يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الأمراض المعدية. فيما يتعلق بحمى الضنك، أو حمى شيكونغونيا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية نفسها، انها قادرة على قياس الحمض النووي الريبي الفيروسي بطريقة بسيطة وسريعة.
على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في البحوث الأساسية للفيروسات، فإنه يمكن أيضا أن تطبق على البحوث الأخرى مثل ارتفاع من خلال وضع دراسة فحص المخدرات والتشخيص السريري ضد الفيروسات الشعبية البشرية. إن البرهان الرئيسي على هذه الطريقة أمر بالغ الأهمية. كما عينات الطوابع معالجة ومجلس الوزراء السلامة الأحيائية مهمة لتجنب التلوث عبر أو العدوى المختبرية.
وسوف يكون إثبات الإجراء أستاذ مساعد ومساعدنا التقني من مختبرنا. بعد إعداد قالب الحمض النووي لمعيار RNA ، اخلط رد فعل النسخ في vivo مع 100 نانوجرام من قالب الحمض النووي المعد في أنبوب PCR 0.2 ملليلتر. احتضان في 37 درجة مئوية في دورة الحرارة لمدة ساعتين.
بعد ذلك، إضافة ميكرولتر واحد من DNAase ومواصلة الحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. تعيين مجموعة تنقية الجيش الملكي النيبالي وإضافة 80 ميكرولترات من المياه الحرة RNAase و 350 ميكرولتر من مخزن الالتقاط، بما في ذلك 1٪ بيتاماركابتويتانول إلى خليط التفاعل في أنبوب 1.5 ملليلتر. إضافة 250 ميكرولترات من الإيثانول 100٪واستخدم ماصة لخلط.
ثم، تجميع عمود تنقية RNA مع أنبوب جمع. نقل عينة RNA إلى عمود تنقية. الطرد المركزي العمود في 8، 000 مرات G لمدة 15 ثانية وتجاهل تدفق من خلال.
بعد ذلك، تطبيق 500 ميكرولترات من الغسيل العازلة على العمود والطرد المركزي في 8، 000 مرات G لمدة دقيقتين. بعد ذلك، ضع العمود في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير 1.5 ملليلتر. أضف 50 ميكرولترات من الماء المجاني RNAase واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة.
الطرد المركزي العمود في السرعة القصوى لمدة دقيقة واحدة ل allute الجيش الملكي النيبالي. باستخدام مقياس الطيف، وقياس الكثافة البصرية من 3 ميكرولترات من الحمض النووي الريبي alluted في 260 نانومتر. ثم، تحديد عدد نسخة من فيروس حمى الضنك توليفها ثلاثة الجيش الملكي النيبالي UTR رئيس.
تخزين معيار RNA في ناقص 80 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام. أولاً، امزج 199 ميكرولترات من مخزن المعالجة مع ميكرولتر واحد من البروتينات الخالية من النياتية K.Using خلية ثقافة المتوسطة، وتمييع مسلسل فيروس حمى الضنك المعدة ثلاثة RNA UTR الرئيسية 1-1 للحصول على معايير الحمض النووي الريبي في تركيزات تتراوح بين 5، 000، 000 إلى 5، 000 نسخة لكل ميكرولتر عن طريق تكرار الأنابيب و الدوامة. نقل 5 ميكرولتررس من ثقافة فائقة من الخلايا المصابة فيروس حمى الضنك وفيروس حمى الضنك 3 UTR RNA الرئيسي معيار إما شرائط A2 PCR أو الآبار من 96 جيدا PCR لوحة.
مزيج في خمسة ميكرولترات من الحل الذي يحتوي على معالجة العازلة والبروتينات K.Centrifuge لفترة وجيزة في 200 مرة G لمدة خمس ثوان. احتضان العينات في دورة حرارية في 25 درجة مئوية لمدة عشر دقائق ثم في 75 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. باستخدام فيروس حمى الضنك ثلاثة primers المحددة UTR الرئيسية ومسبار الفلوروجينيك، وإعداد مزيج ماجستير RTQ PCR مع كاشف RT PCR خطوة واحدة في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير 1.5 ملليلتر.
Alloquote ثمانية ميكروليتر من مزيج الرئيسي في بئر من 96 جيدا في الوقت الحقيقي لوحة PCR. ثم، إضافة اثنين microliters من كل عينة إلى كل بئر من 96 جيدا في الوقت الحقيقي PCR لوحة. ختم لوحة مع فيلم لاصق واضح بصريا.
لفترة وجيزة الطرد المركزي لوحات في 200 مرة G لمدة خمس ثوان لإزالة أي فقاعات الهواء. ثم، ضع لوحة في صك PCR في الوقت الحقيقي. باستخدام PCR في الوقت الحقيقي البرامج المرتبطة ، انتقل إلى إطار الإعداد وتعيين بئر رد فعل لتحليلها على أنها عينة غير معروفة.
المقبل, تعيين بئر من فيروس حمى الضنك المخفف تسلسليا ثلاثة الجيش الملكي النيبالي UTR رئيس كمعيار واكتب عدد نسخة المتوقع من معيار RNA في كل بئر. تعيين عنصر تحكم غير قالب كـ عنصر تحكم سالب. ثم، بدء تشغيل أداة RT PCR و cycle لوحة كما هو موضح في بروتوكول النص.
في إطار التحليل، انقر فوق تحليل وتأكد من أن معامل الارتباط المنحنى القياسي الذي تم إنشاؤه يعادل أو أكبر من 0.98. بشكل عام، استخدم إعدادات CT الافتراضية للتحليل. في هذه الدراسة، يخضع تخفيف متسلسل عشرة أضعاف من فيروس حمى الضنك الحمض النووي الموحد إلى تحليل PCR RTQ مباشرة باستخدام ثلاثة primers UTR الرئيسي محددة ومسبار الفلوريك.
منحنى خطي من هذا التحليل يبين أن الارتباط هو جيد. بعد ذلك، يتم تطبيق هذا المقايسة RTQ PCR المباشر لتحديد كمية فيروس حمى الضنك في ثقافة فائقة من الخلايا المصابة بالفيروس. وينظر إلى وجود ارتباط جيد بين تيتر عدوى فيروس حمى الضنك وCT، وهو رقم الدورة التي تعتبر أن النقطة التي ترتفع فيها إشارة الفلورسنت مع نمو أسي فوق الخلفية.
عندما يتم رسم قيم CT المتولدة من تخفيف تسلسلي لمخزون فيروس حمى الضنك مع الاترات المعدية المعروفة على المنحنى القياسي الذي تم إنشاؤه سابقًا ، فإن بيانات العينات التي تتراوح بين 08 و 8 ، 000 PFU لكل رد فعل تعتبر ضمن نطاق تلك التي تخضع للرنا الريبي القياسي. وهذا يشير إلى أن عينات فيروس حمى الضنك مع مجموعة واسعة من الاترات المعدية يمكن تحليلها في نفس الوقت عند استخدام هذه التقنية. ويتم تقييم هذا الفحص من حيث قابليته للتطبيق على التحقق من صحة العوامل المضادة للفيروسات ضد فيروس حمى الضنك.
عند المعالجة بـ 50 ميكروغرام لكل ملليلتر من ال MPA، لوحظ انخفاض بنسبة 99.87٪ تقريباً من ثقافة التحكم المعالجة في DMSO. وأخيرا، يتم اختبار تطبيقات هذا الفحص مع فيروسات RNA الأخرى. عندما يتعرض مخزون من فيروس الحمى الصفراء 17D سلالة لقاح لبرقية PCR RTQ مباشرة، يتم إنشاء منحنى قياسي مع ارتباط مباشر جيد بين الثدي الفيروس وقيم CT.
وبالمثل، فإن التحليل المباشر لـ RTQ PCR لفيروس الحصبة والأوراق المالية للسلالات الخام لفيروس شيكونغونيا يعطي تراجعاً جيداً بين قيم الاترات المعدية وقيم CT. وستمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال دراسة الفحص. السماح لعدد كبير من العينات لاستكشاف الأدوية المضادة للفيروسات الجديدة يساوي التبسيط.
لا تنس أن العمل مع المواد المعدية يمكن أن تكون خطرة للغاية وينبغي اتخاذ الاحتياطات مثل استخدام معدات الحماية الشخصية وخزانة السلامة الحيوية النظيفة دائما أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
