الهدف العام لهذا الإجراء هو توفير طريقة عملية لإعداد المركبات الضوئية ذات الخصائص الإضافية مثل ذوبان الماء أو القدرة على استهداف الخلايا. باستخدام إجراء تركيبي بسيط، يمكن استخدام هذه التقنية لتوسيع المختبر على المركبات المحبوسة وجعل المركبات في قفص مع خصائص إضافية دون المساس بالحساسية للضوء. يمكن إجراء هذا التوليف في مختبر قياسي حيث أن مركباتنا القفصية القابلة للانقر تكون مستقرة في التشعيع الضوئي عند إذابة المذيبات العضوية غير النيوكلية مثل ثنائي كلورو الميثان أو ثنائي الوثيل سلفوكسيد.
ومن خلال عملية البرهان على هذه العملية مع هيرونا ساساكي، سيكون أكينوبو سوزوكي، وهو طبيب ما بعد الدكتوراه، وهانامي أوكي، ووري واتاهيكي، طلاب غراد من المختبر. تبدأ بإضافة 709.6 ملليغرام من الميثانول paBhc و 397.6 ملليغرام من ن-carbonyldiimidazole في قارورة 30 ملليلتر مستديرة القاع. إضافة ستة ملليلتر الجافة من ثنائي كلورو الميثان إلى القارورة ويحرك الحل في درجة الحرارة المحيطة لمدة ساعة واحدة.
في نهاية الحضانة، إضافة 342.8 ملليغرام من 4-Dimethylaminopyridine و 552 ميكرولترات من ثلاثي بوتيل ستة الكاربامات سداسي الأمينية، واثارة الحل في درجة الحرارة المحيطة لمدة ثلاث ساعات إضافية. ثم استخدام المبخر الدوارة تحت فراغ لإزالة المذيبات والمواد المتطايرة الأخرى، واستخدام السيليكا هلام فلاش عمود الكروماتوغرافيا لتنقية المخلفات مباشرة. لتثبيت وحدة وظيفية في مجمع قفص قابل للنقر، حل 249 ملليغرام من النحاس اثنين من كبريتات خماسيات في 10 ملليلتر من المياه تبادل أيون لإعطاء 0.1 مول النحاس حل كبريتات.
حل ثمانية ملليغرام من اثنين من رئيس paBhc وهمية paclitaxel، 7.5 ملليغرام من تريس (3-هيدروكسيبروبريالوليميل)أمين، 162.4 ملليغرام من الصوديوم-ل-الأسكوربات، و 3.1 ملليغرام من 15-chloro-3، 6، 9-trioxypentyldecyl أزيديد في مذيبات مختلطة من 2.5 ملليلتر من 0.1 عازل الفوسفات الضروس و 0.5 ملليلتر من سلفوكسيد ثنائي الفينيل. بعد ذلك، إضافة 81.2 ميكرولترات من 0.1 مول النحاس حل كبريتات إلى خليط التفاعل ويحرك الخليط في درجة الحرارة المحيطة لمدة 80 دقيقة، ورصد تقدم التفاعل مع HPLC. في نهاية التفاعل، حل الانفعالات مع 3.5 ملليلتر من 75٪ محلول المياه اسيتيل نيتريل وتطبيق الحل الناتج مباشرة إلى نظام HPLC شبه إعداد لتنقية المنتج المطلوب.
لقياسات كفاءة الكم، تحت مصابيح الفلورسنت المغطاة مع الأشعة فوق البنفسجية قطع مرشح، وتمييع محلول المخزون عينة في 10 ميكرولترات من ثنائي الفينيل سلفوكسيد مع 10 ملليلتر من حاجز KMOPS. نقل aliquot من الحل في نفس أنبوب الاختبار المستخدمة في رد فعل الصورة من actinometer الكيميائية. تشعيع حل العينة مع ضوء 350 نانومتر لمدة خمس ثوان، وإزالة 50 aliquoter ميكرولتر من الحل المشعر بشكل دوري لتحليلها من قبل HPLC.
ثم تحديد وقت التشعيع في ثوان في 90٪ من المواد بدءا رد فعل من خلال تركيب المؤامرات من اختفاء الوقت تعتمد على المواد بدءا. بالنسبة لاستهداف يغاند HaloTagnd لمركب قابل للانقر على قفص، حصاد السكان الخلية المستهدفة من الفائدة مع كاشف تفكك الخلايا المناسبة وإعادة تعليق الخلايا في 2.5 مرة 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر من تركيز DMEM. ثم بذور ما يقرب من 10 إلى الخلايا الخامسة في الطبق الواحد في 35 ملليلتر أطباق القاع الزجاج لاحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية وثاني أكسيد الكربون 5٪.
في صباح اليوم التالي، تمييع 14 ميكروغرام من الحمض النووي PC ثلاثة تحليلية عامل نمو البشرة مستقبلات الحمض النووي البلازما في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير 1.5 ملليلتر تحتوي على 700 ميكرولترات من متوسطة المصل منخفضة. بعد ذلك، أضف خمسة ميكرولترات من كاشف الشفط في 150 ميكرولترات من متوسطة المصل المنخفضة لكل من أربعة أنابيب والسماح للأنبوب بالوقوف في درجة الحرارة المحيطة لمدة خمس دقائق. في نهاية الحضانة، إضافة 150 ميكرولترات من الحمض النووي البلازما المخفف إلى كل من العينات مفكك الدهون المخففة واحتضان العينات في درجة الحرارة المحيطة لمدة خمس دقائق إضافية.
في نهاية الحضانة ، شطف الخلايا مع مليلترين من برنامج تلفزيوني لكل طبق وإضافة 1.5 ملليلتر من متوسطة المصل المخفضة لكل ثقافة. إضافة 150 ميكرولترات من مجمع الكشف شفط البلازميد إلى كل طبق وإعادة الخلايا إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة 48 ساعة. في نهاية الحضانة، pirnatate االنبات وإضافة ملليلتر واحد من DMEM الطازجة التي تم إعدادها تكملها مع اثنين من paBhc الدقيقة الهك HEX فيتزي هالة لكل طبق.
بعد 30 دقيقة في 37 درجة مئوية، التعرق المتوسطة التي تحتوي على مركب في قفص وشطف الخلايا مرتين مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني زائد لإزالة أي مركبات غير منضمة. إضافة 500 ميكرولترات من متوسطة المصل المخفضة لكل طبق وإعادة الخلايا إلى حاضنة زراعة الخلايا لمدة 30 دقيقة أخرى لإزالة المركبات التي دخلت الخلايا. في نهاية الحضانة، شطف الخلايا مرتين مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني زائد لكل طبق وإضافة ملليلتر واحد من المتوسطة دون الفينول الأحمر إلى كل ثقافة.
ثم تسجيل الصور فلوريسنس عن طريق مسح الليزر المجهر فلورانس confocal. بالنسبة للتشكيل بوساطة الصور لتعريب كيناز باستخدام مركب قابل للانقر على القفص ، بذور ما يقرب من خمس مرات 10 إلى الخلايا الخمس TOC-A-One في ملليلترين من متوسط F12 من هام لكل طبق قاع زجاجي 35 ملليلتر. في اليوم التالي، transfect الخلايا مع ترميز البلازميد لـ GFP diacylglycerol غاما لمدة 48 ساعة كما هو موضح فقط.
بعد نهاية transfection، استبدال نابرات transfection مع مليلترين من متوسطة المصل مخفضة. إضافة 20 microliters من 100 مرة paBhcAA حل العمل للخلايا لمدة خمس إلى 60 دقيقة حضانة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في نهاية الحضانة، ضع الطبق على المرحلة الموضوعية من مجهر الفلورسنت المقلوب المجهزة بمصباح فلورينسين مصدر الضوء المزدوج.
صورة الخلايا كل 10 ثوان لمدة 10 دقائق أثناء تشعيع الخلايا في الوقت التجريبي المناسب والنقاط طول الموجة وفقا للبروتوكول التجريبي. باستخدام هذه الطريقة كما أظهرت، يمكن تجميع المركبات المحبوسة القابلة للانقر من بعض الجزيئات مثيرة للاهتمام بيولوجيا، بما في ذلك باكليتاكسيل وحمض arachidonic، بنجاح. خصائص إضافية مثل ذوبان المياه وقدرة استهداف الخلوية يمكن أن يتم إدخالها في paBhc نموذج paclitaxel عبر النحاس واحد حفزت الدراجات رد فعل فوق.
ويمكن بعد ذلك أن تكون هذه paclitaxels القابلة للانقر على قفص مزيل ضوئي لإنتاج المركبات الأم عند التشعيع في 350 نانومتر. ويرد في الجدول موجز للخصائص الفيزيائية والضوئية الكيميائية للمركبات المحبوسة. في تجارب الخلايا الحية، واستهداف paBhc ست عشري فيتزي هالة ل الخلايا الثديية المستزرعة تعبر بشكل عابر عن البروتين HaloTagged ومستقبلات عامل النمو البشرة يحفز إشارة فلوريسكنس الخضراء من الفلوريسين مويتي PAHBHC hex fitzi الهالة على غشاء الخلية.
وعلاوة على ذلك، فإن علاج CHO-K1 الخلايا تعبر بشكل عابر GFP diacyl الجليسرول كيناز غاما مع حمض arachidonic يسبب تعديل التعريب دون الخلوية من جاما diacyl الجليسرول كيناز. كما لوحظت تغيرات مماثلة في diacyl الجليسيرول كيناز جاما توطين في paBhc-AA الخلايا المعالجة بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية الخفيفة. عند تنفيذ التجارب caging في المحاليل مائي زيادة ثقافة المتوسطة، تأكد من أن تعمل دائما تحت مصباح الفلورسنت مع موجة قصيرة طول مرشح توج.
بعد هذا الإجراء، يمكنك دراسة المركبات المحبوسة التي كانت وفيرة للاستخدام في التجارب البيولوجية بسبب نقص ذوبان الماء، نفاذية الأغشية أو القدرة على استهداف الخلايا.
