HUVEC Ensayo de formación de tubos para evaluar el impacto de los productos naturales en la angiogénesis

El ensayo de formación de tubos es una prueba in vitro para estudiar los mecanismos moleculares subyacentes a varios pasos que conducen a la formación de nuevos vasos sanguíneos. Este ensayo permite identificar compuestos y cascadas de señalización asociadas a la angiogénesis. Con una prueba, podemos demostrar que un compuesto natural como RGWE reduce la capacidad de las células endoteliales para formar una estructura similar a un tubo, no afectan la viabilidad celular, y que este efecto depende de la activación de la vía MEK/ERK. Es importante realizar la prueba con el número correcto de celdas. De hecho, muy pocas o demasiadas células no podían permitir la formación correcta de tubos. Por esta razón, es aconsejable realizar una prueba preliminar para averiguar el número correcto de las células. Luca Olga Pastorino, estudiante de doctorado en mi laboratorio, mostrará los procedimientos. Primero, recoge hojas de Ruta graveolens durante los meses de primavera y verano. Ponga 250 gramos de hojas picadas en un matraz cónico, y agregue un litro de agua destilada, hierva y filtro, como se describe en el manuscrito. Al día siguiente, utilizar un liofilizador para liofilizar el extracto de hoja. Después de obtener el polvo, pesarlo, y dividirlo en alícuotas. Cultivo de los HUVEC en medio de crecimiento celular endotelial, de acuerdo con el protocolo de texto. Cuando las células alcancen el 80% de confluencia, pasaje las celdas a una proporción de uno a tres. Utilice las células obtenidas entre el paso dos y el paso cinco. Una vez que los HUVEC con pasos alcanzan el 70%confluencia, transvect ellos con un microgramo del vector que contiene el gen de interés.Combinar un microgramo de ADN con tres microlitros de lipofectamina diluida 2000.Then, eliminar el medio de los HUVEC, y reemplazarlo por un mililitro de medio fresco completo. Agregue la solución de transvección a las células e incubar las células a 37 grados centígrados y al cinco por ciento de dióxido de carbono. Tres horas después de la transvección, añadir siete mililitros de medio fresco completo, e incubar las células durante 24 a 48 horas adicionales. Inmediatamente antes de la preparación del sótano, ponga una placa pre-enfriada de 96 pozos sobre hielo, y agregue 50 microlitros de matriz fría a cada pozo. Mientras la placa se incuba, lave los HUVEC con un mililitro de solución PBS/EDTA. Luego, agregue un mililitro de solución de Tripppsin-EDTA a las células, e incubar durante cinco minutos a 37 grados Celsius.Recoger el medio que contiene las células suspendidas, y cosechar las células a través de la centrifugación. Luego, resuspenda las células en un mililitro de PBS. Transfiera 0,2 mililitros de la suspensión celular a 0,5 mililitros de PBS con solución azul tripano. Después de mantener la suspensión a temperatura ambiente durante cinco minutos, cuente las células en una