تحليل ديناميكيات الميكروبات البرازية في الفئران المعرضة لمرض الذئبة باستخدام طريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة لعزل الحمض النووي

يمكن أن تعمل طريقة عزل الحمض النووي المقترحة على دراسة ديناميكيات ميكروبات الأمعاء في نماذج الفئران الخاصة بأمراض المناعة الذاتية. يقترح استخدام طريقة أكثر تنوعا وفعالية من حيث التكلفة وكفاءة للحصول على الحمض النووي من عينات البراز التي يمكن مقارنتها بالمجموعات المتاحة تجاريا. للبدء ، خذ كل فأر على حدة من قفصه ، وجمع حبيبة براز مباشرة من فتحة الشرج وتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى تتم معالجتها.

قم بمعالجة العينات باستخدام ملقط وأنابيب وقفازات معقمة ونظيفة. أضف حبيبة مجمدة إلى أنبوب غطاء لولبي بسعة ملليلتر تم وزنه مسبقا ، وسجل وزن البراز بالجرام ، والذي يجب أن يتراوح بين 0.02 إلى 0.05 جرام لكل حبيبة برازية. أضف إلى الكريات طبقة رقيقة من الخرز الزجاجي 0.1 ملم ، و 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل ، و 200 ميكرولتر من كبريتات دوديسيل الصوديوم بنسبة 20٪.

ضربت حبة الأنبوب لمدة أربع دقائق في مجانس ، تليها ثلاث إلى خمس دقائق من الدوامة. الطرد المركزي للأنابيب لفترة قصيرة للقضاء على الفقاعات والرغوة. لاستخراج الحمض النووي من عينات الميكروبات ، انقل 350 ميكرولتر من العينة الفائقة إلى أنبوب غطاء جديد ، 1.5 ملليلتر ، دون أي حطام.

أضف 500 ميكرولتر من الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزواميل، بنسبة 25:24:1، والدوامة لمدة دقيقة واحدة. بعد الطرد المركزي ، انقل 180 ميكرولتر من المرحلة المائية العليا إلى أنبوب غطاء جديد بسعة 1.5 ملليلتر. أضف 180 ميكرولتر من الكلوروفورم ، وقلبها واخلطها.

من هذا ، انقل 180 ميكرولتر من المرحلة المائية إلى أنبوب غطاء مفاجئ جديد. في خزانة السلامة الأحيائية ، أضف 180 ميكرولتر من الأيزوبروبانول البارد و 36 ميكرولتر من خمسة أسيتات أمونيوم مولار. قلبه عدة مرات للخلط ، وضع الأنبوب على الجليد لمدة 20 دقيقة.

تخلص من السوبرناتانت ، متبوعا بغسل الكريات عدة مرات ب 500 ميكرولتر من الإيثانول البارد بنسبة 70٪. تخلص من السوبرناتانت ، وجفف الأنبوب رأسا على عقب رأسا على عقب على المناديل الورقية لمدة 20 دقيقة ، حتى تصبح الكريات واضحة. الكريات في 50 ميكرولتر من الماء الجزيئي ، وقم بتسخين السائل عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لإذابة كريات الحمض النووي الكبيرة بالكامل.

بعد التسخين ، قم بطرد مركزي هذه الأنابيب عند 3،400 مرة G لمدة دقيقة واحدة لاستعادة قطرات التكثيف من الغطاء. قياس التركيز، والحصول على نسبة 260/280 باستخدام مقياس الطيف الضوئي. تتراوح نسبة الحمض النووي عالي الجودة بشكل عام بين 1.8 واثنين.

الطرد المركزي للعينات المحضرة بسرعة 600 مرة G لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة، قبل التجمد عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 24 ساعة. ثم أرسل 20 ميكرولترا من العينات بتركيزات تتراوح من واحد إلى 50 نانوغرام لكل ميكرولتر إلى مختبر أرغون الوطني للتسلسل. تحتوي سلالة الفئران التي تفتقر إلى المستقبل CX3CR1 على تركيبة ميكروبات معوية مختلفة مقارنة بالفئران MRL / lpr من النوع البري ، MRL / lpr-CX3CR1 GFP / GFP ، اختلافات كبيرة في أجناس معينة ، ذات صلة بالبكتيريا المسببة للأمراض المحتملة مثل تلك الموجودة في البكتيريا البروتينية.

كن حذرا في تلويث العينة. يجب أن تكون معقمة. أيضا ، من المهم سحب السحب بدقة عند نقل supernatant في أنبوب جديد.

هذه الطريقة مناسبة للتحليل الجزيئي مثل PCR أو هضم إنزيم التقييد أو بناء مكتبة الجينوم. في مرض الذئبة ، أثبتنا وجود علاقة قوية بين ميكروبات الأمعاء وتطور مرض الذئبة.