역 전사를 분석하기위한이 새로운 방법은 복고풍 바이러스학 분야에 대한 새로운 것을 우리에게 알 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 세포 제한 요인이 어떻게 작동하는지 또는 항 레트로 바이러스 약물이 HIV1 DNA 합성을 억제하는 방법에 대한 세부 사항에 대해 배울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 낙도 역 트란 스크립의 시퀀스에 대한 정보를 제공 할뿐만 아니라 단일 핵 타이트 해상도에서 정확한 3 프라임 DNA 테르미니를 매핑 할 수 있다는 것입니다.
HIV1 감염된 세포의 도매 DNA에서 HIV1 무료 DN의 농축, 하이브리드 캡처에 의해 수행되고 PCR 워크 스테이션에서 수행되어야한다. 단일 마이크로 원심 분리기 튜브에 튜브를 배치하는 하나의 마이크로 원심 분리기 튜브에 샘플 당 구슬의 백 마이크로 리터를 향하고 파이프에 의해 자기 스트렙타 비딘 구슬의 마스터 믹스를 준비마이크로 원심 분리튜브에 적합한 자석에 튜브를 배치합니다. 구슬이 튜브의 자석 측쪽으로 정착한 후, 저장 버퍼를 제거하고, 자석에서 튜브를 제거하고, 쓰레기통 세척 또는 BW 버퍼의 500 마이크로리터에서 구슬을 다시 중단한다.
튜브를 자석에 다시 놓고 구슬이 자석으로 이동될 때까지 기다렸다가 상퍼를 제거합니다. 자석에서 튜브를 제거하고, 카제인 용액의 500 마이크로 리터를 추가하고, 구슬을 다시 일시 중단하고, 10 분 동안 실온에서 배양하십시오. 10분 후, BW 버퍼로 구슬을 씻는다.
튜브를 자석에 다시 놓고, 상류체를 제거하고 BW 버퍼의 500 마이크로 리터에 구슬을 다시 일시 중단합니다. 각 포획된 바이오티니드 올리고뉴클레오티드의 50피코몰을 샘플당 추가합니다. 30 분 동안 엔드 믹서를 통해 끝에서 흔들면서 실온에서 배양.
다음으로, 튜브를 자석으로 되돌리고, 상체를 제거하고, 자석에서 튜브를 제거하고, 1x 10 버퍼의 500 마이크로리터를 추가하고, 구슬을 다시 중단한다. 두 번째 세척 후 재시당 10개의 완충제의 10개의 마이크로리터에서 고정된 올리고뉴클레오티드로 구슬을 중단한다. 각 샘플에 대해, 1개의 미세 한 체산분리튜브를 라벨과 비드 현탁액의 10 마이크로리터, DNA의 백칠칠 마이크로리터, 3x 10 완충제의 90 마이크로리터를 추가합니다.
DNA를 분해하기 위해 섭씨 90도에서 건조한 열 블록에 2 분 동안 배양하십시오. 튜브를 섭씨 502도로 설정된 다른 건조한 열 블록으로 이동하고 1시간 동안 배양합니다. 이 잠복기 동안 10 분마다 튜브를 섞어 반전시면 됩니다.
1시간 배양이 완료되면 1x 10 버퍼의 500 마이크로리터로 구슬을 한 번 씻고, 뉴클레아제 프리 워터의 35마이크로리터에서 다시 중단한다. 액체를 제거하기 전에 약 3 분 동안 자석에 튜브를 두어 구슬이 잘 정착해야합니다. 엘루트하려면 2 분 동안 건조한 열 블록에서 90 섭씨 90도에서 튜브를 배양하십시오.
그런 다음 튜브를 한 번에 하나의 튜브인 자석으로 빠르게 이동합니다. 구슬이 튜브 의 측면에 바인딩되면 HIV1 DNA를 포함하는 상체를 신선한 튜브로 옮길 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면, 뉴클레아제 자유 수에서 백 마이크로 몰라에서 lyophilized 어댑터를 다시 중단하고 튜브를 소용돌이.
샘플당 1개의 대조군 샘플과 1개의 대조군 샘플은 10x T4 DNA 리구아제 완충제의 4개의 5마이크로리터, 어댑터 4개, 뉴클레아제 프리 워터의 5마이크로리터 를 0점으로 결합합니다. 2분 동안 섭씨 90도까지 가열한 다음 PCR 기계에서 섭씨 16도까지 천천히 식힙니다. 이렇게 하면 어댑터가 헤어 핀 구조를 형성할 수 있습니다.
이 절차의 중요한 단계는 3-프라임 DNA termini를 열기 위하여 적응한 분자의 효율적이고 편견없는 결찰입니다. 다양한 길이의 정제 된 초기 cDNA 분자는 T4 DNA 리개아제를 사용하여 헤어 핀 단일 좌초 DNA 어댑터로 리게된다. 어댑터는 임의의 6개의 뉴클레오티드 바코드 서열을 전달하여 파잉을 용이하게 하고 동시에 고유한 읽기를 위한 식별자로 작용합니다.
3-프라임 테르미니 어댑터는 자체 결찰을 방지하기 위해 스페이서를 운반합니다. 60 마이크로리터 최종 볼륨 결찰 반응을 설정하려면 각 PCR 튜브에 다음을 추가합니다: 10x T4 DNA 리게아제 버퍼의 6 마이크로리터, 40%의 PEG의 24마이크로리터, 5개의 어퍼 베타인의 마이크로리터 6개, 어댑터 의 4점 5마이크로리터, T4 DNA 리그의 1점 2마이크로리터, 18개의 마이크로리터를 추가합니다. 반응을 잘 혼합 한 후 밤새 섭씨 16도에서 PCR 기계에서 배양하십시오.
어댑터 결찰 다음 날, 각 결찰 반응에 DNA 젤 로딩 버퍼를 함유한 포름아미드의 30마이크로리터에서 파이프 헤딩으로 잘 섞는다. PCR 기계에서 섭씨 90도에서 2분간 가열한 다음 즉시 얼음을 착용합니다. 다음 단계는 겔 전기 포동을 데마화할 준비를 하는 것입니다.
적절한 젤 탱크에 6% TBE 데나포링 우레아 폴리아크릴아미드 젤을 넣고 1x TBE 러닝 버퍼를 추가합니다. 20 분 동안 젤을 미리 실행합니다. 다음으로 주사기와 21게이지 바늘을 사용하여 러닝 버퍼로 젤 포켓을 씻어낸다.
그런 다음 동일한 샘플의 우물당 30 마이크로리터를 3개의 우물에 적재합니다. 교차 오염을 피하기 위해 젤 당 하나의 샘플만 실행하는 것이 좋습니다. 20분 동안 실행하십시오.
젤이 실행되는 동안, 21 게이지 주사기 바늘을 사용하여 샘플 당 3 0 점 5 밀리리터 미세 센심 분리기 튜브를 준비하여 바닥에 구멍을 찌르십시오. 준비된 각 튜브를 2밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 삽입하고 샘플 이름과 낮음, 중간 또는 높음으로 라벨을 부착합니다. 진한 파란색 염료 전면이 젤을 통해 약 절반 정도인 경우 전기 포근을 멈추고 젤 카세트를 제거하십시오.
프라이카세트를 열고 면도날로 젤을 수직으로 자른다. 로드 된 샘플의 세 우물스트립을 관대하게 소비합니다. 젤 스트립을 1x TBE와 5마이크로리터의 시아닌 핵산 얼룩을 넣고 3~5분 동안 배양합니다.
나중에 제거해야 하는 프리 어댑터의 상단을 쉽게 식별하기 위해 염색이 충분하도록 하십시오. 다음으로, 증류드 드 이온화물로 청색광 트랜틸루미에이터의 표면을 철저히 청소한다. 그런 다음 염색 용기에서 젤 조각을 꺼내 라이트 박스에 놓습니다.
라이트 박스를 켜고 오렌지 필터를 통해 스테인드 핵산을 검사합니다. 스테인드 젤에 대표적인 계찰 DNA 샘플이 여기에 나와 있다. 어댑터는 일반적으로 과부하 된 것처럼 나타나고 젤리 HIV1 DNA가 줄무늬로 실행되는 큰 Blob로 실행됩니다.
빨간색 선은 젤이 무료 어댑터를 제거하고 샘플을 세 개의 짝수 조각으로 나누기 위해 절단되어야 하는 부위를 나타냅니다. 새로운 면도날을 사용하여 샘플이 없는 영역이 아직 남아 있으면 젤의 측면을 잘라냅니다. 다음으로 어댑터 바로 위를 잘라 어댑터와 하부 젤 부품을 제거합니다.
마지막으로, 젤 포켓의 약 1 밀리미터를 포함하여 겔의 맨 위를 잘라 내어 종종 더 높은 분자량 DNA의 날카로운 강렬한 신호를 갖는다. 샘플을 수평으로 포함하는 나머지 젤 조각을 세 개의 짝수 조각으로 나눕니다. 낮은, 중간 및 높은 분자량 영역.
그런 다음, 3개의 젤 조각을 각각 2mm 단위로 자르고 준비된 제로 포인트 5 밀리리터 미세원심분리기 튜브로 옮기습니다. 1 분 동안 열린 뚜껑으로 최고 속도로 회전하십시오. 두 밀리리터 튜브에 구멍을 통해 젤 조각을 짜내젤 슬러시를 만들 수 있습니다.
어떤 젤 입자가 제로 포인트 5 밀리리터 튜브의 바닥에 남아 있는 경우, 바늘을 사용하여 수동으로 2 밀리리터 튜브로 옮기다. 각 미세 원심 분리기 튜브의 젤 슬러시에 우레아 젤 추출 버퍼 1 밀리리터를 추가하여 DNA 추출 절차를 시작합니다. 최소 3시간 동안 실온에서 엔드 오버 엔드 믹서로 튜브를 회전시다.
필터 열을 준비합니다. 깨끗한 핀셋 세트를 사용하여 각 원심분리기 컬럼에 셀룰로오스 아세테이트 멤브레인 필터를 추가하여 멤브레인 막힘을 방지합니다. 반전 된 파이프 헤드 팁으로 필터를 제자리에 놓습니다.
젤 슬러시 및 추출 버퍼로 두 밀리리터 튜브를 미세 원심 분리기에서 잠시 회전시키고, 준비된 필터 컬럼에 슈퍼나탄의 700 마이크로리터를 전송합니다. 1분 동안 최고 속도로 미세원심분리기의 필터 컬럼을 원심분리합니다. 그런 다음 흐름을 새로운 2 밀리리터 미세 원심 분리튜브로 전달합니다.
나머지 상체로 열을 다시 로드합니다. 추출 슬러시에서 가능한 한 많은 액체를 얻으려고 시도하고 젤 조각이 포함되어있는 경우 걱정하지 마십시오. 다시 회전합니다.
동일한 추출 샘플의 흐름을 결합하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 진행합니다. 이 프로토콜은 항레트로바이러스 인간 단백질 A3G의 부재 또는 존재에서 Vif-결핍 HIV-1에 감염된 CEMS-ST 세포로부터의 샘플에서 사용되었다. 각 샘플에서 얻은 총 고유 읽기 수의 플롯은 A3G의 증가수준이 총 읽기 수를 감소시키는 것을 나타냅니다.
역전사중재 된 진두 합성에 A3G의 억제 효과를 반영. 이 다음 세 가지 플롯에서, 처음 백 팔십 두 뉴클레오티드 내에서 각 가능한 길이에서 분자의 분획은 파란색 히스토그램으로 표시됩니다. A3G의 추가는 몇몇 아주 특정 재현 가능한 위치에서 짧은 잘린 된 dna dna 분자의 급격한 증가를 요합니다.
파선 된 빨간색 선은 각 위치에서 C를 T 돌연변이로 운반하는 읽기의 백분율을 보여줍니다. 양수 대조군은 알고 있는 서열, 길이 및 농도의 합성 올리고뉴클레오티드 풀을 처리하여 생성될 수 있다. 모든 분자는 작은 변이만으로 동등한 풍부에 가깝게 나타나야 합니다.
라이브러리 실행이 시퀀싱에서 작은 길이 바이어스를 생성하는 경우 크기 바이어스를 나타내는 경사에서 파생된 정규화 계수를 적용하는 것이 좋습니다. 이 절차는 DNA 분자의 3개의 주요 끝을 결정하는 것이 핵산 물질 대사의 다에 중요한 통찰력을 추가할 그밖 시스템에 쉽게 적응될 수 있습니다. HIV에 대한 작업은 매우 위험할 수 있으며 일부 감염은 지정된 안전 실험실에서만 수행되어야 한다는 것을 잊지 마십시오.
