实时定量聚合酶链反应检测感染细胞培养中的登革热病毒 rna

该方法有助于回答传染病领域的关键问题。关于登革热或基孔肯雅热。这种技术本身的主要优点是能够以简单而快速的方式量化病毒RNA。

虽然这种方法可以提供对基础病毒研究的见解，它也可以应用于其他研究，如高通过药物筛选研究和临床诊断对人类流行病毒。此方法的主要演示至关重要。由于样品加工邮票和生物安全柜是重要的，以避免交叉污染或实验室感染。

演示程序将是助理教授和我们的技术助理从我们的实验室。为RNA标准制备DNA模板后，将体内转录反应与制备的DNA模板的100毫微克混合在0.2毫升PCR管中。在37摄氏度的热循环器中孵育两个小时。

在此之后，加入一微升的DNAase，并在37摄氏度下继续孵育15分钟。设置一个RNA纯化套件，并加入80微升的RNAase无水，350微升的捕获缓冲液，包括1%的β马卡托乙醇到1.5毫升管中的反应混合物。加入250微升100%乙醇，并使用移液器混合。

然后，用收集管组装RNA纯化柱。将RNA样品转移到纯化柱。将柱子以 8，000 倍 G 离心 15 秒，然后丢弃流经。

接下来，在柱子上涂抹500微升的洗涤缓冲液，并在8000次G下离心两分钟。在此之后，将柱放入1.5毫升微型离心管中。加入50微升RNAase无水，在室温下孵育一分钟。

以最高速度将柱离离一分钟，以使RNA全部全部使用。使用分光光度计，测量 260 纳米全速RNA的 3 微光密度。然后，确定合成登革热病毒的三个主要UTRRNA的拷贝数。

将 RNA 标准储存在零下 80 摄氏度，直到准备好使用。首先，将199微升加工缓冲液与1微升的核酸酶自由蛋白酶K.利用细胞培养基，连续稀释准备好的登革热病毒三个素质UTR RNA一至十，通过重复移液和涡流，获得每微升5000至5000份浓度的RNA标准。将登革热病毒感染细胞和登革热病毒3个主要 UTR RNA 标准的培养素的 5 微升转移到 A2 PCR 条或 96 孔 PCR 板的孔。

在含有加工缓冲液和蛋白酶K.离心机的溶液中混合5微升，在200倍G下短暂混合5秒钟。在25摄氏度的热循环器中孵育样品10分钟，然后在75摄氏度下孵育5分钟。使用登革热病毒三个主要的 UTR 特异性底转剂和氟源探针，在 1.5 毫升微型离心管中，使用一步 RT PCR 试剂准备 RTQ PCR 主混合物。

主盘将八微升混合成 96 井实时 PCR 板的井。然后，在 96 井实时 PCR 板的每个井中添加每个样品的两个微升。用光学透明胶粘膜密封板。

将板在 200 倍 G 下短暂离心五秒钟，以清除任何气泡。然后，将板放在实时 PCR 仪器中。使用实时 PCR 相关软件，导航到设置窗口，并将要分析为未知样本的反应井。

接下来，将序列稀释的登革热病毒三个主要 UTR RNA 的井作为标准，并在每个井中键入RNA标准的预期拷贝数。将非模板控件分配给负控件。然后，启动RT PCR仪器，并循环板，如文本协议中概述。

在分析窗口中，单击分析并确保生成的标准曲线的关联系数等效于或大于 0.98。通常，使用默认的 CT 设置进行分析。在这项研究中，使用三个主要 UTR 特异性源和一个氟学探针对标准登革热病毒RNA进行连续十倍稀释的直接RTQ PCR分析。

本分析的线性曲线表明，相关性良好。其次，采用直接RTQ PCR测定法，对受病毒细胞培养上名的登革热病毒进行量化。登革热病毒感染滴度和CT之间存在良好的相关性，CT被认为是荧光信号在背景上方呈指数级增长时上升的周期数。

当在先前生成的标准曲线上绘制了登革热病毒库存的序列稀释产生的CT值时，每个反应的样本数据在标准RNA的范围内。这表明，使用这种技术时，可以同时分析具有多种传染性滴定剂的登革热病毒样本。这一检测方法在验证抗病毒药物对登革热病毒的适用性方面进行了进一步评估。

当用每毫升 MPA 50 微克进行治疗时，观察到大约 99.87% 的 DMSO 治疗控制培养。最后，测试了该测定与其他RNA病毒的应用。当黄热病病毒17D疫苗株直接受到RTQ PCR的影响时，将生成一个标准曲线，病毒滴度和CT值之间有着良好的直接相关性。

同样，对麻疹病毒和基孔肯雅病毒原始菌株的直接RTQ PCR分析，在传染性滴答声和CT值之间提供了良好的回归。这项技术将为筛选研究领域的研究人员铺平道路。允许大量的样品探索新的抗病毒药物等于简单化。

不要忘记，使用再感染材料可能极其危险，在执行本程序时，应始终采取预防措施，例如使用个人防护设备和清洁的生物安全柜。