שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הרעלים של הנבט האנושי, כגון כיצד נזקים בגנום של תאי נבט ראשוניים אנושיים נוצרים או מתוקנים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שתאי נבט ראשוניים אנושיים יכולים להיווצר בתוך שבועיים מהתאים הפלוריפוטנטיים העיקריים של iPS המטפחים נטייה למחלות רקע גנטי. ההשלכות של טכניקה זו להרחיב לקראת מניעת פגיעה גנומית בתאי נבט אנושי, כי מודל תרבות התא שלנו יכול לעזור לנו להפחית את רעילות הנבט של תרופה טיפולית.
כדי להתחיל עם הדור של תאים דמויי תא נבט קדמוני אנושי, או PGCLCs אנושיים, להכין מטריצה חוץ תאית מצופה חלבון צלחות השעיית תאים של iPSCs אנושי, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הכן השעיה חד-תאית של iPSCs אנושיים pluripotency מוכן במדיום mTeSR1 המכיל את מעכב Y-27632 רו קינאז. כוונן בזהירות את צפיפות התאים ל- 100,000 תאים למיליליטר.
לחסן שני מיליליטר של השעיית תאים של iPSCs אנושיים primed בכל באר של חלבון מטריצה חוץ תאי מצופה שש בארות צלחות, לוודא כי התאים מופצים באופן שווה על ידי טלטול הצלחות אנכית ואופקית. להטמיר את הצלחות באינקובטור CO2 שלושה גז ב 37 מעלות צלזיוס. חשוב מאוד לחסן בדיוק 200,000 תאים בכל באר של צלחת שש בארות.
ספירה מדויקת של תאים היא קריטית. לאחר השלמת ההמרה הטרנזית לפלוריפוטנטיות נאיבית, התאים צריכים להסתכל על קונפלנט יתר, וזה נורמלי. תזמון מדויק של שינוי בינוני חשוב להשגת PGCLCs אנושיים גבוהים ושחזור ניסיוני.
הצפיפות של תרבות hiPSC 4i גבוהה בתנאים אלה, והוא צפוי לתא להיות confluent ב 48 עד 72 שעות לאחר חיסון. 24 שעות לאחר החיסון, לשנות את המדיום עם שני מיליליטר לגם של mTeSR1 בינוני ללא Y27632. התחל המרה של מצב pluripotency primed iPSCs אנושי לתאי גזע פלוריפוטנטיים נאיביים 4i, על ידי התחממות 50 מיליליטר של 4i להשלים בינוני באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
ב 48 ו 72 שעות לאחר החיסון, להסיר את הצלחות מהאינקובטור, ולשנות את המדיום עם 2 מיליליטר ל well של 4i מדיום שלם. צנטריפוגה צלחת microwell מצופה דטרגנט ב 1, 000 גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. בדוק את בארות עם מיקרוסקופ הפוך כדי להבטיח היעדר בועות אוויר.
שטפו את הבאר כמתואר בפרוטוקול הטקסט, וחזרו על הצנטריפוגה. מוסיפים 4i מדיום שלם ל בארות שטוף. צנטריפוגה הצלחת ב 1, 000 גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ולבדוק את בארות שוב.
כדי לחסן 4i iPSCs אנושי לתוך צלחת microwell, להכין השעיית תא iPSC אנושי כמתואר בפרוטוקול. לסנן את ההשעיה תא זה באמצעות מסננת תאים בגודל נקבובית 40 מיקרומטר כדי להסיר צבירות תאים. לשטוף את מסננת עם מיליליטר אחד של 4i מחומם מראש להשלים מדיום שלוש פעמים כדי לאסוף את כל התאים מן מסננת, ולספירת התאים עם מונה תרבות.
לאחר מכן, לדלל את ההשעיה הזאת תא יחיד של 4i נאיבי iPSCs אנושי ל 27 כדי 32.4 מיליון תאים ב 9 מיליליטר מראש מחומם 4i מדיום מלא המכיל Y27632. הסר צלחת microwell שהוכן בעבר המכיל 1 מיליליטר של 4i להשלים בינוני לגם מאינקובטור תלת גז. לחסן 1 מיליליטר של השעיית iPSC אנושית 4i נאיבי לתוך כל באר, כדי להשיג ריכוז של 3.0 כדי 3.6 מיליון תאים לגם.
בעדינות פיפטה כדי להפיץ את התאים באופן שווה. צנטריפוגה הצלחת ב 100 גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. מניחים את הצלחת באינקובטור CO2 שלושה גז, הקפד לא להפריע תאים גלולה microwells, ו דגירה במשך 24 עד 30 שעות, כי דגירה לילה אינו מספיק להיווצרות של גופים עובריים הדוקים או EBs.
לפני המלחמה 5 מיליליטר של מדיום בסיס PGCLC אנושי ו 20 מיליליטר של האדם PGCLC להשלים מדיום לפחות חמש דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס בזהירות למקם מסננת תאים בגודל נקבובית 40 מיקרומטר במהופך מעל צינור חרוט פוליפרופילן 50 מיליליטר. כדי לנתק את EBs ממיקרווולים, בעדינות pipette כל באר של הצלחת. כדי להסיר תאים שלא שולבו ב- EBs, סנן את התוכן של כל הבארים דרך מסננת התאים.
לשטוף בעדינות את EBs נשמר על הממברנה של מסננת התא עם 1 מיליליטר של מדיום בסיס PGCLC אנושי מחומם מראש, ולחזור על לשטוף חמש פעמים. מניחים צינור חרוט טרי 50 מיליליטר על מסננת התא, כך מסננת התא ממוקם כעת בצד ימין למעלה בצינור החדש. במהירות להפוך את מסננת התא עם הצינור החדש, אשר ימקם את EBs מתחת לממברנה של מסננת התא.
הוסף 18 מיליליטר של PGCLC אנושי מחומם מראש מדיום מלא הממברנה של מסננת התא כדי לאסוף EBs בצינור חרוט. לאחר מכן, צלחת 3 מיליליטר לתוך גם של ההשעיה של EBs לתוך בארות של צלחת שישה בארות מצורף נמוך. מניחים את הצלחת על נדנדה לנוע באינקובטור תלת גז, בזהירות להגדיר את מהירות הנדנדה על כ 20 סיבובים לדקה.
ביום השביעי עד ה-13 של הניסוי, הכינו טריים 20 מיליליטר של מדיום שלם PGCLC אנושי בכל יום. הסר את הצלחת מן הנדנדה, אשר יגרום EBs לשקוע לתחתית בארות. הסר את המדיום הישן מבלי לייבש EBs כך כ 0.2 מיליליטר של מדיום ישן נשאר בכל באר.
הוסף 3 מיליליטר ל באר של PGCLC אנושי טרי מדיום שלם, לאחר הסרת המדיום הישן כל יום. כדי לזהות PGCLCs אנושיים כתאים חיוביים OCT4, לקצור את EBs לצינור מיקרוצנטריפוגה נמוך 1.5 מיליליטר. תן EBs לשקוע לתחתית בטמפרטורת החדר, ולהשליך את המדיום.
יש לשטוף את ה-EBs בקרח 1X PBS. לאחר הסרת PBS, דגירה EBs ב 1 מיליליטר של קרח קר 1% משקל לפי נפח נתרן אזיד ב PBS על קרח במשך חמש דקות. תן ל- EBs לשקוע לתחתית בטמפרטורת החדר.
לאחר השלכת העל-טבעי, שוטפים את ה-EBs בקרח קר PBS. להפשיר 200 מיקרוליטרים של חלבון מטריצה חוץ תאית על קרח. מוסיפים את החלבון לצינור המכיל EBs.
השאירו את הצינור בטמפרטורת החדר למשך כ-10 דקות, עד שג'ל מתמצת, וה- EBs מוטבעים. כדי לתקן את EBs, להוסיף 1 מיליליטר של 4% פורמלדהיד PBS לצינור, ודגירה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות עם נדנדה עדינה. לאחר מכן, להשליך את פורמלדהיד ולשטוף את EBs פעם אחת עם PBS קר כקרח.
הוסף 1 מיליליטר של 70% אתנול. יש לאחסן ב-70% אתנול ב-4 מעלות צלזיוס עד שבוע, או להמשיך לעבד אותן בפרוטוקול FFPE סטנדרטי. צפיפות התאים ואפילו התפלגות התאים בכל באר הם קריטיים.
IPSCs אנושיים ב 2 מיליליטר של Y27632 בתוספת בינוני ל הבאר של צלחת שש בארות, להגיע 20 כדי 30% confluency לאחר 24 שעות. לאחר תרבות נוספת של 24 שעות במדיום mTeSR1, בהיעדר 27632 Y, התאים צברו ויצרו מושבות, הכובשות כ -30% מאזור הגידול. לאחר 24 שעות של תרבות במדיום תכנות מחדש 4i, תאים הגיעו לקונפלונציה.
לאחר 24 שעות נוספות של תרבות במדיום 4i, התאים הפכו צפופים יותר. לאחר דגירה של 24 שעות במיקרווולים במדיום התכנות מחדש של 4i, תאים יצרו EBs עם קווי המתאר העגולים שלהם גלויים ב 24 עד 30 שעות לאחר החיסון. EBs שמרו במדיום PGCLC האנושי, בתנאים לא עקביים נדנדה, שמרו על צורתם הכדורית ללא צבירה לאחר 24 שעות.
לאחר 192 שעות, EBs היו גדולים יותר, שמירה על אותה מורפולוגיה. לאחר 5 ימים, התאים הופיעו כמו OCT4 להביע תאים על פני השטח של EBs, להגדיל את מספרם לאחר 8 ימים. תאים מהשעיית תא יחיד של PGCLCs אנושיים הועשרו כתאים חיוביים CD38 על ידי FACS.
תאים שלא מבטאים CD38 היו שליטה שלילית. כדי למנוע זיהום, FACS שערי CD38 חיובי ו CD38 שלילי תאים הופרדו על ידי שוליים רחבים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לעקוב אחר ספירת תאים מדויקת ותזמונים של שינוי בינוני.
השמטת שינוי בינוני אפילו יום אחד, או הפחתת נפח המדיום בכל שלב, עלולה לגרום למוות מסיבי של תאים. המהירות של תרבות הנדנדה של גופים עובריים צריכה להיות ממוטבת בקפידה.
