Bu yöntem, insan mikrop toksikolojisi alanında, insan ilkel mikrop hücrelerinin genomundaki hasarların nasıl yaratıldığı veya onarıldığı gibi anahtar soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, insan ilkel mikrop hücrelerinin hastalık yatkınlığı genetik arka plan barındıran astarlı pluripotency iPS hücrelerinden iki hafta içinde oluşturulabilir olmasıdır. Bu tekniğin etkileri insan germline hücrelerinde genomik bozulmanın önlenmesine doğru uzanır, çünkü hücre kültürü modelimiz terapötik bir ilacın germline toksisitesini azaltmamıza yardımcı olabilir.
İnsan ilkel germ hücre benzeri hücrelerin üretimi ile başlamak için, veya insan PGCLCs, ekstrasellüler matris protein kaplı plakalar ve insan iPSCs hücre süspansiyon hazırlamak, metin protokolünde açıklandığı gibi. Y-27632 Rho kiril inhibitörü içeren mTeSR1 ortamda astarlı pluripotency human iPSCs tek hücreli süspansiyon hazırlayın. Hücre yoğunluğunu mililitrebaşına 100,000 hücreye dikkatlice ayarlayın.
Hücre dışı matriks protein kaplı altı iyi plakalar her kuyuda astarlanmış insan iPSCs hücre süspansiyon hücre süspansiyon iki mililitre aşılamak, hücrelerin dikey ve yatay plakalar sallayarak eşit olarak dağıtılan emin olun. Plakaları 37 derecede üç gazlık bir CO2 kuluçka makinesiyle kuluçkaya yatırın. Altı kuyulu bir plakanın her kuyuda tam olarak 200.000 hücre aşılamak çok önemlidir.
Hücrelerin doğru saysayımı çok önemlidir. Naif pluripotency geçici dönüşüm tamamlandıktan sonra, hücreler normal dir aşırı konfluent bakmak gerekir. Orta değişimin tam zamanlaması yüksek insan PGCLC'leri ve deneysel tekrarlanabilirlik elde etmek için önemlidir.
4i hiPSC kültürünün yoğunluğu bu koşullar altında yüksektir ve aşılamadan sonraki 48 ila 72 saat içinde hücrenin konsepsiye olması beklenmektedir. Aşılamadan 24 saat sonra, Y27632 olmadan mTeSR1 ortamının kuyubaşına iki mililitre ile orta değiştirin. Astarlı pluripotency devlet insan iPSCs 4i saf pluripotent kök hücrelere dönüşüm başlayın, 15 dakika boyunca 37 derece santigrat su banyosunda 4i tam orta 50 mililitre ısıtarak.
Aşıdan 48 ve 72 saat sonra, kuvözden plakaları çıkarın ve 4i tam orta kuyu başına 2 mililitre ile orta değiştirin. Deterjan kaplı mikrokuyu plakayı oda sıcaklığında beş dakika boyunca 1.000 g'da santrifüj edin. Hava kabarcıklarının yokluğunu sağlamak için kuyuları ters mikroskopla inceleyin.
Metin protokolünde açıklandığı gibi kuyuları durulayın ve santrifüjünü tekrarlayın. Durulanmış kuyulara 4i tam orta ekleyin. Tabağı oda sıcaklığında beş dakika boyunca 1,000 g'de santrifüj edin ve kuyuları tekrar inceleyin.
Mikrokuyu plaka içine 4i insan iPSCs aşılamak için, protokolde açıklandığı gibi insan iPSC hücre süspansiyon hazırlamak. Hücre agregalarını çıkarmak için bu hücre süspansiyonuna 40 mikrometre lik gözenek boyutunda bir hücre süzgeciuygulayın. Süzgeçten tüm hücreleri toplamak için bir mililitre önceden ısıtılmış 4i tam orta üç kez süzgeç ile yıkayın ve bir kültür sayacı ile hücreleri saymak.
Daha sonra, 4i saf insan iPSCs bu tek hücresüspansiyon seyreltmek 27 için 32.4 milyon hücre 9 mililitre önceden ısıtılmış 4i tam orta Y27632 içeren. Üç gazlı bir kuluçka makinesinden kuyu başına 1 mililitre 4i komple orta içeren önceden hazırlanmış mikro kuyu plakasını çıkarın. Her kuyuya 1 mililitre saf insan iPSC süspansiyonu aşılamak, kuyu başına 3,0 ila 3,6 milyon hücre konsantrasyonu elde etmek için.
Hücreleri eşit olarak dağıtmak için yavaşça pipet. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 100 g olarak plaka santrifüj. Plakayı üç gazlı CO2 kuluçka makinesine yerleştirin, mikrowelllerde bulunan hücreleri rahatsız etmemeyi unutmayın ve bir gecede kuluçka ya da sıkı embriyonik cisimlerin veya EB'lerin oluşumu için yetersiz olduğundan 24 ila 30 saat kuluçkaya yatırın.
Prewarm 5 mililitre insan PGCLC bazal orta ve insan PGCLC 20 mililitre 37 derece santigrat su banyosu en az beş dakika boyunca orta dikkatle bir 40 mikrometre gözenek büyüklüğünde hücre süzgeç baş aşağı bir 50 mililitre polipropilen konik tüp üzerinde yerleştirin. EB'leri mikro kuyulardan ayırmak için, plakanın her kuyusu için yavaşça pipet. EB'lerde yer alan hücreleri kaldırmak için, tüm kuyuların içeriğini hücre süzgecinden geçirin.
Hücre süzgecinin zarında tutulan EB'leri 1 mililitre önceden ısıtılmış insan PGCLC bazal orta ile hafifçe yıkayın ve beş kez yıkayın. Hücre süzgeci nin üzerine 50 mililitrelik konik bir tüp yerleştirin, böylece hücre süzgeci şimdi yeni tüp sağ tarafa konumlandırılmış. EB'leri hücre süzgecinin zarının altına yerleştirecek olan yeni tüple hücre süzgecini hızlı bir şekilde ters çevirin.
Konik tüpTE EB toplamak için hücre süzgeci nin zarına önceden ısıtılmış insan PGCLC tam orta 18 mililitre ekleyin. Daha sonra, düşük eki altı iyi plaka kuyuları içine EBs süspansiyon kuyu başına plaka 3 mililitre. Plakayı üç gazlı bir kuluçka makinesine bir tahterevalli kayasına yerleştirin ve sallanan hızı dakikada yaklaşık 20 dönüşte dikkatlice ayarlayın.
Deneyin yedinci ila 13 gününde, her gün 20 mililitre insan PGCLC tam orta hazırlayın. EBs kuyuların altına lavabo yapacak rocker, plaka çıkarın. EB'leri kurutmadan eski ortamı çıkarın, böylece her kuyuda yaklaşık 0,2 mililitre eski ortam kalır.
Taze insan PGCLC tam orta kuyu başına 3 mililitre ekleyin, eski orta günlük çıkardıktan sonra. OKT4-pozitif hücreler olarak insan PGCLCs tanımlamak için, 1.5 mililitre düşük bağlayıcı mikrosantrifüj tüp EBs hasat. EB'ler oda sıcaklığında dibe batar ve ortayı atın.
EB'leri buz gibi 1X PBS ile durula. PBS'yi çıkardıktan sonra, EB'leri 1 mililitre buz soğuğunda %1 ağırlıkta, PBS'de beş dakika boyunca buzun üzerindeki hacim sodyum aziti ile kuluçkaya yatırın. EB'ler oda sıcaklığında dibe batar.
Supernatant attıktan sonra, buz gibi PBS ile EBs durula. Buz üzerinde 200 mikrolitre ekstrasellüler matriks proteini eritin. Proteini EB içeren tüpe ekleyin.
Jel katılaştırılı ve EB'ler gömülü olana kadar tüpü oda sıcaklığında yaklaşık 10 dakika bekletin. EB'leri düzeltmek için, tüpe PBS'de 1 mililitre formaldehit ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca hafif sallanan bir kuluçka yakala. Bundan sonra, formaldehit atın ve buz gibi PBS ile bir kez EBs durulamak.
% 70 etanol 1 mililitre ekleyin. Bir haftaya kadar 4 santigrat derecede %70 etanol de saklayın veya standart bir FFPE protokolü ile işlemeye devam edin. Hücre yoğunluğu ve her kuyudaki hücrelerin eşit dağılımı kritik tir.
Y27632 2 mililitre insan IPSCs altı iyi plaka kuyu başına orta takviye, 24 saat sonra% 20-30 kesişme ulaşmak. MTeSR1 ortamında 24 saatlik ek bir kültürden sonra, Y27632'nin yokluğunda, hücreler biraraya gelip koloniler oluşturmuş ve büyüme alanının yaklaşık %30'una sahiptir. 4i yeniden programlama orta kültür 24 saat sonra, hücreler biraraya ulaştı.
4i ortamda ek bir kültür 24 saat sonra, hücreler daha yoğun paketlenmiş oldu. 4i yeniden programlama ortamındaki mikrokuyularda 24 saatlik bir kuluçkadan sonra hücreler, aşılamadan 24 ila 30 saat sonra dairesel konturları ile EB'ler oluşturdular. İnsan PGCLC ortamda tutulan EB'ler, sallanan yapışmaz koşullar altında, 24 saat sonra küresel şekillerini toplamadan korudular.
192 saat sonra, EB'ler daha büyüktü ve aynı morfolojiyi korudular. 5 gün sonra, hücreler EBs yüzeyinde hücreleri ifade OCT4 olarak ortaya çıktı, 8 gün sonra sayılarını artırarak. İnsan PGCLCs tek hücreli süspansiyon hücreleri FACS tarafından CD38-pozitif hücreler olarak zenginleştirilmiştir.
CD38'i ifade amayan hücreler negatif denetimdi. Kontaminasyonu önlemek için, FACS kapıları CD38-pozitif ve CD38-negatif hücreler geniş bir farkla ayrılmıştır. Bu yordamı çalışırken, onun önemli tam hücre sayımı ve orta değişim zamanlamaları takip etmektir.
Bir gün bile orta değişimi atlayarak, ya da herhangi bir adımda bu ortamın hacmini azaltarak, büyük hücre ölümüne neden olabilir. Embriyoid cisimlerin sallanan kültürünün hızı dikkatle optimize edilmelidir.
