يوفر هذا البروتوكول طريقة موثوقة لقياس التغيرات هي ميكروبيوتا الأمعاء من الفئران بعد إدارة المضادات الحيوية عن طريق الفم. وهذا يمكن أن يساعد على البحث عن التفاعلات الميكروبية عبر توفير نظرة ثاقبة في الأمراض المرتبطة dysbiosis الميكروبية مثل مرض التهاب الأمعاء. والميزة الرئيسية لهذه النظم العلاج بالمضادات الحيوية هي أنها تمنع فقدان الوزن المميز المرتبط عادةً بإدارة المضادات الحيوية عن طريق الفم للفئران.
لpreform العلاج بالمضادات الحيوية من خلال gavage عن طريق الفم إعداد مزيج من المضادات الحيوية عن طريق خلط حلول الأسهم التي تم إعدادها كما هو موضح في بروتوكول التكنولوجيا. لحجم المليلتر مزيج 50 ميكرولترات من الأمبيسيلين، 50 ميكرولترات من جنتاميسين، 50 ميكرولترات من النيومايسين، 500 ميكرولترات من ميتروينيدازول، 25 ميكرولترات من فانكومايسين و 325 ميكرولترات من المياه. تحميل مزيج المضادات الحيوية على حقنة ملليلتر واحد مع القضاء على أي فقاعات واربط إبرة غفاج مناسبة.
الاستيلاء على الجلد على الكتف الماوس بحزم وتمتد الرأس والرقبة لتصويب المريء. توجيه طرف الكرة من إبرة التغذية على طول سقف الفم ونحو الجزء الخلفي من البلعوم. ثم تمرير بلطف إلى أسفل في المريء وحقن 200 ميكرولترات من الحل.
إدارة كوكتيل المضادات الحيوية مرة واحدة يوميا طوال مدة التجربة. بدلا من ذلك لإدارة المضادات الحيوية من خلال مياه الشرب، وإعداد مزيج من المضادات الحيوية كما هو موضح في بروتوكول التكنولوجيا. من المهم إدراج التحلية في خليط المضادات الحيوية لأن هذا عامل حاسم لمنع جفاف الفئران.
ملء كوكتيل المضادات الحيوية في زجاجة مياه في ما يقرب من 100 ملليلتر لكل زجاجة. حماية الزجاجة من الضوء ومكان في قفص الماوس. استبدل كوكتيل المضادات الحيوية بمخزون طازج مرتين في الأسبوع طوال مدة التجربة.
وينبغي أن تكون مراقبة دقيقة لوزن الفئران والحالة الصحية العامة preformed يوميا في جميع أنحاء إدارة المضادات الحيوية. وزن وتسمية أنابيب الأوتوكلاف المليلتر اثنين لجمع العينات. لجمع عينات البراز الطازجة وضع كل فأرة في القيود.
ثم جمع الكريات البراز مباشرة من فتحة الشرج في أنبوب جمع. بعد تنفيذ القتل الرحيم كما هو موضح في البروتوكول التقني وضع جثة الماوس مع البطن مكشوفة بالكامل ورش منطقة البطن مع الإيثانول 70٪. باستخدام ملقط معقمة ومقص جعل شق عرضية في البطن لفضح peratenium دون إتلاف أي الأنسجة الداخلية.
رفع peratenium وجعل شق لفضح الأمعاء. إزالة الأمعاء مع ملقط ومقص ووضعها في طبق بيتري عقيمة. استخدم الملباب بعناية لابعاد الأمعاء الدقيقة عن الشرايين الدهنية والدهون.
تمديد الأمعاء ووضعها على مسح مختبر نظيف. مع قياس المسطرة وقطع أربعة سنتيمترات من الغليمة القاصي من الأمعاء الدقيقة. قص وتجاهل سنتيمتر واحد من الأمعاء القريبة إلى cecum.
سيكون هناك ثلاثة سنتمترات جزء من الايلوم اليسار الذي سيتم استخدامه لجمع البكتيريا المعوية. عقد الجزء من الايلوم على أنبوب معقمة مليلتر اثنين. جمع المحتوى المعوي عن طريق قذف الأمعاء مباشرة وجمع العينة في الأنبوب.
هذه العينة سوف يكون البكتيريا من محتوى ileum. إعداد حقنة 20 ملليلتر مع الفوسفات الباردة المخزنة المالحة ومسح جزء الايلوم التخلص من تدفق من خلال. ضع الجزء الايلوم على طبق بيتري معقمة وافتحه طولياً مع المقص.
كشط داخل جدار الايلوم بمشرط. جمع أي بكتيريا على مشرط عن طريق غسله مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني على أنبوب طرد مركزي نظيف. تدور في ثمانية آلاف مرة G لمدة خمس دقائق ل بيليه البكتيريا.
بعد الطرد المركزي تجاهل المابير. هذه العينة سوف تحتوي على البكتيريا من جدار الايلوم. وزن الأنابيب التي تحتوي على عينات من البراز والجليم.
طرح الوزن من أنابيب فارغة للحصول على الوزن البرازي في كل عينة. استخراج الحمض النووي البكتيري من البراز، ومحتوى الايلوم، وعينات جدار الايلوم باستخدام مجموعات المتاحة تجاريا. تخزين عينات الحمض النووي في ناقص 20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
اذيب معيار qPCR، DNA عينة البراز والكواشف qPCR من عدة المتاحة تجاريا على الجليد. تمييع المعيار في الماء الخالي من الحمض النووي العقيم في نطاق يتراوح بين 10 إلى 7 إلى 10 إلى نسختين لكل ميكرولتر. تخفيف الحمض النووي عينة البراز إلى نصف، خمس و عشر تركيزات.
ثم جعل رد فعل مزيج الرئيسي للعدد الإجمالي لردود الفعل زائد واحد. مزيج 30 ميكرولترات من المزيج الرئيسي و 5 ميكرولترات من القالب، والذي هو إما معيار، عينة أو الماء للسيطرة السلبية. ثم إضافة 10 ميكرولترات من هذا المزيج إلى كل بئر في 384 لوحة qPCR بصرية.
أداء كل رد فعل في ثلاث ية. ختم لوحة qPCR والطرد المركزي لفترة وجيزة. ثم قم بتحميل اللوحة على جهاز qPCR الذي تمت برمجته كما هو مدرج في بروتوكول التقنية.
وأخيرا الحصول على قيم عتبة دورة للمعيار والعينات قبل حساب أرقام نسخة 16S rDNA لعينات البراز. تظهر النتائج التمثيلية فقدان الوزن في الفئران بعد إعطاء المضادات الحيوية عن طريق الزلاجة الفموية أو من خلال مياه الشرب. لم يتم الكشف عن فقدان الوزن ملحوظ في الفئران التي تتلقى المضادات الحيوية عن طريق الفم gavage.
عندما يتم علاج الفئران بالمضادات الحيوية في مياه الشرب تفقد حوالي 10٪ من وزن الجسم خلال الأيام القليلة الأولى من العلاج ولكن استرداد زيادة الوزن الطبيعي بعد ذلك. يتطلب القياس الكمي للبكتيريا في عينات البراز استخدام منحنى قياسي تم الحصول عليه عن طريق رسم لوغاريتم رقم النسخة لقيم C-T القياسية مقابل القيم التي تم الحصول عليها في qPCR. ضمن النطاق خطيّة يمكّن الانحدار تحليل معادلة كميّة من ال 16S [ا نّاوّاّاّهّاّهّاّفيّةفيّةمن العينات البرازية.
كما هو مبين هنا للبراز، ومحتوى الأمعاء الدقيقة وعينات جدار الأمعاء الدقيقة. بعد خمسة أو 10 أيام من تناول المضادات الحيوية عن طريق الفم هناك انخفاض قوي في كثافة البكتيريا في عينات البراز من الفئران المعالجة بالمضادات الحيوية. ومع ذلك، تعافت كثافة البكتيريا في البراز إلى مستويات طبيعية بعد أسبوع واحد من توقف إدارة المضادات الحيوية.
كل من الزلاجة الفموية وإدارة المضادات الحيوية في مياه الشرب تقلل لفترة وجيزة من الحمل البكتيري البرازي في الفئران المعالجة. الباحثون الذين يختارون الطريقة الفردية التي تناسب بشكل أفضل المتطلبات التجريبية النظر في عوامل مثل طول العلاج. يمكن تعديل طريقة qPCR لتحديد كمية البكتيريا لتحديد مقدار التاسيب البكتيرية الفردية باستخدام التمهيديات محددة.
وهذا سيوفر كل من المعلومات الكمية والصفات حول حجم الميكروبيوم وتكوينها.
