Bu protokol değişiklikleri ölçmek için güvenilir bir yöntem sağlar oral antibiyotik uygulaması aşağıdaki farelerin bağırsak mikrobiyota olduğunu. Bu inflamatuar barsak hastalığı gibi mikrobiyal disbiyoz ile ilişkili patolojiler içgörü sağlayan çapraz mikrobiyota etkileşimleri üzerinde araştırma yardımcı olabilir. Bu antibiyotik tedavi rejimlerinin ana avantajı normalde farelere oral antibiyotik uygulaması ile ilişkili karakteristik kilo kaybı önlemek olduğunu.
Oral gavage ile antibiyotik tedavisi preform için teknoloji protokolünde açıklandığı gibi prepped edilmiş stok çözümleri karıştırarak antibiyotik bir kokteyl hazırlamak. Mililitre karışımı bir hacim için 50 ampisilin mikrolitre, gentamisin 50 mikrolitre, neomisin 50 mikrolitre, metronidazol 500 mikrolitre, vankomisin 25 mikrolitre ve su 325 mikrolitre. Herhangi bir kabarcıklar ortadan kaldırırken bir mililitre şırınga üzerine yük antibiyotik karışımı ve uygun bir gage gavage iğne takın.
Fare omzunun üstündeki deriyi sıkıca tutun ve yemek borusunu düzeltmek için baş ve boynu esnetin. Besleme iğnesinin top ucunu ağzın çatısı boyunca ve yutak arkasına doğru yönlendirin. Sonra yavaşça yemek borusuna geçirin ve 200 mikrolitre çözeltiye enjekte edin.
Deney süresince antibiyotik kokteylini günde bir kez uygulayın. Alternatif olarak içme suyu ile antibiyotik yönetmek için, teknoloji protokolünde açıklandığı gibi antibiyotik bir kokteyl hazırlamak. Bu fareler dehidratasyon önlemek için önemli bir faktör olduğu gibi antibiyotik karışımı içine tatlandırıcı dahil etmek önemlidir.
Antibiyotik kokteyli şişe başına yaklaşık 100 mililitre bir su şişesine doldurun. Şişeyi ışıktan koruyun ve fare kafesinde yerleştirin. Deney süresince antibiyotik kokteylini haftada iki kez taze stokla değiştirin.
Antibiyotik tedavisi boyunca fare lerin kilosu ve genel sağlık durumunun dikkatli bir şekilde izlenmesi her gün önceden sağlanmalıdır. Numune toplama için iki mililitrelik otoklav tüpünü tartın ve etiketlendirin. Taze dışkı örneklerinin toplanması için her fareyi bir ölçüte yerleştirin.
Sonra bir toplama tüpü nde doğrudan anüs dışkı toplamak. Teknoloji protokolünde açıklandığı gibi ötenazi yaptıktan sonra karın tamamen maruz bir fare karkas yatıyordu ve% 70 etanol ile karın bölgesi sprey. Sterilize forceps ve makas kullanarak herhangi bir iç dokuya zarar vermeden peratenium ortaya çıkarmak için karın bir enine kesi yapmak.
Peratenium kaldırın ve bağırsakları ortaya çıkarmak için bir kesi yapmak. Forceps ve makas ile bağırsakçıkarın ve steril petri kabına yerleştirin. Dikkatle mezenterik arterler ve yağ uzak ince bağırsak kızdırmak için forceps kullanın.
Bağırsağı uzatın ve temiz bir laboratuvar menisine yerleştirin. Bir cetvel ölçüsü ile ve ince bağırsağın distal ileum dört santimetre kesti. Kes ve çekum için bağırsak proksimal bir santimetre atın.
Ileumun üç santimetrelik bir kısmı bağırsak bakterisi toplamak için kullanılacaktır. Ileum kısmını iki mililitrelik steril bir tüpün üzerinde tutun. Doğrudan bağırsak ekstrüzyon ve tüp örnek toplayarak bağırsak içeriğini toplamak.
Bu örnek ileum içeriğinden bakteri olacaktır. Soğuk fosfat tamponlu tuzlu 20 mililitrelik şırınga hazırlayın ve akışı atarak ileum kısmını temize çıkarın. Steril petri kabının üzerine ileum kısmını yerleştirin ve makasla uzunlamasına açın.
Ileum duvarının içini neşterle kazıyın. Temiz bir santrifüj tüp üzerinde PBS bir mililitre ile yıkayarak neşter üzerinde herhangi bir bakteri toplamak. Bakterileri peletlemek için beş dakika boyunca 8.000 g'de döndürün.
Santrifüjden sonra supernatant atın. Bu örnek ileum duvarından bakteri içerecektir. Dışkı ve ileum dan örnekleri içeren tüpler tartın.
Her numunede dışkı ağırlığı elde etmek için boş tüplerden ağırlığı çıkarın. Dışkıdan bakteriyel DNA ayıklayın, ileum içeriği, ve ileum duvar örnekleri ticari olarak kullanılabilir kitleri kullanarak. DNA örneklerini kullanıma kadar eksi 20 derecede saklayın.
QPCR standardını, dışkı örneği DNA'sını ve qPCR reaktiflerini buz üzerinde ticari olarak kullanılabilen bir kitten eritin. Mikrolitre başına iki kopya için 10 ila yedi ila 10 arasında bir aralıkta steril DNA serbest su standart seyreltin. Dışkı örneği DNA'sını yarıya, beşte birine ve onda birine seyreltin.
Sonra reaksiyonlar artı bir toplam sayısı için bir ana karışım reaksiyonu olun. Negatif kontrol için standart, numune veya su olan ana karışımın 30 mikrolitresini ve şablonun 5 mikrolitresini karıştırın. Sonra 384 iyi optik qPCR plaka her kuyuya bu karışımı 10 mikrolitre ekleyin.
Her reaksiyonu triplicate olarak gerçekleştirin. QPCR plakasını ve santrifüjünü kısa bir süre kapatın. Daha sonra plakayı teknik protokolde listelenen olarak programlanmış qPCR makinesine yükleyin.
Son olarak dışkı örnekleri için 16S rDNA kopya numaraları hesaplamadan önce standart ve numuneler için döngü eşik değerleri elde edin. Temsili sonuçlar oral gavage veya içme suyu ile antibiyotik verilmesinden sonra farelerde kilo kaybı göstermektedir. Oral gavage ile antibiyotik alan farelerde gözle görülür bir kilo kaybı saptanır.
Fareler içme suyunda antibiyotikile tedavi edildiğinde tedavinin ilk birkaç günü içinde vücut ağırlıklarının yaklaşık %10'una gevşek olurlar ancak bundan sonra normal kilo alımını iyileşirler. Dışkı örneklerinde bakterilerin ölçülmesi, qPCR'de elde edilen C-T değerlerine karşı kopya numarasının logaritmasının çizilmesi yle elde edilen standart bir eğrinin kullanılmasını gerektirir. Doğrusal aralık içinde regresyon analizi denklemi dışkı örnekleri içinde 16S rDNA bolluğunun nicelemesini sağlar.
Dışkı, ince bağırsak içeriği ve ince bağırsak duvar örnekleri için burada gösterildiği gibi. Oral antibiyotik tedavisi beş veya 10 gün sonra antibiyotik tedavi farelerden dışkı örneklerinde bakteri yoğunluğunda güçlü bir azalma vardır. Ancak antibiyotik uygulaması durdurulduktan bir hafta sonra dışkıdaki bakterilerin yoğunluğu normal seviyelere ulaştı.
Hem oral gavaj hem de içme suyunda antibiyotik verilmesi tedavi edilen farelerde dışkı bakteri yükünü kısaca azaltır. Tedavi nin uzunluğu gibi faktörleri göz önünde bulundurarak deneysel gereksinimlere daha iyi uyan bireysel yöntemi seçen araştırmacılar. Bakterilerin sayısallaştırılması için qPCR yöntemi belirli astarlar kullanarak bireysel bakteriyel taksa ölçmek için değiştirilebilir.
Bu mikrobiyom boyutu ve bileşimi hakkında hem nicel hem de nitel bilgi sağlayacaktır.
