وأيد هذه الدراسة في جزء من المعاهد الوطنية للصحة (CH GM071440 لوNS051630/MH076090/MH078972 إلى PJ).

1. الجينومية DNA تجزئة جزء الحمض النووي الجيني باستخدام صوتنة إلى مجموعة مناسبة الحجم المطلوب لمنصة تسلسل الجينوم على نطاق. (ونحن عادة يصوتن لشركة بريتيش بتروليوم 300 ~.) تحقق من حجم توزيع الحمض النووي الجيني مجزأة على 1٪ الاغاروز هلام (الشكل 1). 2. إعداد DNA تحديد المبالغ بدءا DNA يعتمد على وفرة من مؤسسة حمد الطبية-5 في الحمض النووي الجيني. منذ 5-مؤسسة حمد الطبية مستويات تتفاوت تفاوتا كبيرا في أنواع الأنسجة المختلفة، بدءا كميات DNA تعتمد على مستويات 5-مؤسسة حمد الطبية من العينات. يرجى الرجوع إلى الجدول رقم 1 للحصول على أمثلة. 3. β-GT حفز رد الفعل (الجلوكوز نقل رد فعل) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج من pipetting الخليط على النحو المفصل في الجدول 2 واحتضان في حمام مائي 37 ° C لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحضانة، وتنظيف التفاعل مع كيت QIAquick إزالة النكليوتيد، وذلك باستخدام 10 ميكروغرام من الحمض النووي فيالعمود. أزل مع 30 ميكرولتر المياه في عمود والجمع. </li></ol> 4. رد الفعل Biotinylation (انقر الكيمياء) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة DBCO-SS-PEG3-البيوتين حل المتقارن العمل (1 ملم) في الحل DNA مزال (من الخطوة 3) إلى تركيز النهائي من 150 ميكرومتر (أي، 5 ميكرولتر من حل العمل بنسبة 30 ميكرولتر حل DNA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج من pipetting واحتضان في حمام مائي 37 ° C لمدة 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف التفاعل مع كيت QIAquick إزالة النوكليوتيدات. المثل الأعلى هو مجموع حجم شطف 100 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس كمية الحمض النووي استرداد باستخدام مقياس الطيف ميكروليتر (على سبيل المثال، NanoDrop). </li></ol> 5. القبض على 5-DNA التي تحتوي على مؤسسة حمد الطبية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل 50 ميكرولتر من Streptavidin Dynabeads C1 MyOne 3 مرات مع 1 مل من 1X B &amp; W العازلة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. فصل حبات مع موقف المغناطيسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حجم مساو من 2X B &amp; W عازلة لD والمعقدة البيروكسيديز تعافىNA (100 UL) إلى الخرز غسلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لطيف مع التناوب على محور دوار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل حبات مع موقف المغناطيسي وغسل حبات 3 مرات مع 1 مل من 1X B &amp; W العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أزل الحمض النووي عن طريق احتضان حبات في 100 ميكرولتر من DTT الطازجة 50 مم لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة لطيف مع التناوب على محور دوار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل حبات مع موقف المغناطيسي. نضح في وشاطف تحميل على عمود 6 مايكرو الحيوية سبين وفقا لتعليمات تصنيع لإزالة DTT. والهدف هو DNA في حل الآن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية DNA مزال من الخطوة السابقة من MinElute QIAGEN كيت تنقية DNA PCR وأزل في 10 ميكرولتر من العازلة EB. تحديد DNA باستخدام مقياس التألق و qubit، أو إذا NanoDrop تركيز أعلى من 20 نانوغرام / أيار. الحمض النووي جاهز للالمصب تسلسل الجينوم على نطاق إعداد المكتبة. </li></ol> 6. ممثل النتائج إذا يا جودةو الحمض النووي الجيني عالية، والمحاصيل الانتعاش بعد نموذجية GT-β وردود الفعل هي biotinylation ~ 60-70٪. ومع ذلك، فإن كفاءة التقاط تتفاوت تفاوتا كبيرا مع أنواع الأنسجة المختلفة اعتمادا على مستويات 5-مؤسسة حمد الطبية من العينات. عادة، وكفاءة لالتقاط الحمض النووي الجيني الدماغ ~ 4-9٪، وفي بعض الحالات القصوى، وكفاءة قد تصل إلى 12٪. لخلايا ES، وكفاءة التقاط متوسط ​​~ 2-4٪، وعلى النقيض من 0.5٪ ~ للخلايا الجذعية العصبية. أقل كفاءة رأيناه حتى الآن كان لمن الحمض النووي الجيني الخلايا السرطانية. جميع DNA المخصب جاهز للمعيار الجيل المقبل من إعداد بروتوكولات المكتبة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا أن القبض على DNA أن تستخدم قالب في الوقت الحقيقي PCR للكشف عن تخصيب بعض شظايا مقارنة الحمض النووي المدخلات، وإذا كان الاشعال ذات الصلة المتاحة. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/4441/4441fig1.jpg" /> الشكل 1. Sonicated الحمض النووي الجيني الإنسان شظايا فيوsonicated 1٪ الاغاروز هلام. 10 ميكروغرام من الحمض النووي الجيني معزولة عن خلايا الجذع الإنسان في 120 ميكرولتر من 1X العازلة TE باستخدام جهاز صوتنة (Covaris). بعد صوتنة، تم تحميل 2 ميكرولتر من الحمض النووي على جل الاغاروز sonicated 1٪ باستخدام 100 علامة بي بي DNA لمقارنة أحجام شظايا الحمض النووي sonicated. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> عنصر </td><td> حجم </td><td> تركيز النهائي </td></tr><tr><td> ماء </td><td> ميكرولتر _ </td><td></td></tr><tr><td> 10 X العازلة رد فعل β-GT </td><td> 2 ميكرولتر </td><td> 1 X </td></tr><tr><td> تصل إلى 10 ميكروغرام الحمض النووي الجيني </td><td> ميكرولتر _ </td><td> ما يصل إلى 500 نانوغرام / ميكرولتر </td></tr><tr><td> UDP-6-3-N GLC (3 ملم) </td><td> 0،67 ميكروليتر </td><td> 100 ميكرومتر </td></tr><tr><td> β-GT (40 ميكرومتر) </td><td> 1 ميكرولتر </td><td> 2 ميكرومتر </td></tr><tr><td> اجمالى حجم التداول </td><td> 20 ميكرولتر </TD&gt; <td></td></tr></tbody></table> ط) للأنسجة الحمض النووي الجيني (الأعلى 5-مؤسسة حمد الطبية المحتوى&gt; 0.1٪) <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> عنصر </td><td> حجم </td><td> تركيز النهائي </td></tr><tr><td> ماء </td><td> ميكرولتر _ </td><td></td></tr><tr><td> 10 X العازلة رد فعل β-GT </td><td> 10 ميكرولتر </td><td> 1 X </td></tr><tr><td> ما يصل الى 20 ميكروغرام الحمض النووي الجيني </td><td> ميكرولتر _ </td><td> ما يصل إلى 500 نانوغرام / ميكرولتر </td></tr><tr><td> UDP-6-N3-GLC (3 ملم) </td><td> 1،33 ميكروليتر </td><td> 100 ميكرومتر </td></tr><tr><td> β-GT (40 ميكرومتر) </td><td> 2 ميكرولتر </td><td> 2 ميكرومتر </td></tr><tr><td> اجمالى حجم التداول </td><td> 40 ميكرولتر </td><td></td></tr></tbody></table> الثاني) للحصول على الخلايا الجذعية الجينية DNA (متوسط ​​5-مؤسسة حمد الطبية محتوى ~ 0.05٪) <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> عنصر </td><td> حجم </td><td> تركيز النهائي </td></tr><tr><td> ماء </td><td> ميكرولتر _ </td><td></td></tr><tr><td> 10 X العازلة رد فعل β-GT </td><td> 10 ميكرولتر </td><td> 1 X </td></tr><tr><td> تصل إلى 50 ميكروغرام الحمض النووي الجيني </td><td> ميكرولتر _ </td><td> ما يصل إلى 500 نانوغرام / ميكرولتر </td></tr><tr><td> UDP-6-N3-GLC (3 ملم) </td><td> 3،33 ميكروليتر </td><td> 100 ميكرومتر </td></tr><tr><td> β-GT (40 ميكرومتر) </td><td> 5 ميكرولتر </td><td> 2 ميكرومتر </td></tr><tr><td> اجمالى حجم التداول </td><td> 100 ميكرولتر </td><td></td></tr></tbody></table> ثالثا) بالنسبة لسرطان الخلية الحمض النووي الجيني (الأقل 5-مؤسسة حمد الطبية محتوى ~ 0.01٪) الجدول 1. أمثلة على كميات من المدخلات وردود الفعل DNA وضع العلامات باستخدام عينات مع مستويات مختلفة 5-مؤسسة حمد الطبية من خلال طريقة وضع العلامات الكيميائية انتقائية. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> عينة </td><td> 5-مستوى مؤسسة حمد الطبية </strong&gt; </td><td> بدءا DNA (ميكروغرام) </td><td> الانتعاش بعد وضع العلامات (المدخلات إلى الخرز) (ميكروغرام) </td><td> الانتعاش العائد </td><td> المنسدلة DNA (NG) </td><td> المنسدلة تسفر </td></tr><tr><td> الكبار الماوس المخيخ </td><td> 0.4٪ </td><td> 10 </td><td> 7.5 </td><td> 75٪ </td><td> 236 </td><td> 3.1٪ </td></tr><tr><td> بعد الولادة المخيخ يوم 7 الماوس </td><td> 0.1٪ </td><td> 11 </td><td> 9 </td><td> 82٪ </td><td> 140 </td><td> 1.6٪ </td></tr><tr><td> ES الماوس الخلية E14 </td><td> 0.05٪ </td><td> 60 </td><td> 42 </td><td> 70٪ </td><td> 350 </td><td> 0.8٪ </td></tr></tbody></table> الجدول 2. نتائج ممثلة من أنسجة وخلايا مخ الفأر ES.

<ol>
	<li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+gene+expression:+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals.">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nat. Genet. , 245-254 (2003).</li><li>Ito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Tet+proteins+in+5mC+to+5hmC+conversion,+ES-cell+self-renewal+and+inner+cell+mass+specification.">Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification.</a> Nature. 466, 1129-1133 (2010).</li><li>Tahiliani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1.">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324, 930-935 (2009).</li><li>Kriaucionis, S., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+DNA+base+5-hydroxymethylcytosine+is+present+in+Purkinje+neurons+and+the+brain.">The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain.</a> Science. 324, 929-930 (2009).</li><li>Ko, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+hydroxylation+of+5-methylcytosine+in+myeloid+cancers+with+mutant+TET2.">Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2.</a> Nature. 468, 839-843 (2010).</li><li>Koh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet1+and+tet2+regulate+5-hydroxymethylcytosine+production+and+cell+lineage+specification+in+mouse+embryonic+stem+cells.">Tet1 and tet2 regulate 5-hydroxymethylcytosine production and cell lineage specification in mouse embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 200-213 (2011).</li><li>Iqbal, K., Jin, S. G., Pfeifer, G. P., Szabo, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+the+paternal+genome+upon+fertilization+involves+genome-wide+oxidation+of+5-methylcytosine.">Reprogramming of the paternal genome upon fertilization involves genome-wide oxidation of 5-methylcytosine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 3642-3647 (2011).</li><li>Wossidlo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Hydroxymethylcytosine+in+the+mammalian+zygote+is+linked+with+epigenetic+reprogramming.">5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming.</a> Nat. Commun. 2, 241 (2011).</li><li>Gu, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Tet3+DNA+dioxygenase+in+epigenetic+reprogramming+by+oocytes.">The role of Tet3 DNA dioxygenase in epigenetic reprogramming by oocytes.</a> Nature. 477, 606-610 (2011).</li><li>Dawlaty, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet1+is+dispensable+for+maintaining+pluripotency+and+its+loss+is+compatible+with+embryonic+and+postnatal+development.">Tet1 is dispensable for maintaining pluripotency and its loss is compatible with embryonic and postnatal development.</a> Cell Stem Cell. 9, 166-175 (2011).</li><li>Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+behaviour+of+5-hydroxymethylcytosine+in+bisulfite+sequencing.">The behaviour of 5-hydroxymethylcytosine in bisulfite sequencing.</a> PLoS One. 5, e8888 (2010).</li><li>Song, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+chemical+labeling+reveals+the+genome-wide+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine.">Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nat. Biotechnol. 29, 68-72 (2011).</li><li>Pastor, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine+in+embryonic+stem+cells.">Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells.</a> Nature. 473, 394-397 (2011).</li><li>Matarese, F., Pau, C. a. r. r. i. l. l. o. -. d. e. S. a. n. t. a., E, ., Stunnenberg, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Hydroxymethylcytosine:+a+new+kid+on+the+epigenetic+block.">5-Hydroxymethylcytosine: a new kid on the epigenetic block.</a> Mol. Syst. Biol. 7, 562 (2011).</li><li>Szwagierczak, A., Bultmann, S., Schmidt, C. S., Spada, F., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+enzymatic+quantification+of+5-hydroxymethylcytosine+in+genomic+DNA.">Sensitive enzymatic quantification of 5-hydroxymethylcytosine in genomic DNA.</a> Nucleic Acids Res. 38, 181 (2010).</li><li>Terragni, J., Bitinaite, J., Zheng, Y., Pradhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterization+of+recombinant+&#946;-glucosyltransferase+and+analysis+of+global+5-hydroxymethylcytosine+in+unique+genomes.">Biochemical characterization of recombinant &#946;-glucosyltransferase and analysis of global 5-hydroxymethylcytosine in unique genomes.</a> Biochemistry. , (2012).</li><li>Rusmintratip, V., Sowers, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unexpectedly+high+excision+capacity+for+mispaired+5-hydroxymethyluracil+in+human+cell+extracts.">An unexpectedly high excision capacity for mispaired 5-hydroxymethyluracil in human cell extracts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14183-14187 (2000).</li><li>Globisch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine+and+search+for+active+demethylation+intermediates.">Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates.</a> PLoS One. 5, e15367 (2010).</li><li>Yildirim, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mbd3/NURD+Complex+Regulates+Expression+of+5-Hydroxymethylcytosine+Marked+Genes+in+Embryonic+Stem+Cells.">Mbd3/NURD Complex Regulates Expression of 5-Hydroxymethylcytosine Marked Genes in Embryonic Stem Cells.</a> Cell. 147, 1498-1510 (2011).</li><li>Szulwach, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+5-hydroxymethylcytosine+into+the+epigenomic+landscape+of+human+embryonic+stem+cells.">Integrating 5-hydroxymethylcytosine into the epigenomic landscape of human embryonic stem cells.</a> PLoS Genet. 7, e1002154 (2011).</li><li>Szulwach, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-hmC-mediated+epigenetic+dynamics+during+postnatal+neurodevelopment+and+aging.">5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging.</a> Nat. Neurosci. 14, 1607-1616 (2011).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

5-hydroxymethylcytosine (5-مؤسسة حمد الطبية) هي التي تم تحديدها مؤخرا الحاضر التعديل جينية في كميات كبيرة في بعض أنواع خلايا الثدييات. طريقة المقدمة هنا هو لتحديد توزيع الجينوم على نطاق مؤسسة حمد الطبية-5. نستخدم عاثية T4-β ناقلة الغلوكوزيل لنقل الجلوكوز إلى شاردة الهندسة يحتوي عل...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم </td><td> شركة </td><td> كتالوج # </td><td> تعليق </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> الكواشف </td></tr><tr><td> 5M كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) </td><td> Promega </td><td> V4221 </td><td></td></tr><tr><td> 0.5M حمض pH8.0 Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) </td><td> Promega </td><td> V4231 </td><td></td></tr><tr><td> 1M Trizma قاعدة (تريس) pH7.5 </td><td> إينفيتروجن </td><td> 15567-027) </td><td></td></tr><tr><td> HEPES 1M، pH7.4 </td><td> إينفيتروجن </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> كلوريد المغنيسيوم (MgCl 2) 1M </td><td> Ambion </td><td> AM9530G </td><td></td></tr><tr><td> ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) </td><td> سيجما </td><td> D8418 </td><td></td></tr><tr><td> توين 20 </td><td> فيشر BioReagents </td><td> BP337-100 </td><td></td></tr><tr><td> DBCO-SS-PEG3-البيوتين المتقارن </td><td> انقر فوق أدوات الكيمياء </td><td> A112P3 </td><td></td></tr><tr><td> 1،4-Dithiothreitol، عالى النقاء (DTT) Superpure </td><td> إينفيتروجن </td><td> 15508-013 </td><td></td></tr><tr><td> QIAquick كيت إزالة النكليوتيد </td><td> QIAGEN </td><td> 28304 </td><td></td></tr><tr><td> الدقيقة الحيوية سبين 6 عمود </td><td> بيو راد </td><td> 732-6222 </td><td></td></tr><tr><td> Dynabeads MyOne </td><td> إينفيتروجن </td><td> 650-01 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidin C1 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> QIAGEN تنقية PCR MinElute كيت </td><td> QIAGEN </td><td> 28004 </td><td></td></tr><tr><td> عالى النقاء الاغاروز </td><td> إينفيتروجن </td><td> 16500500 </td><td></td></tr><tr><td> UDP-6-3-N الجلوكوز </td><td> نشط الحافز </td><td> 55013 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> خميرة </td></tr><tr><td> β-ناقلة الغلوكوزيل (β-GT) </td><td> نيو انغلاند بيولاب </td><td> M0357 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> معدات </td></tr><tr><td> صوتنة الجهاز </td><td> Covaris </td><td></td><td></td></tr><tr><td> سطح المكتب الطرد المركزي </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ماء الحمام </td><td> فيشر العلمية </td><td></td><td></td></tr><tr><td> جهاز تشغيل هلام </td><td> بيو راد </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop1000 </td><td> الحرارية العلمية </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Labquake أنبوب شاكر </td><td> Barnstead </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Labquake أنبوب شاكر </td><td> Thermolyne </td><td></td><td></td></tr><tr><td> الفصل المغناطيسي حامل </td><td> Promega </td><td> Z5342 </td><td></td></tr><tr><td> و qubit 2،0 مقياس التألق </td><td> إينفيتروجن </td><td></td&gt; <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> الإعداد كاشف 10 X β-GT رد الفعل المخزن المؤقت (HEPES 500 مم درجة الحموضة 7.9، 250 ملم MgCl 2) 2 X ضم وتجليد والغسيل (B &amp; W) العازلة (10 ملي تريس درجة الحموضة 7.5، 1 ملم EDTA، 2 M كلوريد الصوديوم، توين 0.02٪ 20) . </td></tr></tbody></table>

selective capture of 5-hydroxymethylcytosine from genomic dna

5-ميثيل سيتوزين (5-MC) ~ يشكل 2-8٪ من إجمالي cytosines في الحمض النووي الجيني الإنسان ويؤثر على مجموعة واسعة من الوظائف البيولوجية، بما في ذلك التعبير الجيني، وصيانة سلامة الجينوم، يطبع الوالدين، تعطيل كروموسوم X-، وتنظيم التنمية، والشيخوخة، والسرطان 1. مؤخرا، تم اكتشاف وجود MC-5 أكسدة، 5-hydroxymethylcytosine (5-مؤسسة حمد الطبية)، في خلايا الثدييات، وخاصة في الخلايا الجنينية (ES) والخلايا العصبية الجذعية 2-4. يتم إنشاء مؤسسة حمد الطبية من قبل 5-5-أكسدة MC يحفزه TET الأسرة الحديد (II) / α-كيتوغلوتارات التي تعتمد على dioxygenases 2، 3. ويقترح 5-مؤسسة حمد الطبية للمشاركة في الحفاظ على الخلايا الجنينية (MES) الجذعية، تكون الدم العادي والأورام الخبيثة، واقحة التنمية 2، 5-10. من أجل فهم أفضل وظيفة مؤسسة حمد الطبية-5، وهو نظام التسلسل موثوق بها ومباشرة أمر ضروري. يمكن التسلسل بيسلفيت التقليدية لا يميز مؤسسة حمد الطبية 5-5-MC من 11 </sup&gt;. لكشف من مؤسسة حمد الطبية البيولوجيا-5، وضعنا نهجا الكيميائية كفاءة عالية وانتقائية لتسمية والتقاط 5-مؤسسة حمد الطبية، والاستفادة من انزيم عاثية يضيف شاردة الجلوكوز لمؤسسة حمد الطبية على وجه التحديد-5 12. نحن هنا وصف بسيط من خطوتين الداخلي لوضع العلامات الكيميائية الانتقائي لمؤسسة حمد الطبية-5. في خطوة وضع العلامات الأولى، هو المسمى في مؤسسة حمد الطبية 5-DNA الجيني مع حفز-6-أزيد من الجلوكوز GT-β، وهو من ناقلة الغلوكوزيل عاثية T4، في الطريقة التي ينقل 6 أزيد-الجلوكوز لمؤسسة حمد الطبية-5 من معدلة العامل المساعد، UDP-6-N3-GLC (6-N3UDPG). في biotinylation الثانية، الخطوة، تم إرفاق رابط ثاني كبريتيد البيوتين إلى مجموعة من الكيمياء أزيد فوق. كل الخطوات هي محددة للغاية وفعالة، مما يؤدي إلى استكمال وضع العلامات بغض النظر عن وفرة من مؤسسة حمد الطبية في المناطق-5 الجينومية وإعطاء خلفية منخفضة للغاية. بعد biotinylation من مؤسسة حمد الطبية-5، ثم يتم شظايا الحمض النووي 5-مؤسسة حمد الطبية المحتوية على انتقائي القبضباستخدام الخرز streptavidin بطريقة الكثافة مستقلة. يمكن استخدام الناتج مؤسسة حمد الطبية 5-التخصيب شظايا الحمض النووي لتحاليل المصب، بما في ذلك الجيل القادم التسلسل. وضع العلامات لدينا انتقائية وبروتوكول القبض يضفي حساسية عالية، تنطبق على أي مصدر من الحمض النووي الجيني مع الكميات المتوفرة من مؤسسة حمد الطبية 5-متغير / متنوعة. على الرغم من أن الغرض الرئيسي من هذا البروتوكول هو تطبيقه المصب (أي.، الجيل التالي من التسلسل لرسم توزيع 5-مؤسسة حمد الطبية في الجينوم)، وهو متوافق مع جزيء واحد، في الوقت الحقيقي SMRT (DNA) التسلسل، وهو قادرة على تقديم واحدة من قاعدة التسلسل قرار مؤسسة حمد الطبية-5.

Watch this Scientific Journal Video about Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA at JoVE.com

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

ووصف هو عملية وضع العلامات على مرحلتين باستخدام β-ناقلة الغلوكوزيل (β-GT) لنقل أزيد من الغلوكوز لمؤسسة حمد الطبية-5، تليها الكيمياء اضغط هنا لرابط نقل البيوتين لتخصيب سهلة وكثافة مستقلة. هذه الطريقة فعالة ووضع العلامات المحددة تمكن من مؤسسة حمد الطبية تخصيب-5 مع خلفية منخفضة للغاية وعالية الإنتاجية عن طريق رسم الخرائط epigenomic الجيل القادم التسلسل.

انتقائية لقطة من hydroxymethylcytosine-5 من الحمض النووي الجيني

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

selective-capture-of-5-hydroxymethylcytosine-from-genomic-dna

Research

JoVE Journal

Biology

11.9K Views.  Emory University School of Medicine. ووصف هو عملية وضع العلامات على مرحلتين باستخدام β-ناقلة الغلوكوزيل (β-GT) لنقل أزيد من الغلوكوز لمؤسسة حمد الطبية-5، تليها الكيمياء اضغط هنا لرابط نقل البيوتين لتخصيب سهلة وكثافة مستقلة. هذه الطريقة فعالة ووضع العلامات المحددة تمكن من مؤسسة حمد الطبية تخصيب-5 مع خ?...

Video: Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

عزل الحمض النووي الجينوم من الذيول ماوس

Large Insert Environmental Genomic Library Production

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent environmental genomic (i.e. metagenomic) approaches have emerged, enabling researchers to bridge this cultivation gap by capturing the genetic content of indigenous microbial communities directly from the environment. To this end, genomic DNA libraries are constructed using standard albeit artful laboratory cloning techniques. Here we describe the construction of a large insert environmental genomic fosmid library with DNA derived from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord. This protocol is directly linked to a series of connected protocols including coastal marine water sampling [1], large volume filtration of microbial biomass [2] and a DNA extraction and purification protocol [3]. At the outset, high quality genomic DNA is end-repaired with the creation of 5 -phosphorylated blunt ends. End-repaired DNA is subjected to pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) for size selection and gel extraction is performed to recover DNA fragments between 30 and 60 thousand base pairs (Kb) in length. Size selected DNA is purified away from the PFGE gel matrix and ligated to the phosphatase-treated blunt-end fosmid CopyControl vector pCC1 (EPICENTRE <a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385">http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Linear concatemers of pCC1 and insert DNA are subsequently headfull packaged into phage particles by lambda terminase, with subsequent infection of phage-resistant E. coli cells. Successfully transduced clones are recovered on LB agar plates under antibiotic selection and archived in 384-well plate format using an automated colony picking robot (Qpix2, GENETIX). The current protocol draws from various sources including the CopyControl Fosmid Library Production Kit from EPICENTRE and the published works of multiple research groups [4-7]. Each step is presented with best practice in mind. Whenever possible we highlight subtleties in execution to improve overall quality and efficiency of library production. The whole process of fosmid library production and automated colony picking takes at least 7-10 days as there are many incubation steps included. However, there are several stopping points possible which are mentioned within the protocol.

Construction of a fosmid library with environmental genomic DNA isolated from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord is described. The resulting clone library is picked into 384-well plates and archived for downstream sequencing and functional screening by the application of an automated colony picking system.

مكتبة كبيرة إدراج الجينوم البيئية الإنتاج

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with nutrient and energy flow within terrestrial ecosystems. Cultivation-independent environmental genomic, also known as metagenomic, approaches promise unprecedented access to this genetic information with respect to pathway reconstruction and functional screening for high value therapeutic and biomass conversion processes. However, the soil microbiome still remains a challenge largely due to the difficulty in obtaining high molecular weight DNA of sufficient quality for large insert library production. Here we introduce a protocol for extracting high molecular weight, microbial community genomic DNA from soils and sediments. The quality of isolated genomic DNA is ideal for constructing large insert environmental genomic libraries for downstream sequencing and screening applications. 
The procedure starts with cell lysis. Cell walls and membranes of microbes are lysed by both mechanical (grinding) and chemical forces (&beta;-mercaptoethanol). Genomic DNA is then isolated using extraction buffer, chloroform-isoamyl alcohol and isopropyl alcohol. The buffers employed for the lysis and extraction steps include guanidine isothiocyanate and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to preserve the integrity of the high molecular weight genomic DNA. Depending on your downstream application, the isolated genomic DNA can be further purified using cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation, which reduces impurities including humic acids. The first procedure, extraction, takes approximately 8 hours, excluding DNA quantification step. The CsCl gradient ultracentrifugation, is a two days process. During the entire procedure, genomic DNA should be treated gently to prevent shearing, avoid severe vortexing, and repetitive harsh pipetting.

A methodology to isolate high molecular weight and high quality genomic DNA from soil microbial community is described.

استخراج عالية الوزن الجزيئي الحمض النووي الجينوم من التربة والرواسب

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Primer Extension Capture: Targeted Sequence Retrieval from Heavily Degraded DNA Sources

We present a method of targeted DNA sequence retrieval from DNA sources which are heavily degraded and contaminated with microbial DNA, as is typical of ancient bones. The method greatly reduces sample destruction and sequencing demands relative to direct PCR or shotgun sequencing approaches. We used this method to reconstruct the complete mitochondrial DNA (mtDNA) genomes of five Neandertals from across their geographic range. The mtDNA genetic diversity of the late Neandertals was approximately three times lower than that of contemporary modern humans. Together with analyses of mtDNA protein evolution, these data suggest that the long-term effective population size of Neandertals was smaller than that of modern humans and extant great apes.

We present a method of targeted ancient DNA sequence retrieval, which we used to reconstruct the complete mitochondrial genomes of five Neandertal individuals. Comparison of these sequences with present day humans suggests that Neandertals had a long term low effective population size.

التمهيدي لقطة فرعي : استرجاع المستهدفة تسلسل الحمض النووي من مصادر المتدهورة بالديون

We present a method of targeted DNA sequence retrieval from DNA sources which are heavily degraded and contaminated with microbial DNA, as is typical of ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

جيل من الحمض النووي الريبي / الحمض النووي DNA في الجينوم الهجائن التي تحول باستخدام الحمض النووي الريبي التي تحتوي على [أليغنوكليوتيد]

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in their nucleotide composition and consist of a complex mosaic of sequence patterns. These patterns include so-called Mid-Range Inhomogeneity (MRI) regions -- sequences 30-10000 nucleotides in length that are enriched by a particular base or combination of bases (e.g. (G+T)-rich, purine-rich, etc.). MRI regions are associated with unusual (non-B-form) DNA structures that are often involved in regulation of gene expression, recombination, and other genetic processes (Fedorova &amp; Fedorov 2010). The existence of a strong fixation bias within MRI regions against mutations that tend to reduce their sequence inhomogeneity additionally supports the functionality and importance of these genomic sequences (Prakash et al. 2009).
Here we demonstrate a freely available Internet resource -- the Genomic MRI program package -- designed for computational analysis of genomic sequences in order to find and characterize various MRI patterns within them (Bechtel et al. 2008). This package also allows generation of randomized sequences with various properties and level of correspondence to the natural input DNA sequences. The main goal of this resource is to facilitate examination of vast regions of non-coding DNA that are still scarcely investigated and await thorough exploration and recognition.

We present a public computational web site for the analysis of genomic sequences. It detects DNA sequence patterns with various non-random nucleotide compositions. This resource also generates randomized sequences with diverse levels of complexity.

الجينومية MRI -- وهو من الموارد العامة للدراسة أنماط تسلسل الحمض النووي داخل الجينوم

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

الجينوم شاشات التنافسية للمكتبات الخميرة Barcoded

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any two individuals is greater than previously thought3. In contrast, array-based genotyping has failed to identify a significant contribution of common sequence variants to the phenotypic variability of common disease4,5. Taken together, these observations have led to the evolution of the Common Disease / Rare Variant hypothesis suggesting that the majority of the "missing heritability" in common and complex phenotypes is instead due to an individual's personal profile of rare or private DNA variants6-8. However, characterizing how rare variation impacts complex phenotypes requires the analysis of many affected individuals at many genomic loci, and is ideally compared to a similar survey in an unaffected cohort. Despite the sequencing power offered by today's platforms, a population-based survey of many genomic loci and the subsequent computational analysis required remains prohibitive for many investigators.
To address this need, we have developed a pooled sequencing approach1,9 and a novel software package1 for highly accurate rare variant detection from the resulting data. The ability to pool genomes from entire populations of affected individuals and survey the degree of genetic variation at multiple targeted regions in a single sequencing library provides excellent cost and time savings to traditional single-sample sequencing methodology. With a mean sequencing coverage per allele of 25-fold, our custom algorithm, SPLINTER, uses an internal variant calling control strategy to call insertions, deletions and substitutions up to four base pairs in length with high sensitivity and specificity from pools of up to 1 mutant allele in 500 individuals. Here we describe the method for preparing the pooled sequencing library followed by step-by-step instructions on how to use the SPLINTER package for pooled sequencing analysis (<a href="http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter" target="_blank">http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter</a>). We show a comparison between pooled sequencing of 947 individuals, all of whom also underwent genome-wide array, at over 20kb of sequencing per person. Concordance between genotyping of tagged and novel variants called in the pooled sample were excellent. This method can be easily scaled up to any number of genomic loci and any number of individuals. By incorporating the internal positive and negative amplicon controls at ratios that mimic the population under study, the algorithm can be calibrated for optimal performance. This strategy can also be modified for use with hybridization capture or individual-specific barcodes and can be applied to the sequencing of naturally heterogeneous samples, such as tumor DNA.

Pooled DNA sequencing is a fast and cost-effective strategy to detect rare variants associated with complex phenotypes in large cohorts. Here we describe the computational analysis of pooled, next-generation sequencing of 32 cancer-related genes using the SPLINTER software package. This method is scalable, and applicable to any phenotype of interest.

الكشف عن المتغيرات الجينية النادرة من تسلسل المجمعة عن طريق سبلينتر

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any ...

A Practical and Novel Method to Extract Genomic DNA from Blood Collection Kits for Plasma Protein Preservation

Laboratory tests can be done on the cellular or fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes determines the portion of the blood that can be analyzed (whole blood, plasma or serum). Laboratories involved in studying the genetic basis of human disorders rely on anticoagulated whole blood collected in EDTA-containing vacutainer as the source of DNA for genetic / genomic analysis. Because most clinical laboratories perform biochemical, serologic and viral testing as a first step in phenotypic outcome investigation, anticoagulated blood is also collected in heparin-containing tube (plasma tube). Therefore when DNA and plasma are needed for simultaneous and parallel analyses of both genomic and proteomic data, it is customary to collect blood in both EDTA and heparin tubes. If blood could be collected in a single tube and serve as a source for both plasma and DNA, that method would be considered an advancement to existing methods. The use of the compacted blood after plasma extraction represents an alternative source for genomic DNA, thus minimizing the amount of blood samples processed and reducing the number of samples required from each patient. This would ultimately save time and resources.
The BD P100 blood collection system for plasma protein preservation were created as an improved method over previous plasma or serum collection tubes1, to stabilize the protein content of blood, enabling better protein biomarker discovery and proteomics experimentation from human blood. The BD P100 tubes contain 15.8 ml of spray-dried K2EDTA and a lyophilized proprietary broad spectrum cocktail of protease inhibitors to prevent coagulation and stabilize the plasma proteins. They also include a mechanical separator, which provides a physical barrier between plasma and cell pellets after centrifugation. Few methods have been devised to extract DNA from clotted blood samples collected in old plasma tubes2-4. Challenges from these methods were mainly associated with the type of separator inside the tubes (gel separator) and included difficulty in recovering the clotted blood, the inconvenience of fragmenting or dispersing the clot, and obstruction of the clot extraction by the separation gel.
We present the first method that extracts and purifies genomic DNA from blood drawn in the new BD P100 tubes. We compare the quality of the DNA sample from P100 tubes to that from EDTA tubes. Our approach is simple and efficient. It involves four major steps as follows: 1) the use of a plasma BD P100 (BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) tube with mechanical separator for blood collection, 2) the removal of the mechanical separator using a combination of sucrose and a sterile paperclip metallic hook, 3) the separation of the buffy coat layer containing the white cells and 4) the isolation of the genomic DNA from the buffy coat using a regular commercial DNA extraction kit or a similar standard protocol.

We are describing a new method of isolating genomic DNA from whole blood collected for plasma/serology. After plasma collection, the compacted blood is usually discarded. Our novel method represents a significant improvement over existing methods and makes DNA and plasma available from a single collection, without requesting additional blood.

طريقة عملية ومبتكرة لاستخراج الحمض النووي الجينوم من الدم أطقم مجموعة لحفظ البلازما بروتين

Laboratory tests can be done on the cellular or  fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes  determines the portion of the ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

التصوير في الوقت الحقيقي من واحدة المهندسة رنا النصوص في الخلايا الحية عن طريق Ratiometric ثنائي الجزيء منارات

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...