Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nell'area del parto dei farmaci, ad esempio come fornire un farmaco a uno specifico cellulare-granulare. Il principale vantaggio di questa tecnica è che la traslocazione nucleare del gas può essere indotta dalla luce. A dimostrare la procedura saranno Rina Mogaki e Akio Arisaka i laureati del mio gruppo.
Per iniziare a preparare la colla molecolare a gabbia legata a punti quantici sintetizzando la colla molecolare in gabbia legata alla dibenzociclottadina come descritto più dettagliatamente altrove. Preparare una soluzione di stock di 10 millimolare della colla molecolare in gabbia legata alla dibenzociclottadina in DMSO secco. Quindi preparare la colla molecolare in gabbia collegata a punti quantici facendo prima punti quantici funzionalizzati aseye.
A tal fine aggiungere 100 microlitri di estere PEG4 NHS aseye micromolare in DMF a 400 microlitri di una soluzione DMF contenente 500 nanomolari di punti quantici rivestiti con piolo funzionalizzato all'ammina. Mescolare la miscela per un'ora a temperatura ambiente. Posizionare la soluzione risultante in una membrana di cellulosa rigenerata e dializzarla per 24 ore contro 800 ml di DMF.
Successivamente diluire la soluzione stock di colla molecolare in gabbia collegata dibenzociclottadina a 50 micromolari con DMF e aggiungerne 200 microlitri alla soluzione post dialisi. Mescolare la miscela per tre ore a temperatura ambiente. Quindi dializzare la miscela risultante per 24 ore contro 800 ml di DMF fresco utilizzando una membrana di cellulosa rigenerata con il peso molecolare tagliato di 25000.
Dopo 24 ore diluire la soluzione risultante a 200 nanomolari con DMF. Mantenere il carcinoma epatocellulare umano HEP3 B-cells nel mezzo essenziale minimo di Eagle contenente il 10%FBS in condizioni di coltura standard. Un giorno prima del seme dell'esperimento 5000 cellule B HEP3 in 200 microlitri di mezzo di coltura in ogni pozzo di uno scivolo di vetro a 8 camere.
Quindi coprire lo scivolo e posizionarlo in un'incubatrice per 24 ore. Il giorno successivo rimuovere il mezzo di coltura e risciacquare le cellule due volte con 100 microlitri di PBS prerifabburto. Ad ogni pozzo dello scivolo a 8 camere aggiungere 200 microlitri di mezzo libero FBS contenenti 10 micromolari di una colla molecolare in gabbia tinta fluorescentmente.
Dopo aver incubato per 3 ore rimuovere il mezzo di coltura e risciacquare il campione cellulare due volte con 100 microlitri di PBS. Per visualizzare gli endosomi aggiungere 200 microlitri di mezzi di coltura contenenti 100 nanomolari di un colorante fluorescente rosso aggiuntivo come LysoTracker Red. Incubare il campione di cellule risultante per 20 minuti.
Quindi rimuovere il mezzo di coltura e risciacquare il campione di cellule due volte con 100 microlitri di PBS. Successivamente riportare le cellule a 200 microlitri del mezzo di coltura. Per indurre la traslocazione nucleare della colla molecolare in gabbia tinta fluorescentmente posizionare le cellule sotto una sorgente luminosa allo xeno da 100 watt dotata di un filtro passa banda da 365 nanometri.
Esporre le cellule alla luce UV per 2 minuti. Durante questo periodo mantenere il campione della cella di controllo senza esposizione ai raggi UV al buio. Il coperchio dei substrati di vetro può essere tolto per un'efficiente esposizione ai raggi UV, tuttavia fai attenzione poiché l'esposizione prolungata alla luce UV può causare la morte cellulare.
Per visualizzare i nuclei aggiungere un microlitro di macchia di Hoeschst al mezzo di coltura. Incubare il campione di cellule risultante per 10 minuti. Quindi posizionare il campione sul palco di un microscopio a scansione laser confocale.
Registra le micrografie per la colla molecolare in gabbia tinta fluorescentmente, il LysoTracker Red e la macchia nucleare. Come mostrato in precedenza, seminare 5000 cellule B HEP3 del carcinoma epatocellulare umano in ogni pozzo di uno scivolo da camera a 8 pozzi e coltura in condizioni standard per 24 ore. Fornire ai campioni cellulari 200 microlitri di terreno di coltura libero FBS contenente la colla molecolare in gabbia tinta fluorescentmente.
Incubare il campione di cellule risultante per 3 ore. Quindi rimuovere il mezzo di coltura e risciacquare il campione di cellule due volte con 100 microlitri di PBS. Riportare le cellule a 200 microlitri di mezzo di coltura.
Quindi soggetto a microscopia a scansione laser confocale campione e registrare le micrografie come descritto nel protocollo di testo di accompagnamento. Come mostrato in precedenza, il seme 5000 cellule B HEP3 del carcinoma epatocellulare umano in ogni pozzo di uno scivolo da camera a 8 pozzi e coltura in condizioni standard per 24 ore. Fornire ai campioni cellulari 200 microlitri di terreno di coltura libero FBS contenenti 10 nanomolari della colla molecolare in gabbia collegata a punti quantici.
Incubare il campione di cellule risultante per 3 ore. Quindi rimuovere il mezzo e risciacquare il campione di cellule due volte con 100 microlitri di PBS. Dopo il risciacquo le cellule le restituiscono a 200 microlitri di mezzo di coltura.
Quindi posizionare la piastra sotto una sorgente luminosa allo xeno da 100 watt dotata di un filtro passa banda da 365 nanometri. Esporre il campione di cella alla luce UV per 2 minuti mantenendo i campioni di controllo al buio. Per visualizzare i nuclei aggiungere 1 microlitro di macchia di Hoechst al mezzo di coltura.
Incubare il campione di cellule risultante per 10 minuti. Quindi immagini le cellule usando un microscopio a scansione laser confocale. Seminare il carcinoma epatocellulare umano CELLULE B HEP3 il giorno prima dell'esperimento a 5000 cellule per pozzo in una piastra di coltura di 96 pozzi.
Quindi coprire le celle con 200 microlitri di mezzi di coltura e quindi posizionare la piastra in un'incubatrice per 24 ore. Il giorno successivo rimuovere il mezzo di coltura e risciacquare il campione di cellule due volte con 100 microlitri di PBS. Quindi aggiungere 200 microlitri di mezzo di coltura libero FBS contenente la colla molecolare in gabbia tinta fluorescentmente a concentrazioni che vanno da 0,1 a 100 micromolari.
Incubare la piastra per 3 ore e quindi posizionare una piastra sotto la sorgente luminosa UV. Esporre il campione di cella alla luce UV per 2 minuti mantenendo i campioni di controllo al buio. Dopo l'esposizione ai raggi UV a 10 microlitri del reagente Cell Counting Kit-8 al mezzo di coltura e incubare il campione di cellule risultante per 2 ore.
Quindi leggere l'assorbimento dei campioni a 450 nanometri utilizzando un lettore di micropiastri. Prima della radiazione fotografica le cellule B HEP3 incubate con colla molecolare in gabbia tinta fluorescentmente mostrano emissione di fluorescenza punctate dall'interno, una micrografia analoga che mostra il LysoTracker Red indica che la colla molecolare in gabbia tinta fluorescentmente era localizzata negli endosomi. Di conseguenza, l'emissione di fluorescenza assegnabile alla colla molecolare in gabbia tinta fluorescentmente è stata osservata al di fuori del nucleo cellulare prima della radiazione UV.
Dopo le radiazioni UV, il fluorescente suggerisce che la colla molecolare in gabbia tinta fluorescentmente non è stata apposti ed è migrata nel citoplasma e nel nucleo cellulare. Tale traduzione nucleare della colla molecolare in gabbia tinta fluorescentmente può essere indotta sito selettivamente da 2 fotoni vicino alla luce infrarossa. La colla molecolare in gabbia tinta fluorescentmente in aree non irradiate non sfuggì agli endosomi e rimase come fluorescenza puncata.
I tag di colla molecolare in gabbia dendritica possono anche fornire ospiti macromolecolari come punti quantici nel nucleo cellulare. Questi coniugati possono essere portati nelle cellule e dopo l'esposizione ai raggi UV per 2 minuti l'emissione di fluorescenza dei punti quantici può essere vista all'interno del nucleo. Dopo questo sviluppo questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della terapia genica per esplorare il trattamento a basso effetto collaterale.
