في هذا الفيديو، نحن وصف طريقة بسيطة وفعالة لتصور وتحليل ذخيرة الأجسام المضادة على المستوى العالمي. من الممكن وصف ذخيرة الخلية B بأكملها لدى الأفراد وتغيراتها الديناميكية استجابة للتحفيز المناعي. يمكن تطبيق هذه الطريقة لتحليل العينات المرضية من المرضى من العدوى الفيروسية الناشئة والحصول على البيانات مع نظرة غير مسبوقة في التسبب في العدوى.
ومن أكثر المجالات إثارة في هذا التطبيق هو مكافحة اللقاحات. يمكن تقييم فعالية اللقاح من خلال تحليل ديناميات ذخيرة الأجسام المضادة العالمية لدى الأفراد الذين يُدارون باللقاحات. الفرد جديدة لهذه الطريقة قد تحتاج إلى تحسين شروط PCR لأن كفاءة تضخيم الجينات المضادة للأجسام يعتمد على أنواع المواد الأولية.
Fla-cher لتحديد الأمبلونات المناعية. من المهم إظهار هذه الإجراءات بصريا. وسوف يكون إثبات الإجراء الآنسة سايوري ياماغوتشي والسيد هانبينغ شيويه، وهو فني وطالب دراسات عليا من مختبري.
لبدء هذا الإجراء، تشريح الأنسجة من ثمانية أسابيع من ماوس أسود C57 وتمريرها من خلال شبكة الفولاذ المقاوم للصدأ مع ملليلترين من برنامج تلفزيوني للحصول على الخلايا المتناثرة. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب microcentuge ميليلتر اثنين وطاردة مركزية في 600 مرة ز و 4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق. تجاهل supernatant وإضافة 800 ميكرولترات من ACK lysing العازلة إلى بيليه.
احتضان على الجليد لمدة دقيقتين لخلود خلايا الدم الحمراء في الأنسجة. بعد ذلك ، قم بغسل خلايا الأنسجة ثلاث مرات باستخدام ثلاثة ملليلترات من PBS لكل غسل. مرة أخرى في جهاز طرد مركزي 600 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق.
تجاهل supernatant وإضافة 800 ميكرولتردات من الفينول / guanidine isothiocyanate كاشف إلى بيليه ودوامة تماما. احتضان في 25 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. ثم، إضافة 200 ميكرولترات من الكلوروفورم ويهز يدويا لمدة 15 ثانية.
احتضان في 25 درجة مئوية لمدة دقيقتين. أجهزة الطرد المركزي في 12،000 مرة ز و 25 درجة مئوية لفصل المراحل. نقل المرحلة مائي العلوي إلى أنبوب جديد.
إضافة حجم واحد من 70٪ الإيثانول. دوامة لفترة وجيزة وتطبيق هذا الخليط على العمود تدور السيليكا. Elute الجيش الملكي النيبالي مع 30 إلى 100 ميكرولترتر من الماء.
بعد ذلك، استخدمي مقياس الفلور لكميات تركيز الحمض النووي الريبي الأولي. تخزين RNA المنقى في ناقص 80 درجة مئوية. أولا، توليف cDNA أول حبلا من اثنين إلى 10 ميكروغرام من مجموع RNA قالب باستخدام 5'RACE CDS التمهيدي وOLIGONUcleotide سمارت-PCR وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
بالنسبة للغلوبولين المناعي للماوس، يضخّم PCR cDNA مع بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة، وذلك باستخدام التمهيدي الأمامي الشامل والغلوبولين المناعي الخاص بالطبقات، كما هو موضح في بروتوكول النص. بالنسبة للغلوبولين المناعي البشري، قم بإجراء أول PCR باستخدام التمهيدي الأمامي الشامل والغلوبولين من فئة محددة مع تسلسلات العلامات. تضمين تسلسلات الفهرس لكل عينة بواسطة PCR الثانية باستخدام التمهيديات تسلسل الفهرس.
بعد ذلك، electrophorese أي من المنتجات PCR على هلام agarose 2٪. تصور نطاقات الحمض النووي على transilluminator UV واستئصال شريحة هلام تحتوي على النطاق العريض بين 600 و 800 أزواج قاعدة. إضافة 10 ميكرولترات من محلول ملزم للأغشية لكل 10 ملليغرام من شريحة هلام.
مزيج واحتضان في 50 إلى 65 درجة مئوية حتى شرائح هلام تذوب تماما. ثم، نقل حل هلام على عمود تدور غشاء السيليكا. غسل العمود مرة واحدة مع عازلة الغسيل و elute الحمض النووي مع 50 ميكرولترات من المياه الخالية من النوى.
باستخدام الفلور، وتحديد كمي amplicons المنقى وتجمع amplicons من كل فئة من الغلوبولين المناعي في كميات متساوية لتسلسل NGS. بعد ذلك، استخدم كهرباء تعتمد على الكابيل المجهري مع رقاقة التحجيم للحمض النووي لتحديد حجم المكتبات وتركيزها. تخزين المكتبات في ناقص 20 درجة مئوية.
أولاً، قم بإنشاء جدول بيانات عينة من تشغيل التسلسل كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد ذلك، اذيب خرطوشة الكاشف والمكتبات. جعل الحل الطبيعي 0.2 من هيدروكسيد الصوديوم وتمييع المكتبات للحصول على التركيزات الولي المطلوب.
ثم شطف وتجفيف الخلية تدفق وإضافة 600 ميكرولترات من حل مكتبة مخففة ومشوهة في بئر خرطوشة الكاشف، والبدء في تشغيل تسلسل. يمكن الحصول على منظور لذخيرة الأجسام المضادة للورين ككل من خلايا أو أنسجة مثل الطحال أو نخاع العظم أو العقدة الليمفاوية أو الدم. تظهر هنا نتائج تمثيلية لـ IgM وIgG1 وIgG2c وسلسلة الغلوبولين المناعية الخفيفة من طحال الماوس الساذج.
في V(D) J إعادة ترتيب بواسطة 3D V (D) J مؤامرة، حجم كل كرة يمثل العدد النسبي من يقرأ. وبعبارة أخرى، فإنه يمثل عدد من الأجسام المضادة mRNAs في الخلايا B كاملة. تتكون الشبكة ثلاثية الأبعاد من 110 جينات سلسلة الغلوبولين الثقيلة V، و12 جينات سلسلة الغلوبولين الثقيلة D، وأربعة جينات سلسلة الغلوبولين الثقيلة مناعية J، والتي تتماشى لتعكس ترتيبها على الكروموسوم.
تُظهر مؤامرة VJ 2D ملف إعادة ترتيب VJ في ذخيرة IGL. يمثل طول كل شريط عدد القراءات النسبي. ويمثل المحور X 101 من سلسلة الضوء مناعية الغلوبولين V-كابا الجينات, وثلاثة الجينات V-لامدا سلسلة الضوء مناعية, ويمثل المحور Y أربعة الجينات J-كابا سلسلة الضوء المناعية, وثلاثة الجينات J-لامدا سلسلة ضوء الغلوبولين المناعي.
يمكن تحليل منظور لذخيرة الأجسام المضادة البشرية ككل من أنسجة مختلفة بما في ذلك خلايا الدم أحادية النواكل المحيطية أو الأنسجة المرضية. تظهر هنا النتائج التمثيلية لـ IgM، وإجمالي IgG، وإجمالي IgA، وIgD، وIgE، وIgL من خلايا أحادية النوى الدموية الطرفية الطبيعية. مثل نموذج murine ، يظهر ملف تعريف ذخيرة من V (D) J إعادة ترتيب على 3D V(D) J مؤامرة فيها حجم كل كرة يمثل العدد النسبي من القراءات.
تتكون الشبكة ثلاثية الأبعاد من 56 جينات سلسلة الغلوبولين الثقيلة V ، و 27 جينات سلسلة الغلوبولين الثقيلة D ، وستة جينات سلسلة الغلوبولين الثقيلة مناعية J ، تتماشى في الترتيب الذي تظهر عليه على الكروموسوم. يتم تصوير ملف إعادة ترتيب VJ في مرجع IgL في مؤامرة VJ 2D حيث يمثل طول كل شريط العدد النسبي من القراءات. ويمثل المحور X 41 من سلسلة الضوء مناعية الغلوبولين V-كابا الجينات, و 32 مناعيا سلسلة الضوء V-لامدا الجينات, ويمثل المحور Y خمسة الجينات J-كابا سلسلة ضوء الغلوبولين المناعي, وخمسة الجينات J-لامدا سلسلة ضوء الغلوبولين المناعي.
في المواد الدراسية لهذا البروتوكول ، وعدد قليل من الخلايا فرزها عن طريق تدفق الخلايا أو حتى بكيريف العينات المرضية قابلة للاستخدام. ومع ذلك، سيكون من الضروري تحسين ظروف نظام PCR بعناية. لأن المعلومات الناتجة من هذا البروتوكول ضخمة ، ومحو الأمية المعلوماتية الحيوية من شأنه أن يساعد على العثور على هيكل شبكة الأجسام المضادة.
وهذا من شأنه أن يؤدي إلى فهم عميق للجهاز المناعي.
