد داخل المروجين ومحسنات. وكانت أساليب الكشف والتحديد الكمي ل 5hmC أيضا المبلغ عنها47، بما في ذلك إيمونوهيستوتشيميستري13. تقنيات المناعي، التي تمكن من رصد التغيرات 5mC و 5hmC في نواة لتطوير قوي والخلايا بوستميتوتيك، ومفيدة للغاية لتحديد الكروماتين الديناميات في الموقع استجابة للتغيرات الخارجية أو الداخلية تؤثر على خلايا4،13،،من4849. بيد أن هذا النهج عرضه للتقليل من شأن مثلايشن الحمض النووي والتغيرات هيدروكسيميثيليشن بسبب الصعوبات التقنية، المرتبطة بالكشف عن التعديلات السيتوزين في التحضير النسيجي. وهذا يرجع إلى أن قواعد الحمض النووي نونبولار، بما في ذلك 5mC وتعديل 5hmC السيتوزين، مخفية داخل مركز الحلزون50الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل، وتتطلب فضحه. هذا تنطوي على تحديات خاصة في التحضير النسيجي المجمدة، التي قد تفقد بسرعة منظمة إعلامية من الأنسجة الأصلية عندما يتم تطبيق معاملة قاسية.
الشبكية الماوس نموذج ممتاز تشريح مساهمة مثلايشن الحمض النووي للتنمية العصبية والتوازن بوستميتوتيك. لا يوجد سوى 6 أنواع من الخلايا العصبية (فوتوريسيبتورس رود والمخروط، أماكريني، القطبين، خلايا العقدة وأفقي)، نوع واحد من الخلايا الدبقية (إطلاق مولر) وواحد نيوروبيثيليال الخلية النوع (ظهارة صباغ الشبكية)51. وأبلغ أنواع الخلايا الشبكية أنماط متميزة من الحمض النووي مثلايشن18،19، التي درست مؤخرا في قرار واحد-قاعدة1،5،9،12. ونحن مؤخرا ذكرت التطبيق إيمونوهيستوتشيميستري لتحديد نمط التوزيع داخل نواة خلايا الشبكية وتغيرات في نواة الشبكية الماوس الكبار، حيث تم إزالة جميع ميثيلترانسفيراسيس الحمض النووي الثلاثة باستهداف الشرطي 5mC 7-مقارنة بعدد من التقارير، حيث وجود مثلايشن الحمض النووي في خلايا الشبكية ويمكن اعتبار فقط إيجابية أو إشارة سلبية في هايبرميثيلاتيد الخلايا المبرمج تمر، تمكين النهج الذي نتبعه كشف الكروماتين محددة الترتيب داخل نواة الخلية الشبكية، التي نحن والعديد من المجموعات ذكرت ونوقش في وقت سابق5،،من67،18،،من1936 , 52-وهنا، يمكننا وصف تقنية المناعي (المدينة) للكشف عن 5mC و 5hmC في المجمدة مقاطع نسيجية بارافورمالدهيد--الثابتة في التفاصيل، فضلا عن إثبات البيانات التي كنا قادرين على إنتاج من تقريرنا الأصلي7 .

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>29G1/2 ULTRA-FINE</td><td>BD Biosciences</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmic scissor</td><td>Fine Science tools, Inc.&amp;nbsp;</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>RPICORP.com</td><td>195505</td><td></td></tr><tr><td>Microslide Superfrost plus</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagent&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscope Science</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Optical cutting compound (OCT)</td><td>VWR</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>6 N HCl</td><td>VWR analytical&amp;nbsp;</td><td>BDH7204-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl pH 8.3</td><td>Teknova</td><td>T1083</td><td></td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>5mC</td><td>Genway Biotech&amp;nbsp;</td><td>GWB-BD5190</td><td></td></tr><tr><td>5hmC</td><td>Active Motif</td><td>39791</td><td></td></tr><tr><td>LaminB1</td><td>Abcam</td><td>Ab16048</td><td></td></tr><tr><td>Cy2 AffiniPure Goat Ant-Rabbit IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-225-1444</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Goat Ant-Mouse IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-585-166</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MICRM HM 550</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>388114</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

immunohistochemical detection of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine in developing and postmitotic mouse retina

التخلق للتنمية الشبكية هو حقل بحث مدروسة، التي تبشر بتحقيق مستوى جديد من التفاهم حول الآليات لمجموعة متنوعة من الأمراض التنكسية الشبكية البشرية وتحديد نهج معاملة جديدة. يتم تنظيم بنية الشبكية الماوس النووية في نمطين من أنماط مختلفة: التقليدية ومقلوب. النمط التقليدي عالمي حيث heterochromatin مترجمة على هامش النواة، بينما يقيم euchromatin النشطة في الداخلية النووية. على النقيض من ذلك، النمط النووي المقلوب فريدة من نوعها لنواة خلية مستقبله قضيب البالغين heterochromatin يموضع للمركز النووي، حيث يوتشروماتين يتواجد في محيط النووية. ويلاحظ مثلايشن الحمض النووي أساسا في تشروموسينتيرس. مثلايشن الحمض النووي تعديل التساهمية دينامية على بقايا السيتوزين (5-ميثيلسيتوسيني، 5mC) من دينوكليوتيديس البد أن تكون أثرت في مناطق المروج العديد من الجينات. ثلاثة ميثيلترانسفيراسيس الحمض النووي (DNMT1 و DNMT3A و DNMT3B) المشاركة في مثلايشن الحمض النووي من خلال التنمية. الكشف عن 5mC مع تقنيات المناعي صعبة للغاية، الإسهام في التفاوت في النتائج، كما يتم إخفاء جميع قواعد الحمض النووي بما في ذلك قواعد 5mC تعديل داخل الحلزون الدنا مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل. ترسيم تفصيلية لتوزيع 5mC أثناء التطوير غير مفيدة للغاية. هنا، يمكننا وصف أسلوب استنساخه للكشف المناعي قوي 5mC وأخرى جينية الحمض النووي علامة 5-هيدروكسيميثيلسيتوسيني (5hmC)، الذي كولوكاليزيس مع الكروماتين "فتح"، ترانسكريبتيونالي النشطة في تطوير و الماوس بوستميتوتيك الشبكية.

لتحديد توزيع 5-ميثيلسيتوسيني (5mC) و 5-هيدروكسيميثيلسيتوسيني (5hmC) أثناء التنمية الشبكية وفي شبكية العين بوستميتوتيك، ونحن إيمونوستاينيد C57BL/6J الماوس الشبكية قسم من E16 و P15 و P0 P90 مع الأجسام المضادة المحددة إلى 5mC و 5hmC.
في E16 تلطيخ 5mC كان قويا في تشروموسينتيرس نواة الخلية بينما تلطيخ ضعيفا ولوحظ في نواة خلية كاملة (الشكل 1a). 5hmC تلطيخ مقتصرة على نواة الخلية وكان غائبا من تشروموسينتيرس (الشكل 1b).
في P0 الشبكية، وكان المترجمة إشارة 5mC إلى تشروموسينتيرس من نواة الخلية وهامش النووي (الشكل 2aوالسهم ورأس السهم). كما لاحظنا تلطيخ ضعيفة من 5mC بين تشروموسينتيرس نواة الخلية. إشارة 5hmC كان حاضرا بقوة في نواة الخلية باستثناء تشروموسينتيرس (الشكل 2). وجدنا أنوية أكثر ملطخة ب 5mC و 5hmC في طبقة نيوروبلاست الداخلية (إينبل) (الشكل 2 ج، الخط المنقط)
في P15 الشبكية، وجدنا تلطيخ قوية 5mC و 5hmC في الطبقة الخارجية النووية (ONL) والطبقة النووية الداخلية (المكتب) وطبقة خلايا العقدة (جكل) (الشكل 3). في ONL (فوتوريسيبتورس رود)، كانت إشارة 5mC موجودة في تشروموسينتيرس لنواة الخلية وهامش النووي (الأرقام 3a-3 ج، والجيل الثالث 3g). تم العثور على إشارة 5hmC في نواة خلية كاملة باستثناء تشروموسينتيرس (الأرقام 3d-3f). مجهر إلكتروني على الشبكية P15 يبين التوزيع للمجالات هيتيروتشروماتيك في نواة الخلية رود مشابهة لتلك الموجودة مع إشارة جسم 5mC (ح 3 أرقام و 3i).
تلطيخ 5mC في المكتب وجكل قوية في تشروموسينتيرس نواة الخلية وتلطيخ ضعيفة وقد لوحظ أيضا في نواة خلية كاملة (الأرقام 3j-3 لتر و 3r-3t). خلافا 5mC، وكان المترجمة إشارة 5hmC إلى نواة الخلية كلها باستثناء تشروموسينتيرس في المكتب وجكل (الأرقام م 3-3o و 3 وات 3u). لاحظنا قوية إشارة 5hmC على هامش جكل نواة الخلية.
في فوتوريسيبتورس رود الكبار، اقتصر إشارة 5mC تشروموسينتير وهامش النووي لنواة الخلية (الأرقام 4a-4 ج) بينما يقتصر إشارة 5hmc على هامش النووي (د 4 أرقام-4f).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig1.jpg"> الشكل 1. ترجمة 5-ميثيلسيتوسيني و 5-هيدروكسيميثيلسيتوسيني في الشبكية الماوس في الجنينية يوم 16. إيمونوستينينج C57BL/6J الشبكية مع الأجسام المضادة إلى 5mC (الأحمر، أ) و 5hmC (الخضراء، ب). في E16، 5mC إشارة قوية جداً في تشروموسينتيرس نواة الخلية وأيضا موجودة في نواة خلية كاملة في مستوى أدنى بكثير. تلطيخ 5hmC يقتصر حصرا على نواة الخلية. ويمثل الفريق ج 5mC المدمجة والصورة 5hmC. هي نواة كونتيرستينيد مع DAPI (الأزرق، ج). وتمثل insets تكبير منطقة سيظهر مع العلامة النجمية في الصور. شريط الحجم: 5 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig2.jpg"> الرقم 2. المناعي تلطيخ 5-ميثيلسيتوسيني وهيدروكسيميثيلسيتوسيني 5 في الشبكية الماوس في يوم الولادة 0. إيمونولابيلينج C57BL/6J الشبكية مع الأجسام المضادة إلى 5mC (الأحمر، أ) و 5hmC (الخضراء، ب). في P0 الشبكية، 5mC و 5hmC موجودة في طبقة نيوروبلاست الخارجي (أونبل) وطبقة نيوروبلاست الداخلية (إينبل). أ) إشارة 5mC موجود بقوة في تشروموسينتيرس (سهم) وهامش النووي لنواة الخلية (رأس السهم). ويلاحظ أيضا تلطيخ ضعيفة من 5mC ما بين تشروموسينتيرس نواة الخلية. ب) تلطيخ 5hmC يقتصر على نواة الخلية، ويلاحظ إشارة قوية في إينبل (الخط المنقط في لوحة ج). ويمثل الفريق ج 5mC المدمجة والصورة 5hmC. هي نواة كونتيرستينيد مع DAPI (الأزرق، ج). وتمثل insets تكبير منطقة سيظهر مع العلامة النجمية في الصور. شريط الحجم: 5 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig3.jpg"> الشكل 3. 5-ميثيلسيتوسيني 5-هيدروكسيميثيلسيتوسيني التوزيع وفي الشبكية الماوس عند الولادة يوم 15. إيمونوستينينج C57BL/6J الشبكية مع الأجسام المضادة--5mC و 5hmC (-ز، ي ص). في الطبقة الخارجية النووية (ONL) (فوتوريسيبتورس رود)، إشارة 5mC (أ) عادة ما يتزامن مع تشروموسينتيرس نواة الخلية (رأس السهم، ب) الأحمر، وأيضا يموضع على هامش النووي (سهم، ب). لوحة ب (أحمر) وجيم (رمادي) تمثل تكبير منطقة سيظهر مع العلامة النجمية في الصورة. إشارة 5hmC (الخضراء، د) تقتصر على نواة خلية كاملة باستثناء تشروموسينتيرس. ه الفريق (الأخضر) و (الرمادي) و تمثل تكبير منطقة سيظهر مع العلامة النجمية في دال صورة لوحة تمثل ز 5mC المدمجة والصورة 5hmC. هي نواة كونتيرستاينيد مع DAPI. لوحة ح، وانتقال المجهر الإلكتروني صورة نويات مستقبله في يوم الولادة 15 تبين توزيع المجالات هيتيروتشروماتيك. السهم الأسود في ح الفريق يشير إلى قضيب واحد مستقبله نواة توسيعه في الفريق الأول-رؤوس الأسهم الحمراء في لوحة وأشير إلى مجالات heterochromatic داخل نواة مستقبله رود بينما الأسهم الحمراء تشير إلى هيتيروتشروماتين في محيط النووية. في المكتب (ي-س) ونواة الخلية جكل (ص ص)، إشارة 5mC (أحمر) هو مترجم إلى تشروموسينتيرس الموجودة في المحيط وتلطيخ ضعف الكشف عن كما في بقية نواة الخلية. لوحة ك (أحمر) وأنا (رمادي) تمثل تكبير منطقة سيظهر مع العلامة النجمية في ي الصورة. (الأخضر) تلطيخ 5hmC في نواة الخلية المكتب وجكل تقتصر على نواة الخلية كلها. ملاحظة تلطيخ 5hmC قوية في محيط الخلايا جكل النووية. ف الفريق و x تمثل 5mC المدمجة والصورة 5hmC بينما تمثل لوحة س وص تكبير منطقة سيظهر مع العلامة النجمية في الصورة ف والعاشر على التوالي. هي نواة كونتيرستينيد مع DAPI. شريط الحجم: 5 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig4.jpg"> الشكل 4. 5-ميثيلسيتوسيني 5-هيدروكسيميثيلسيتوسيني التوزيع وفي نويات مستقبله رود C57BL/6J الماوس الشبكية في يوم الولادة 90. تلطيخ 5mC (أحمر،) موجود بقوة في تشروموسينتير في نواة الخلية وأيضا الحاضر ضعيفة في محيط النووية. لوحة ب (أحمر) وجيم (رمادي) تمثل تكبير منطقة سيظهر مع العلامة النجمية في الصورة. تلطيخ 5hmC (الخضراء، د) يقتصر حصرا على هامش النووي ه الفريق (الأخضر)، والتكبير و (رمادي) تمثل منطقة سيظهر مع العلامة النجمية في دال صورة الفريق يمثل ز 5mC المدمجة والصورة 5hmC مع الفريق ح التكبير للمنطقة التي تظهر مع النجمة في الصورة هي كونتيرستاينيد نوى زاي مع DAPI (أزرق). شريط الحجم: 5 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina at JoVE.com

Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

الكشف المناعي 5-ميثيلسيتوسيني وهيدروكسيميثيلسيتوسيني 5 في تطوير والشبكية الماوس بوستميتوتيك

والهدف من هذا التقرير وصف البروتوكول للكشف المناعي قوية من علامات جينية، 5-ميثيلسيتوسيني (5mC) و 5-هيدروكسيميثيلسيتوسيني (5hmC) في تطوير وبوستميتوتيك الماوس الشبكية.

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

immunohistochemical-detection-5-methylcytosine-5

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.9K Views.  BioTime, Inc. والهدف من هذا التقرير وصف البروتوكول للكشف المناعي قوية من علامات جينية، 5-ميثيلسيتوسيني (5mC) و 5-هيدروكسيميثيلسيتوسيني (5hmC) في تطوير وبوستميتوتيك الماوس الشبكية.

Video: Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of enzymatic oxidation of 5mC to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) as well as detection of N6-methyladenine (6mA) in the DNA of multicellular organisms provided additional degrees of complexity to the epigenetic research. According to a growing body of experimental evidence, these novel DNA modifications may play specific roles in different cellular and developmental processes. Importantly, as some of these marks (e. g. 5hmC, 5fC and 5caC) exhibit tissue- and developmental stage-specific occurrence in vertebrates, immunochemistry represents an important tool allowing assessment of spatial distribution of DNA modifications in different biological contexts. Here the methods for computational analysis of DNA modifications visualized by immunostaining followed by confocal microscopy are described. Specifically, the generation of 2.5 dimension (2.5D) signal intensity plots, signal intensity profiles, quantification of staining intensity in multiple cells and determination of signal colocalization coefficients are shown. Collectively, these techniques may be operational in evaluating the levels and localization of these DNA modifications in the nucleus, contributing to elucidating their biological roles in metazoans.

Newly discovered oxidized forms of 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) may represent distinct DNA modifications with unique functional roles. Here a semi-quantitative workflow for visualization of oxi-mCs' spatial distribution, signal intensity profiling and colocalization is described.

إيمونوستينينج لإدخال تعديلات على الحمض النووي: التحليل الحسابي للصور [كنفوكل]

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Genetics

High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue

DNA hydroxymethylation is a long known modification of DNA, but has recently become a focus in epigenetic research. Mammalian DNA is enzymatically modified at the 5th carbon position of cytosine (C) residues to 5-mC, predominately in the context of CpG dinucleotides. 5-mC is amenable to enzymatic oxidation to 5-hmC by the Tet family of enzymes, which are believed to be involved in development and disease. Currently, the biological role of 5-hmC is not fully understood, but is generating a lot of interest due to its potential as a biomarker. This is due to several groundbreaking studies identifying 5-hydroxymethylcytosine in mouse embryonic stem (ES) and neuronal cells. Research techniques, including bisulfite sequencing methods, are unable to easily distinguish between 5-mC and 5-hmC . A few protocols exist that can measure global amounts of 5-hydroxymethylcytosine in the genome, including liquid chromatography coupled with mass spectrometry analysis or thin layer chromatography of single nucleosides digested from genomic DNA. Antibodies that target 5-hydroxymethylcytosine also exist, which can be used for dot blot analysis, immunofluorescence, or precipitation of hydroxymethylated DNA, but these antibodies do not have single base resolution.In addition, resolution depends on the size of the immunoprecipitated DNA and for microarray experiments, depends on probe design. Since it is unknown exactly where 5-hydroxymethylcytosine exists in the genome or its role in epigenetic regulation, new techniques are required that can identify locus specific hydroxymethylation. The EpiMark 5-hmC and 5-mC Analysis Kit provides a solution for distinguishing between these two modifications at specific loci. The EpiMark 5-hmC and 5-mC Analysis Kit is a simple and robust method for the identification and quantitation of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine within a specific DNA locus. This enzymatic approach utilizes the differential methylation sensitivity of the isoschizomers MspI and HpaII in a simple 3-step protocol. Genomic DNA of interest is treated with T4-BGT, adding a glucose moeity to 5-hydroxymethylcytosine. This reaction is sequence-independent, therefore all 5-hmC will be glucosylated; unmodified or 5-mC containing DNA will not be affected. This glucosylation is then followed by restriction endonuclease digestion. MspI and HpaII recognize the same sequence (CCGG) but are sensitive to different methylation states. HpaII cleaves only a completely unmodified site: any modification (5-mC, 5-hmC or 5-ghmC) at either cytosine blocks cleavage. MspI recognizes and cleaves 5-mC and 5-hmC, but not 5-ghmC. The third part of the protocol is interrogation of the locus by PCR. As little as 20 ng of input DNA can be used. Amplification of the experimental (glucosylated and digested) and control (mock glucosylated and digested) target DNA with primers flanking a CCGG site of interest (100-200 bp) is performed. If the CpG site contains 5-hydroxymethylcytosine, a band is detected after glucosylation and digestion, but not in the non-glucosylated control reaction. Real time PCR will give an approximation of how much hydroxymethylcytosine is in this particular site. In this experiment, we will analyze the 5-hydroxymethylcytosine amount in a mouse Babl/C brain sample by end point PCR.

The EpiMark 5-hmC and 5-mC Analysis Kit can be used to analyze and quantitate 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine within a spe cific locus. The kit distinguishes 5-mC from 5-hmC by the addition of glucose to the hydroxyl group of 5-hmC via an enzymatic reaction utilizing &beta;-glucosyltransferase (T4-BGT). When 5-hmC occurs In the context of CCGG, this modification converts a cleavable MspI site to a non-cleavable site.

الحساسية العالية 5 - hydroxymethylcytosine كشفها في أنسجة المخ BALB / C

DNA hydroxymethylation is a long known modification of DNA, but has recently become a focus in epigenetic research.   Mammalian DNA is enzymatically ...

Neuroscience

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenesis is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting of new blood vessels from a pre-existing vessel network. Angiogenesis plays a key role not only in normal development of organs and tissues, but also in many diseases in which blood vessel formation is dysregulated, such as cancer, blindness and ischemic diseases. In adult life, blood vessels are generally quiescent so angiogenesis is an important target for novel drug development to try and regulate new vessel formation specifically in disease. In order to better understand angiogenesis and to develop appropriate strategies to regulate it, models are required that accurately reflect the different biological steps that are involved. The mouse neonatal retina provides an excellent model of angiogenesis because arteries, veins and capillaries develop to form a vascular plexus during the first week after birth. This model also has the advantage of having a two-dimensional (2D) structure making analysis straightforward compared with the complex 3D anatomy of other vascular networks. By analyzing the retinal vascular plexus at different times after birth, it is possible to observe the various stages of angiogenesis under the microscope. This article demonstrates a straightforward procedure for analyzing the vasculature of a mouse retina using fluorescent staining with isolectin and vascular specific antibodies.

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

The neonatal murine retina provides a well characterized physiological model of angiogenesis, which permits investigations of the roles of different genes or drugs that modulate angiogenesis in an in vivo context. Immunofluorescent staining to accurately visualize the vascular plexus is pivotal to the success of these types of studies.

كله جبل تلوين مناعي للشبكية الفأر حديثي الولادة المعنية بالتحقيق في الأوعية الدموية<em&gt; في الجسم الحي</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

التصوير حية من الانقسام في تطوير الجنينية الماوس اللحاء

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical role in early embryonic development. Enzymatic modifications drive active methylation and demethylation of cytosine into 5-methylcytosine (5-mC) and subsequent oxidation of 5-mC into 5-hydroxymethylcytosine, 5-formylcytosine, and 5-carboxylcytosine. Epigenetic reprogramming is a critical period during in utero development, and maternal exposure to chemicals has the potential to reprogram the epigenome within offspring. This can potentially cause adverse outcomes such as immediate phenotypic consequences, long-term effects on adult disease susceptibility, and transgenerational effects of inherited epigenetic marks. Although bisulfite-based sequencing enables investigators to interrogate cytosine methylation at base-pair resolution, sequencing-based approaches are cost-prohibitive and, as such, preclude the ability to monitor cytosine methylation across developmental stages, multiple concentrations per chemical, and replicate embryos per treatment. Due to the ease of automated in vivo imaging, genetic manipulations, rapid ex utero development time, and husbandry during embryogenesis, zebrafish embryos continue to be used as a physiologically intact model for uncovering xenobiotic-mediated pathways that contribute to adverse outcomes during early embryonic development. Therefore, using commercially available 5-mC-specific antibodies, we describe a cost-effective strategy for rapid and efficient spatiotemporal monitoring of cytosine methylation within individual, intact zebrafish embryos by leveraging whole-mount immunohistochemistry, automated high-content imaging, and efficient data processing using programming language prior to statistical analysis. To current knowledge, this method is the first to successfully detect and quantify 5-mC levels in situ within zebrafish embryos during early development. The method enables the detection of DNA methylation within the cell mass and also has the ability to detect cytosine methylation of yolk-localized maternal mRNAs during the maternal-to-zygotic transition. Overall, this method will be useful for the rapid identification of chemicals that have the potential to disrupt cytosine methylation in situ during epigenetic reprogramming.

This paper describes a protocol for the rapid and efficient spatiotemporal monitoring of normal and aberrant cytosine methylation within intact zebrafish embryos.

المراقبة الزمانية المكانية السريعة والفعالة لمثيلة السيتوزين الطبيعية والشاذة داخل أجنة الزرد السليمة

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

انتقائية لقطة من hydroxymethylcytosine-5 من الحمض النووي الجيني

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Biology

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic mechanisms have been intensively studied. 5-hydroxymethylcytosine displays dynamic features during embryonic and postnatal development of the brain, plays a regulatory function in gene expression, and is involved in multiple neurological disorders. Here, we describe the detailed methods including immunofluorescence staining and&#160;DNA dot-blot to detect 5-hydroxymethylcytosine in cultured cells and brain tissues of mouse.

Here, we present a protocol to detect 5-hydroxymethylcytosine in cells and brain tissues, utilizing immunofluorescence staining and DNA dot-blot methods.

الكشف عن 5-هيدروكسي ميثيل سيتوسين في الخلايا الجذعية العصبية وعقول الفئران

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC) are the recently discovered modified cytosine bases produced by enzymatic oxidation of 5mC, whose biological functions remain relatively obscure. A number of approaches ranging from biochemical to antibody based techniques have been employed to study the genomic distribution and global content of these modifications in various biological systems. Although some of these approaches can be useful for quantitative assessment of these modified forms of 5mC, most of these methods do not provide any spatial information regarding the distribution of these DNA modifications in different cell types, required for correct understanding of their functional roles. Here we present a highly sensitive method for immunochemical detection of the modified forms of cytosine. This method permits co-detection of these epigenetic marks with protein lineage markers and can be employed to study their nuclear localization, thus, contributing to deciphering their potential biological roles in different experimental contexts.

Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.

الكشف عن أشكال معدلة من السيتوزين عن طريق الحساسة المناعية

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. ...

Cryosectioning and Immunostaining of Mouse Retina

Tissue sectioning and immunohistochemistry are essential techniques in histological and pathological studies of retinal diseases using animal models. These methods enable detailed examinations of tissue morphologies and the localization of specific proteins within the tissue, which provide valuable insights into disease processes and mechanisms. Mice are the most widely used model for this purpose. However, because mouse eyeballs are small and mouse retinas are extremely delicate tissues, obtaining high-quality retinal sections and immunostaining images from mouse eyeballs is typically challenging. This study describes an improved protocol for cryosectioning mouse retinas and performing immunohistochemistry. An essential point of this protocol involves coating the eyeball with a layer of super glue, which prevents deformation of the eyeballs during the processes of cornea removal, lens extraction, and embedding. This step ensures the integrity of retinal morphologies is well preserved. This protocol highlights critical technical considerations and optimization strategies for consistently producing high-quality retinal sections and achieving excellent immunostaining results.

A protocol for preparing mouse retinal cryosections and performing immunostaining on photoreceptors is described. This article enables researchers to consistently produce mouse retinal frozen sections with well-preserved morphology and high-quality immunostaining results.

التشريح بالتبريد والتلوين المناعي لشبكية العين في الفأر

Tissue sectioning and immunohistochemistry are essential techniques in histological and pathological studies of retinal diseases using animal models. ...

5-Methylcytosine Dot Blot to Determine the Extent of DNA Methylation

Start this procedure by denaturing the isolated DNA in 0.1 molar sodium hydroxide for 10 minutes at 95 degrees Celsius. Neutralize the DNA with 1 molar ammonium acetate on ice, and then dilute two-fold with double-distilled water.
The most critical step in the dot blot is the spotting of the samples onto the membrane, do it slowly, and carefully. Try to minimize each spotted area to 3 to 4 millimeters in diameter.
Using a narrow-mouth pipette tip, carefully spot 2 microliters of the serial diluted genomic DNA onto a positively-charged nylon membrane at the center of the grid. Blot the membrane at 80 degrees Celsius for 30 minutes. Next, block the non-specific antibody binding sites by soaking the membrane in 5% BSA in TBST in a 10-centimeter Petri dish for 1 hour at room temperature with gentle shaking.
After 1 hour, wash the membrane three times in TBST for 5 minutes each time. Incubate the membrane with a mouse anti-5-methylcytosine monoclonal antibody in TBST at 4 degrees Celsius overnight. On the following day, wash the membrane three times in TBST for 5 minutes each time.
Then, incubate with a secondary antibody &#8212; horseradish peroxidase-conjugated sheep anti-mouse immunoglobulin G in TBST for one hour at room temperature. After washing the membrane in TBST as before, add the enzyme substrate to the membrane, and incubate for 5 to 10 minutes. Finally, visualize the secondary antibody signal using a chemiluminescence kit according to the manufacturer&#39;s instructions.

الكشف المناعي 5-ميثيلسيتوسيني وهيدروكسيميثيلسيتوسيني 5 في تطوير والشبكية الماوس بوستميتوتيك

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video