يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على السؤال الرئيسي في مجال تسليم الأدوية ، مثل كيفية تسليم الدواء إلى حبيبات خلوية محددة. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن نقل الغاز النووي يمكن أن يُستحث بواسطة الضوء. وسوف يكون إظهار الإجراء رينا Mogaki وأكيو Arisaka الطلاب غراد من مجموعتي.
للبدء في إعداد ربط نقطة الكم قفص الغراء الجزيئي عن طريق توليف الغراء الجزيئية في قفص ربط ديبنزوسيكوكين كما هو موضح في مزيد من التفاصيل في مكان آخر. إعداد محلول مخزون 10 ملليمولار من الغراء الجزيئي المحبوس ربط ديبنزوسيكين في DMSO الجافة. ثم إعداد نقطة الكم ربط الغراء الجزيئي قفص قفص عن طريق جعل أول aseye النقاط الكم وظيفية.
لتحقيق هذا إضافة 100 microliters من 125 micromolar aseye PEG4 NHS إستر في DMF إلى 400 ميكرولترات من حل DMF التي تحتوي على 500 نانوموللار من النقاط الكم التي يتم المغلفة مع ربط أمين وظيفية. يُحرّك الخليط لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. وضع الحل الناتج في غشاء السليلوز مجددة وdedyze ذلك لمدة 24 ساعة مقابل 800 مل من DMF.
التالي تمييع محلول الأسهم من الغراء الجزيئي في قفص ربط ديبنزوسيكوكتيني إلى 50 ميكروموللار مع DMF وإضافة 200 ميكرولترات منه إلى حل ما بعد غسيل الكلى. يُحرّك الخليط لمدة ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة. ثم dialyze الخليط الناتج لمدة 24 ساعة ضد 800 مل من DMF الطازجة باستخدام غشاء السليلوز مجددة مع قطع الوزن الجزيئي من 25000.
بعد 24 ساعة تخفيف الحل الناتج إلى 200 نانومولار مع DMF. الحفاظ على سرطان الكبد البشري البشري HEP3 B-الخلايا في المتوسط الأساسي الأدنى النسر تحتوي على 10٪ FBS في ظل ظروف الثقافة القياسية. قبل يوم واحد من التجربة بذور 5000 HEP3 B-الخلايا في 200 ميكرولترات من الثقافة المتوسطة في كل بئر من 8 شرائح الزجاج غرف.
ثم تغطية الشريحة ووضعها في حاضنة لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي إزالة المتوسطة الثقافة وشطف الخلايا مرتين مع 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني ما قبل الدافئة. إلى كل بئر من الشريحة 8 غرف إضافة 200 ميكرولترات من FBS المتوسطة الحرة التي تحتوي على 10 ميكرومولار من الغراء الجزيئي الموبوغ الفلورسنت.
بعد احتضان لمدة 3 ساعات إزالة المتوسطة الثقافة وشطف عينة الخلية مرتين مع 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني. لتصور endosomes إضافة 200 ميكرولترات من وسائل الإعلام الثقافة التي تحتوي على 100 نانومولار من صبغة فلورية حمراء إضافية مثل LysoTracker الأحمر. احتضان عينة الخلية الناتجة لمدة 20 دقيقة.
ثم إزالة المتوسطة الثقافة وشطف عينة الخلية مرتين مع 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني. بعد ذلك يرجع الخلايا إلى 200 ميكرولترات من الثقافة وسط. للحث على النقل النووي من الغراء الجزيئي المُغَلَل الفلوري المُغَلَّل في قفص مكان الخلايا تحت مصدر ضوء زينون 100 واط مجهز بـ 365 نانومتر شريطية.
تعريض الخلايا لضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة دقيقتين. خلال هذا الوقت الحفاظ على عينة الخلية التحكم دون التعرض للأشعة فوق البنفسجية في الظلام. يمكن أن تؤخذ غطاء من ركائز الزجاج قبالة للأشعة فوق البنفسجية فعالة التعرض ولكن اتخاذ الحذر كما التعرض لفترات طويلة للأشعة فوق البنفسجية قد يسبب موت الخلايا.
لتصور النوى إضافة ميكرولتر واحد من وصمة عار Hoeschst إلى الوسط ثقافة. احتضان عينة الخلية الناتجة لمدة 10 دقائق. ثم ضع العينة على خشبة المسرح من مجهر المسح الضوئي بالليزر confocal.
سجل micrographs لفلوريسسنت المصبوغة الغراء الجزيئية في قفص، وLysoTracker الأحمر، واللطخة النووية. كما هو مبين سابقا, البذور 5000 الإنسان سرطان الكبدية HEP3 الخلايا B-الخلايا في كل بئر من 8 جيدا شريحة الغرفة والثقافة في ظل الظروف القياسية لمدة 24 ساعة. توريد عينات الخلية مع 200 ميكرولترات من FBS ثقافة حرة المتوسطة التي تحتوي على الغراء الجزيئية الموبوءة الفلورية.
احتضان عينة الخلية الناتجة لمدة 3 ساعات. ثم إزالة المتوسطة الثقافة وشطف عينة الخلية مرتين مع 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني. إعادة الخلايا إلى 200 ميكرولترات من الثقافة المتوسطة.
ثم تخضع لعينة مجهرية ليزر confocal وتسجيل micrographs كما هو موضح في بروتوكول النص المرافق. كما أظهرت سابقا البذور 5000 الإنسان hepatocellular سرطان HEP3 خلايا B-الخلايا في كل بئر من 8 8 جيدا غرفة الشريحة والثقافة في ظل الظروف القياسية لمدة 24 ساعة. توريد عينات الخلية مع 200 ميكرولترات من FBS الحرة الثقافة المتوسطة التي تحتوي على 10 نانوموللار من نقطة الكم مرتبطة الغراء الجزيئي قفص.
احتضان عينة الخلية الناتجة لمدة 3 ساعات. ثم إزالة المتوسطة وشطف عينة الخلية مرتين مع 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني. بعد شطف الخلايا إعادتها إلى 200 ميكرولترات من الثقافة المتوسطة.
ثم ضع اللوحة تحت مصدر ضوء زينون بقدرة 100 واط مجهز بمصفاة 365 نانومتر. تعريض عينة الخلية لضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة دقيقتين مع الاحتفاظ بعينات التحكم في الظلام. لتصور نوى إضافة 1 ميكرولتر من وصمة عار Hoechst إلى الوسط ثقافة.
احتضان عينة الخلية الناتجة لمدة 10 دقائق. ثم صورة الخلايا باستخدام مجهر المسح الضوئي ليزر confocal. بذور سرطان الكبد البشري HEP3 B-الخلايا في اليوم السابق للتجربة في 5000 الخلايا في بئر في لوحة ثقافة 96 جيدا.
ثم تغطية الخلايا مع 200 ميكروليتر من وسائل الإعلام الثقافة ومن ثم وضع لوحة في حاضنة لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي إزالة المتوسطة الثقافة وشطف عينة الخلية مرتين مع 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني. ثم إضافة 200 ميكرولترات من FBS الحرة الثقافة المتوسطة التي تحتوي على الغراء الجزيئي الموبوغ فلوريا في تركيزات تتراوح بين 0.1 إلى 100 ميكرومولار.
احتضان لوحة لمدة 3 ساعات ومن ثم وضع لوحة تحت مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية. تعريض عينة الخلية لضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة دقيقتين مع الاحتفاظ بعينات التحكم في الظلام. بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية في 10 ميكرولترات من الخلية العد كيت - 8 كاشف إلى ثقافة المتوسطة واحتضان عينة الخلية الناتجة لمدة 2 ساعة.
ثم قراءة امتصاص العينات في 450 نانومتر باستخدام قارئ microplate. قبل التصوير الإشعاعي HEP3 B-الخلايا المحتضنة مع الغراء الجزيئي الموبوغ الفلورية في قفص معارض الانبعاثات الفلورية punctate من الداخل micrograph مماثلة تظهر الأحمر LysoTracker يشير إلى أن الغراء الجزيئي الموبوغ الفلورية كان مترجما في endosomes. وبناء على ذلك، لوحظ أن انبعاث الفلوريسنس القابلة ل وإذعان الغراء الجزيئي المصنوع الفلورية الفلورية قد لوحظ خارج نواة الخلية قبل الأشعة فوق البنفسجية.
بعد الأشعة فوق البنفسجية الفلورسنت يوحي بأن الفلورسنت المُغَلَّغ فلورياً كان غير مُجَدَّد وُجِدَ إلى السيتوبلازم و نواة الخلية. ويمكن أن تكون هذه الترجمة النووية للغراء الجزيئي المُصَجوغ الفلوري المُصَجَن مُستحثاً في الموقع بشكل انتقائي بواسطة 2-فوتون بالقرب من ضوء الأشعة تحت الحمراء. لم يفلت الغراء الجزيئي المُصَبوغ الفلوري في المناطق غير المشععة من إندوسومات وظل بمثابة مفلورة.
يمكن أن توفر علامات الغراء الجزيئي المُتذرة في قفص أيضًا ضيوفًا جزوليين صغيرًا مثل النقاط الكمية في نواة الخلية. ويمكن أن تؤخذ هذه conjugates تصل إلى الخلايا وبعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة 2 دقيقة يمكن رؤية الانبعاثات الفلورية من النقاط الكمومية داخل النواة. بعد هذا التطور مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال العلاج الجيني لاستكشاف العلاج الآثار الجانبية المنخفضة.
