HUVEC Tube-Formation Assay zur Bewertung der Auswirkungen natürlicher Produkte auf die Angiogenese

Tube-Formation Assay ist ein In-vitro-Test, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die mehreren Schritten zugrunde liegen, die zur Bildung neuer Blutgefäße führen. Dieser Test ermöglicht es, Verbindungen und Signalkaskaden im Zusammenhang mit Angiogenese zu identifizieren. Mit einem Test können wir zeigen, dass eine natürliche Verbindung wie RGWE die Fähigkeit von Endothelzellen reduziert, röhrenartige Strukturen zu bilden, die Zelllebensfähigkeit nicht zu beeinträchtigen, und dass dieser Effekt von der Aktivierung des MEK/ERK-Signalwegs abhängt. Es ist wichtig, den Test mit der richtigen Anzahl von Zellen durchzuführen. Tatsächlich konnten zu wenige oder zu viele Zellen die richtige Bildung von Röhren nicht zulassen. Aus diesem Grund ist es ratsam, einen Vortest durchzuführen, um die richtige Anzahl der Zellen herauszufinden. Luca Olga Pastorino, Doktorand in meinem Labor, wird die Verfahren zeigen. Zuerst sammeln Ruta graveolens Blätter während der Frühlings- und Sommermonate. 250 Gramm gehackte Blätter in einen konischen Kolben geben und einen Liter destilliertes Wasser, Kochen und Filtern hinzufügen, wie im Manuskript beschrieben. Verwenden Sie am nächsten Tag einen Lyophilisator, um den Blattextrakt zu lyophilisieren. Nach Erhalt des Pulvers, wiegen Sie es, und teilen Sie es in Aliquots. Kultur die HUVECs in endotheliale Zellwachstum Medium, nach dem Textprotokoll. Wenn die Zellen 80% Konfluenz erreichen, durchdurchfahren Sie die Zellen im Verhältnis eins zu drei. Verwenden Sie die Zellen, die zwischen Durchgang zwei und Durchgang fünf erhalten wurden. Sobald die durchzogenen HUVECs 70% Konfluenz erreichen, transvect sie mit einem Mikrogramm des Vektors, der das Gen von Interesse enthält. Kombinieren Sie ein Mikrogramm DNA mit drei Mikrolitern verdünntem Lipofectamin 2000. Dann entfernen Sie das Medium aus den HUVECs und ersetzen Sie es durch einen Milliliter frisches komplettes Medium. Fügen Sie die Transvecting-Lösung zu den Zellen hinzu und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid. Drei Stunden nach der Transvtion sieben Milliliter frisches komplettes Medium hinzufügen und die Zellen für weitere 24 bis 48 Stunden inkubieren. Unmittelbar vor der Kellervorbereitung eine vorgekühlte 96-Well-Platte auf Eis legen und jedem Brunnen 50 Mikroliter Kaltmatrix hinzufügen. Während die Platte inkubiert, waschen Sie die HUVECs mit einem Milliliter PBS/EDTA-Lösung. Dann fügen Sie einen Milliliter Trypsin-EDTA-Lösung zu den Zellen hinzu und brüten für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius. Sammeln Sie das Medium, das die suspendierten Zellen enthält, und ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation. Setzen Sie dann die Zellen in einem Milliliter PBS wieder aus. 0,2 Milliliter der Zellsuspension mit Trypanblaulösung auf 0,5 Milliliter PBS übertragen. Nachdem Sie die Suspension fünf Minuten bei Raumtemperatur gehalten haben, zählen Sie die Zellen in einem B