هوفيك أنبوب تشكيل التبوّع تقييم تأثير المنتجات الطبيعية على تكوين الأوعية الدموية

أنبوب تشكيل Assay هو اختبار في المختبر لدراسة الآليات الجزيئية الكامنة في عدة خطوات تؤدي إلى تشكيل الأوعية الدموية الجديدة. هذه الحسبة تسمح لتحديد المركبات و الشلالات الإشارات المرتبطة بنشأة الأوعية. مع اختبار واحد، ونحن قادرون على إظهار أن مركب طبيعي مثل RGWE يقلل من قدرة الخلايا البطانية لتشكيل هيكل أنبوب مثل، لا تؤثر على صلاحية الخلية، وأن هذا التأثير يعتمد على تفعيل مسار MEK / ERK. من المهم إجراء الاختبار مع العدد الصحيح من الخلايا. في الواقع، يمكن أن عدد قليل جدا أو الكثير من الخلايا لا تسمح التشكيل الصحيح من الأنابيب. لهذا السبب ، من المستحسن إجراء اختبار أولي لمعرفة العدد الصحيح للخلايا. (لوكا أولغا باستورينو) طالبة دكتوراه في مختبري سوف تظهر الإجراءات أولا، جمع أوراق القبر Ruta خلال أشهر الربيع والصيف. ضع 250 غراماً من الأوراق المفرومة في قارورة مخروطية، وأضف لتراً واحداً من الماء المقطر، ويغلي، وتصفية، كما هو موضح في المخطوطة. في اليوم التالي، استخدام مزيل الزعانب لlyophilize استخراج ورقة. بعد الحصول على مسحوق، وزنها، وتقسيمه إلى aliquots. ثقافة HUVECs في متوسط نمو الخلايا البطانية ، وفقا لبروتوكول النص. عندما تصل الخلايا إلى 80٪التقاء، مرور الخلايا بنسبة واحد إلى ثلاثة. استخدام الخلايا التي تم الحصول عليها بين مرور اثنين ومرور خمسة. مرة واحدة في HUVECs ممر تصل إلى 70٪ التقاء، transvect لهم مع ميكروغرام واحد من الناقل الذي يحتوي على جين من الفائدة.الجمع بين ميكروغرام واحد من الحمض النووي مع ثلاثة ميكرولترات من Lipofectamine المخفف 2000.Then، وإزالة المتوسطة من HUVECs، واستبداله مع ملليلتر واحد من المتوسطة كاملة جديدة. إضافة حل transvecting إلى الخلايا، واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية، وخمسة في المئة من ثاني أكسيد الكربون. بعد ثلاث ساعات من عملية النقل، أضف سبعة ملليلترات من المتوسط الكامل الطازج، وحضن الخلايا لمدة 24 إلى 48 ساعة إضافية. مباشرة قبل إعداد الطابق السفلي، ووضع ما قبل مبردة، 96 جيدا لوحة على الجليد، وإضافة 50 ميكروليتر من مصفوفة الباردة إلى كل بئر. في حين أن لوحة احتضان، وغسل HUVECs مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني / EDTA الحل. ثم، إضافة ملليلتر واحد من محلول تريبسين-EDTA إلى الخلايا، واحتضان لمدة خمس دقائق في 37 درجة مئوية.اجمع المتوسطة التي تحتوي على الخلايا المعلقة، وحصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي. ثم، resuspend الخلايا في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني. نقل 0.2 ملليلتر من تعليق الخلية إلى 0.5 ملليلتر من برنامج تلفزيوني مع حل الأزرق trypan. بعد عقد تعليق في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق، عد الخلايا في B