이 방법은 인간 원시 생식 세포의 게놈에 있는 손상이 생성되거나 복구되는 방법과 같은 인간 생식선 독성학 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 인간 원시 생식 세포가 임신 한 유전자 배경을 품고있는 원시 적 iPS 세포로부터 2 주 안에 생성 될 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 인간 생식선 세포에 있는 게놈 손상의 예방을 향해 확장합니다, 우리의 세포 배양 모형은 치료 약의 생식선 독성을 감소시키는 것을 도울 수 있기 때문에.
인간 원시 세균 세포 와 같은 세포의 생성으로 시작하려면, 또는 인간 PGCLCs, 텍스트 프로토콜에 설명 된 바와 같이, 세포 외 매트릭스 단백질 코팅 플레이트 및 인간 iPSC의 세포 현탁액을 준비. Y-27632 Rho 키나아제 억제제가 함유된 mTeSR1 배지에서 프라이밍 된 인간 iPSC의 단일 세포 현탁액을 준비한다. 셀 밀도를 밀리리터당 100, 000 세포로 신중하게 조정합니다.
세포외 매트릭스 단백질의 각 우물에서 프라이밍 된 인간 iPSC의 세포 현탁액 의 2 밀리리터를 접종하여 6 웰 플레이트를 코팅하여 세포가 수직 및 수평으로 플레이트를 흔들어 고르게 분포되도록합니다. 섭씨 37도에서 삼가스 CO2 인큐베이터에서 플레이트를 배양합니다. 6웰 플레이트의 각 웰에서 정확히 200, 000 세포를 접종하는 것이 매우 중요합니다.
셀의 정확한 계수는 매우 중요합니다. 순진한 자성화로 의 일시적인 변환의 완료 후, 세포는 정상, 지나치게 혼잡을 봐야한다. 중간 변화의 정확한 타이밍은 높은 인간 PGCLC 및 실험 재현성을 달성하는 것이 중요합니다.
4i hiPSC 배양물의 밀도는 이러한 조건하에서 높으며, 접종 후 48~72시간 동안 세포가 응수될 것으로 예상된다. 접종 후 24시간, Y27632 없이 mTeSR1 배지의 웰당 2밀리리터로 배지를 변경한다. 15분 동안 섭씨 37도의 수조에서 완전한 배지 의 50 밀리리터를 15분 동안 섭씨 37도의 완전한 배지로 따뜻하게 하여 4i 순진한 만능 줄기 세포로 발포된 자성수 상태의 인간 iPSC를 4i 순진한 만능 줄기 세포로 전환하기 시작합니다.
접종 후 48 및 72시간 에서 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 4i 의 웰당 2 밀리리터로 배지를 변경합니다. 실온에서 5분 동안 1, 000g의 세제 코팅 마이크로웰 플레이트를 원심분리합니다. 거품의 부재를 보장하기 위해 반전 현미경으로 우물을 검사합니다.
텍스트 프로토콜에 설명된 대로 우물을 헹구고 원심 분리를 반복합니다. 헹구는 우물에 4i 전체 매체를 추가합니다. 상온에서 5분 동안 1, 000g의 플레이트원심분리기를 하고 우물을 다시 검사합니다.
마이크로웰 플레이트에 4i 인간 iPSCs를 접종하려면 프로토콜에 설명된 바와 같이 인간 iPSC 세포 현탁액을 준비한다. 40 마이크로미터 모공 크기의 세포 여과기를 통해 이 세포 현탁액을 필터링하여 세포 응집체를 제거합니다. 전동4i의 1밀리리터로 여과기를 3회 세척하여 스트레이너로부터 모든 세포를 수집하고 배양 카운터로 세포를 세어보세요.
이어서, 4i 순진한 인간 iPSC의 이 단세포 현탁액을 9밀리리터에서 27~3,240만 세포로 희석하여 Y27632를 함유한 4i 완전 배지를 사전 따뜻하게 하였다. 트라이 가스 인큐베이터에서 웰당 4i 의 1 밀리리터를 포함하는 이전에 준비된 마이크로웰 플레이트를 제거하십시오. 4i 순진한 인간 iPSC 현탁액의 1 밀리리터를 각각 잘 접종하여 웰당 3.0 ~360만 개의 세포농도를 달성한다.
부드럽게 파이펫을 사용하여 셀을 고르게 분배합니다. 상온에서 3 분 동안 100g의 플레이트원심분리기. 접시를 트라이 가스 CO2 인큐베이터에 놓고 마이크로웰에서 펠렛 세포를 방해하지 않도록 하고, 하룻밤 잠복이 단단한 배아 체 또는 EB의 형성에 충분하지 않기 때문에 24~30시간 동안 배양합니다.
인간 PGCLC 기저형 배지의 5 밀리리터와 20 밀리리터의 인간 PGCLC는 섭씨 37도의 수조에서 최소 5분 동안 완벽한 배지를 50밀리리터 폴리프로필렌 원내 튜브 위에 40마이크로미터 모공 크기의 셀 스트레이너를 조심스럽게 거꾸로 놓습니다. 마이크로웰에서 EB를 분리하려면 플레이트의 각 우물을 부드럽게 피펫합니다. EB에 통합되지 않은 세포를 제거하려면 셀 스트레이너를 통해 모든 우물의 내용을 필터링합니다.
전침이 좋은 인간 PGCLC 기저질의 1밀리리터로 세포 스트레이너의 막에 보관된 EB를 부드럽게 세척하고 5회 세척을 반복합니다. 셀 스트레이너에 신선한 50 밀리리터 원뉴컬 튜브를 배치하여 세포 스트레이너가 이제 새로운 튜브에 오른쪽으로 배치되도록 합니다. 세포 스트레이너를 새로운 튜브로 신속하게 반전하여 EB를 세포 스트레이너의 막 아래에 배치합니다.
원적 튜브에서 EB를 수집하기 위해 세포 스트레이너의 멤브레인에 미리 따뜻워진 인간 PGCLC 의 18 밀리리터를 세포 스트레이너의 막에 추가합니다. 그런 다음, 낮은 부착 6 웰 플레이트의 우물에 EBs의 현탁액의 우물당 플레이트 3 밀리리터. 시소 이동 로커에 플레이트를 트라이 가스 인큐베이터에 놓고 분당 약 20 회전으로 흔들 속도를 신중하게 설정합니다.
실험 7일째에서 13일째에 매일 20밀리리터의 인간 PGCLC 를 준비합니다. 로커에서 접시를 제거하여 EB가 우물 바닥으로 가라앉게 합니다. 기존 배지의 약 0.2 밀리리터가 각 우물에 남아 있도록 EB를 건조하지 않고 오래된 매체를 제거합니다.
매일 오래된 매체를 제거 한 후 신선한 인간 PGCLC 완성 매체의 웰 당 3 밀리리터를 추가합니다. 인간 PGCLC를 OCT4 양성 세포로 식별하려면 1.5 밀리리터 저결합 미세 원심분리기 튜브로 EB를 수확하십시오. EB가 실온에서 바닥으로 가라앉고 매체를 폐기하십시오.
얼음 차가운 1X PBS로 EB를 헹구는 다. PBS를 제거한 후 PBS의 부피 아지드에 의해 얼음 냉기 1mm 무게의 1 밀리리터로 5분 간 얼음에 있는 EB를 배양합니다. 실온에서 EB가 바닥으로 가라앉도록 하십시오.
상체를 폐기한 후, 얼음 차가운 PBS로 EB를 헹구십시오. 얼음에 세포 외 매트릭스 단백질의 200 마이크로 리터를 해동. EB를 함유한 튜브에 단백질을 추가합니다.
젤이 고화되고 EB가 내장될 때까지 튜브를 실온에서 약 10분 동안 둡니다. EB를 고치려면 PBS에 4%포름알데히드1밀리리터를 넣고 실온에서 15분간 부드러운 흔들림으로 배양합니다. 그 후, 포름알데히드를 버리고 얼음 차가운 PBS로 한 번 EB를 헹구십시오.
70%에탄올1밀리리터를 넣으세요. 최대 1주일 동안 섭씨 4도에 70%에탄올을 보관하거나 표준 FFPE 프로토콜로 처리하십시오. 각 우물에 세포의 세포 밀도 및 균등 한 분포는 매우 중요합니다.
Y27632의 2 밀리리터의 인간 IPSC는 6웰 플레이트의 웰당 중간을 보충하여 24시간 후에 20~30%의 합류에 도달합니다. mTeSR1 배지에서 24시간 배양후, Y27632가 없는 경우, 세포가 집합화되고 형성된 식민지를 형성하여 성장 영역의 약 30%를 차지하였다. 4i 리프로그래밍 배지에서 24시간의 배양 후, 세포는 합류에 도달했습니다.
4i 배지에서 24시간의 배양후 세포가 더 조밀하게 포장되었습니다. 4i 리프로그래밍 배지에서 마이크로웰에서 24시간 배양한 후, 세포는 접종 후 24~30시간 후에 원형 윤곽을 보이면서 EB를 형성했습니다. EB는 인간 PGCLC 배지에 보관, 흔들리는 비 준수 조건하에서, 24 시간 후에 응집없이 그들의 구형 모양을 유지했습니다.
192시간 이후에는 동일한 형태를 유지하면서 EB가 더 커졌습니다. 5 일 후, 세포는 8 일 후에 그들의 수를 증가시키는 EB의 표면에 세포를 표현하는 OCT4로 나타났습니다. 인간 PGCLCs의 단일 세포 현탁액으로부터의 세포는 FACS에 의해 CD38 양성 세포로 농축되었다.
CD38을 발현하지 않는 세포는 음의 대조군이었다. 오염을 방지하기 위해 FACS 게이트 CD38 양성 및 CD38 음수 세포는 넓은 마진으로 분리되었습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 정확한 셀 계산 및 중간 변화의 타이밍을 따르는 것이 중요합니다.
하루라도 중간 변화를 생략하거나, 어떤 단계에서든 그 매체의 부피를 감소시키는 것은 대규모 세포 사망을 초래할 수 있다. 배아 체의 흔들리는 문화의 속도는 신중하게 최적화되어야합니다.
