يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم السموم على الخط الجرثومي البشري، مثل كيفية إنشاء أو إصلاح الأضرار في جينوم الخلايا الجرثومية البدائية البشرية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الخلايا الجرثومية البدائية البشرية يمكن أن تولد في غضون أسبوعين من خلايا iPS المتعددة القدرات التي تؤوي الخلفية الوراثية للمرض. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو الوقاية من ضعف الجينوم في الخلايا الجرثومية البشرية ، لأن نموذج ثقافة الخلية لدينا يمكن أن يساعدنا على تقليل السمية الجرثومية للدواء العلاجي.
لتبدأ مع توليد الخلايا الجرثومية البدائية الإنسان مثل الخلايا، أو PGCLCs الإنسان، وإعداد لوحات خارج الخلية مصفوفة المغلفة بالبروتين وتعليق الخلية من iPSCs الإنسان، كما هو موضح في بروتوكول النص. إعداد تعليق خلية واحدة من iPSCs الإنسان تستعد متعددة الأطراف في المتوسطة mTeSR1 التي تحتوي على مثبطات Y-27632 Rho كيناز. ضبط كثافة الخلية بعناية إلى 100,000 خلية لكل ملليلتر.
تلقيح مليلترين من تعليق الخلية من iPSCs الإنسان تستعد في كل بئر من البروتين مصفوفة خارج الخلية المغلفة ستة جيدا لوحات، والتأكد من أن يتم توزيع الخلايا بالتساوي عن طريق هز لوحات عموديا وأفقيا. احتضان اللوحات في حاضنة ثاني أكسيد الكربون ثلاثية الغاز عند 37 درجة مئوية. من المهم جداً تلقيح 200,000 خلية بالضبط في كل بئر من ألواح الستة جيداً.
يعد العد الدقيق للخلايا أمرًا بالغ الأهمية. بعد الانتهاء من التحويل العابر إلى تعدد السذاجة ، يجب أن تبدو الخلايا أكثر من التقاء ، وهو أمر طبيعي. التوقيت الدقيق للتغير المتوسط مهم لتحقيق معدلات عالية من PGCLCs البشرية والقابلية للتكرار التجريبي.
كثافة من 4i hiPSC الثقافة عالية في ظل هذه الظروف، ومن المتوقع أن تصبح الخلية التقاء في 48 إلى 72 ساعة بعد التطعيم. بعد 24 ساعة من التطعيم، قم بتغيير الوسط بمليلترين في بئر mTeSR1 المتوسط بدون Y27632. بدء تحويل تستعد الدولة متعددة القدرات iPSCs الإنسان إلى 4i الخلايا الجذعية متعددة القدرات الساذجة، عن طريق الاحترار 50 ملليلتر من 4i المتوسطة كاملة في حمام الماء 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
في 48 و 72 ساعة بعد التلقيح، وإزالة لوحات من الحاضنة، وتغيير المتوسطة مع 2 ملليلتر في بئر من 4i المتوسطة كاملة. الطرد المركزي المنظفات المغلفة لوحة microwell في 1، 000 غرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. افحص الآبار باستخدام المجهر المقلوب لضمان عدم وجود فقاعات الهواء.
شطف الآبار كما هو موضح في بروتوكول النص، وتكرار الطرد المركزي. إضافة 4i متوسطة كاملة إلى الآبار المشطفة. الطرد المركزي لوحة في 1،000 غرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، وتفتيش الآبار مرة أخرى.
لتطعيم iPSCs 4i الإنسان في لوحة microwell، وإعداد تعليق خلية iPSC الإنسان كما هو موضح في البروتوكول. تصفية هذا التعليق الخلية من خلال 40 ميكرومتر المسام حجم خلية مصفاة لإزالة مجاميع الخلية. غسل مصفاة مع ملليلتر واحد من 4i قبل الدافئة إكمال المتوسطة ثلاث مرات لجمع جميع الخلايا من مصفاة، وعد الخلايا مع عداد الثقافة.
ثم، تمييع هذا التعليق خلية واحدة من iPSCs الإنسان ساذج 4i إلى 27 إلى 32.4 مليون خلية في 9 ملليلتر قبل warmed 4i المتوسطة كاملة تحتوي على Y27632. إزالة لوحة صغيرة تم إعدادها سابقا تحتوي على 1 ملليلتر من 4i المتوسطة كاملة في بئر من حاضنة ثلاثية الغاز. تلقيح 1 ملليلتر من 4i تعليق iPSC الإنسان الساذج في كل بئر, لتحقيق تركيز 3.0 إلى 3.6 مليون خلية في البئر.
ماصة بلطف لتوزيع الخلايا بالتساوي. الطرد المركزي لوحة في 100 غرام لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ضع الطبق في حاضنة ثاني أكسيد الكربون ثلاثية الغاز ، مع التأكد من عدم إزعاج الخلايا التي يتم وضعها في الwell الدقيقة ، واحتضانها لمدة 24 إلى 30 ساعة ، لأن الحضانة بين عشية وضحاها غير كافية لتشكيل الأجسام الجنينية الضيقة أو EBs.
Prewarm 5 ملليلتر من الإنسان PGCLC المتوسطة القاعدية و 20 ملليلتر من PGCLC الإنسان المتوسطة كاملة لمدة خمس دقائق على الأقل في حمام الماء 37 درجة مئوية مكان بعناية 40 ميكرومتر المسام مصفاة خلية الحجم رأسا على عقب على أنبوب مخروطي بولي بروبلين 50 ملليلتر. لفصل EBs عن الآبار الصغيرة ، والماصات بلطف كل بئر من اللوحة. لإزالة الخلايا غير المدمجة في EBs، تصفية محتويات جميع الآبار من خلال مصفاة الخلية.
غسل بلطف EBs الاحتفاظ بها على غشاء مصفاة الخلية مع 1 ملليلتر من قبل الدافئة الإنسان PGCLC المتوسطة القاعدية, وتكرار غسل خمس مرات. وضع أنبوب مخروطي 50 ملليلتر جديدة على مصفاة الخلية، بحيث يتم الآن وضع مصفاة الخلية الجانب الأيمن في أنبوب جديد. عكس بسرعة مصفاة الخلية مع أنبوب جديد، والتي سوف وضع ابس تحت غشاء مصفاة الخلية.
إضافة 18 ملليلتر من PGCLC الإنسان قبل الدافئة متوسطة كاملة لغشاء مصفاة الخلية لجمع EBs في أنبوب مخروطي. ثم، لوحة 3 ملليلتر في بئر من تعليق EBs في آبار من لوحة مرفقة منخفضة ستة بئر. ضع اللوحة على الروك المناشار في حاضنة الغاز الثلاثي ، وحدد بعناية سرعة الهزاز في حوالي 20 منعطفًا في الدقيقة.
في اليوم السابع إلى الثالث عشر من التجربة، أعد حديثا 20 ملليلتر من PGCLC الإنسان متوسطة كاملة كل يوم. إزالة لوحة من الروك، والتي سوف تجعل بالوعة EBs إلى الجزء السفلي من الآبار. إزالة المتوسطة القديمة دون تجفيف EBs بحيث يبقى حوالي 0.2 ملليلتر من المتوسطة القديمة في كل بئر.
إضافة 3 ملليلتر في بئر من PGCLC الإنسان الطازجة المتوسطة كاملة, بعد إزالة المتوسطة القديمة اليومية. لتحديد PGCLCs الإنسان كخلايا إيجابية OCT4، حصاد EBs إلى أنبوب microcentuge منخفضة الربط 1.5 ملليلتر. دع الـ EBs بالوعة إلى الأسفل في درجة حرارة الغرفة، وتخلص من الوسيطة.
شطف EBs مع الجليد البارد 1X PBS. بعد إزالة برنامج تلفزيوني، احتضان EBs في 1 ملليلتر من الجليد البارد 1٪ الوزن من قبل حجم أزيد الصوديوم في PBS على الجليد لمدة خمس دقائق. اسمحوا EBs بالوعة إلى أسفل في درجة حرارة الغرفة.
بعد التخلص من المكبر ، شطف EBs مع PBS البارد الثلج. ذوبان 200 ميكرولترات من البروتين مصفوفة خارج الخلية على الجليد. إضافة البروتين إلى أنبوب يحتوي على ا.
اترك الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق تقريبًا ، حتى يتم تجمد الجل ، ويتم تضمين EBs. لإصلاح EBs ، أضف 1 ملليلتر من 4٪ الفورمالديهايد في PBS إلى الأنبوب ، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة مع هزاز لطيف. بعد ذلك ، تجاهل الفورمالديهايد وشطف EBs مرة واحدة مع PBS الباردة الجليد.
إضافة 1 ملليلتر من 70٪ الإيثانول. تخزين في 70٪ الإيثانول في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد، أو المضي قدما في معالجتها مع بروتوكول FFPE القياسية. كثافة الخلية وحتى توزيع الخلايا على كل بئر هي حرجة.
IPSCs الإنسان في 2 ملليلتر من Y27632 تكمل المتوسطة في بئر من لوحة ستة جيدا، تصل إلى 20 إلى 30٪ التقاء بعد 24 ساعة. بعد ثقافة إضافية 24 ساعة في المتوسط mTeSR1، في غياب Y27632، جمعت الخلايا وشكلت مستعمرات، وتحتل ما يقرب من 30٪ من منطقة النمو. بعد 24 ساعة من الثقافة في 4i إعادة برمجة المتوسطة، وصلت الخلايا التقاء.
بعد 24 ساعة إضافية من الثقافة في الوسط 4i، أصبحت الخلايا أكثر كثافة معبأة. بعد 24 ساعة حضانة في microwells في 4i إعادة برمجة المتوسطة، شكلت الخلايا EBs مع كفاف دائري مرئية في 24 إلى 30 ساعة بعد التطعيم. حافظت الـ EBs في وسط PGCLC البشري ، تحت ظروف غير مُهتزة ، على شكلها الكروي دون تجميع بعد 24 ساعة.
بعد 192 ساعة، كانت EBs أكبر، والحفاظ على نفس مورفولوجيا. بعد 5 أيام، ظهرت الخلايا كـ OCT4 التي تعبر عن الخلايا على سطح EBs، مما يزيد عددها بعد 8 أيام. تم إثراء الخلايا من تعليق خلية واحدة من PGCLCs الإنسان كالخلايا إيجابية CD38 بواسطة FACS.
كانت الخلايا التي لا تعبر عن CD38 تحكمًا سلبيًا. ولتجنب التلوث، تم فصل الخلايا CD38-إيجابية وD38-سالبة للوبل، بـ FACS، بفارق كبير. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم لمتابعة العد الدقيق للخلية وتوقيتات التغيير المتوسط.
قد يؤدي حذف التغيير المتوسط حتى في يوم واحد ، أو تقليل حجم هذه الوسيلة في أي خطوة ، إلى موت الخلايا الهائل. سرعة ثقافة هزاز من الهيئات الجنينية يجب أن يكون الأمثل بعناية.
