En este vídeo, describimos un método simple y eficiente para visualizar y analizar un repertorio de anticuerpos a nivel global. Es posible describir repertorios de células B enteras en individuos y sus cambios dinámicos en respuesta a la estimulación inmune. Este método se puede aplicar para analizar muestras patológicas de pacientes de infecciones virales emergentes y para obtener los datos con una visión sin precedentes de la patogénesis de la infección.
Una de las áreas más emocionantes para la aplicación es un control de vacunas. La eficacia de la vacuna se puede evaluar analizando la dinámica del repertorio mundial de anticuerpos en individuos administrados por vacunas. Los individuos son nuevos en este método pueden necesitar optimizar las condiciones de PCR porque la eficiencia de la amplificación del gen de anticuerpos depende de los tipos de materiales de partida.
Fla-cher para la identificación de amplicons de inmunoglobulina. Es importante demostrar estas acciones visualmente. Sayuri Yamaguchi y el Sr.Hanbing Xue, técnico y estudiante de posgrado de mi laboratorio.
Para comenzar este procedimiento, diseccione el tejido de un ratón de seis negros C57 de ocho semanas de edad y páselo a través de una malla de acero inoxidable con dos mililitros de PBS para obtener células dispersas. Transfiera la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros y centrífuga a 600 g y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y agregue 800 microlitros de tampón de lesing ACK al pellet.
Incubar sobre hielo durante dos minutos para linsear los glóbulos rojos en el tejido. A continuación, lave las células de tejido tres veces usando tres mililitros de PBS para cada lavado. Centrifugar de nuevo a 600 veces g y cuatro grados Celsius durante cinco minutos.
Deseche el sobrenadante y agregue 800 microlitros de reactivo de isotiocianato de fenol/guanidina al pellet y al vórtice a fondo. Incubar a 25 grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, agregue 200 microlitros de cloroformo y agite manualmente durante 15 segundos.
Incubar a 25 grados centígrados durante dos minutos. Centrifugar a 12.000 veces g y a 25 grados centígrados para separar las fases. Transfiera la fase acuosa superior a un tubo fresco.
Añadir un volumen de 70%etanol. Vortex brevemente y aplicar esta mezcla a la columna de giro de sílice. Eluir el ARN con 30 a 100 microlitros de agua.
Después de esto, utilice un fluorómetro para cuantificar la concentración inicial de ARN. Almacene el ARN purificado a menos 80 grados centígrados. En primer lugar, sintetice el ADNc de primera hebra de dos a 10 microgramos de la plantilla de ARN total utilizando la imprimación 5'RACE CDS y el oligonucleótido SMART-PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Para la inmunoglobulina de ratón, PCR amplifica el ADNn con la polimerasa de ADN de alta fidelidad, utilizando la imprimación delantera universal y las imprimaciones inversas específicas de la clase de inmunoglobulina, como se describe en el protocolo de texto. Para la inmunoglobulina humana, realice la primera PCR utilizando la imprimación delantera universal y las imprimaciones inversas específicas de la clase de inmunoglobulina con secuencias de etiquetas. Incluya las secuencias de índice para cada muestra por segundo PCR utilizando imprimaciones de secuencia de índice.
A continuación, electroforese cualquiera de los productos de PCR en un gel de 2% agarosa. Visualice las bandas de ADN en un transilluminador UV e excime la rebanada de gel que contiene la banda ancha entre 600 y 800 pares base. Añadir 10 microlitros de solución de unión a membranas por cada 10 miligramos de rodaja de gel.
Mezclar e incubar a 50 a 65 grados Centígrados hasta que las rodajas de gel se disuelvan por completo. A continuación, transfiera la solución de gel a la columna de centrifugado de membrana de sílice. Lave la columna una vez con el tampón de lavado y eluva el ADN con 50 microlitros de agua sin nucleasas.
Usando un fluorómetro, cuantifique los amplicons purificados y acomoda los amplicons de cada clase de inmunoglobulina en cantidades iguales para la secuenciación de NGS. Después de esto, utilice una electroforesis a base de microcapilar con chip de tamaño de ADN para determinar el tamaño y la concentración de las bibliotecas. Almacene las bibliotecas a menos 20 grados centígrados.
En primer lugar, genere una hoja de cálculo de ejemplo de la ejecución de secuenciación como se describe en el protocolo de texto. A continuación, descongele un cartucho de reactivo y las bibliotecas. Hacer una solución normal 0.2 de hidróxido de sodio y diluir las bibliotecas para obtener las concentraciones molares deseadas.
A continuación, enjuague y seque la celda de flujo y agregue 600 microlitros de la solución de biblioteca diluida y desnaturalada en el pozo del cartucho de reactivo, e inicie el proceso de secuenciación. Una perspectiva de un repertorio de anticuerpos murinos en su conjunto se puede obtener a partir de células o tejidos como el bazo, la médula ósea, el ganglio linfático o la sangre. Aquí se muestran los resultados representativos de los repertorios de cadena ligera IgM, IgG1, IgG2c e inmunoglobulina de un bazo de ratón ingenuo.
En la gráfica Reordenación V(D)J por 3D V(D)J, el tamaño de cada bola representa el número relativo de lecturas. En otras palabras, representa el número de mRNAs de anticuerpos en células B enteras. La malla 3D consta de 110 genes V de cadena pesada de inmunoglobulina, 12 genes de cadena D de inmunoglobulina y cuatro genes J de cadena pesada de inmunoglobulina, que están alineados para reflejar su orden en el cromosoma.
La trama 2D VJ muestra el perfil de reordenamiento de VJ en el repertorio de IGL. La longitud de cada barra representa el número relativo de lecturas. El eje X representa 101 genes V-kappa de cadena ligera de inmunoglobulina y tres genes V-lambda de cadena ligera de inmunoglobulina, y el eje Y representa cuatro genes J-kappa de cadena ligera de inmunoglobulina y tres genes J-lambda de cadena ligera de inmunoglobulina.
Una perspectiva de un repertorio de anticuerpos humanos en su conjunto se puede analizar desde varios tejidos, incluyendo células mononucleares de sangre periférica o tejidos patológicos. Los resultados representativos de los repertorios de IgM, IgG total, IgA total, IgD, IgE e IgL de células mononucleares de sangre periférica normal se muestran aquí. Al igual que el modelo murino, el perfil de repertorio de reordenamiento V(D)J se muestra en la trama 3D V(D)J en la que el tamaño de cada bola representa el número relativo de lecturas.
La malla 3D consta de 56 genes V de cadena pesada de inmunoglobulina, 27 genes de cadena D de inmunoglobulina y seis genes J de cadena pesada de inmunoglobulina, alineados en el orden en que aparecen en el cromosoma. El perfil de reordenamiento de VJ en el repertorio de IgL se representa en la trama 2D VJ en la que la longitud de cada barra representa el número relativo de lecturas. El eje X representa 41 genes V-kappa de cadena ligera de inmunoglobulina y 32 genes V-lambda de cadena ligera de inmunoglobulina, y el eje Y representa cinco genes J-kappa de cadena ligera de inmunoglobulina y cinco genes J-lambda de cadena ligera de inmunoglobulina.
En el material de estudio de este protocolo, un pequeño número de células ordenadas por citometría de flujo o incluso criocciones de muestras patológicas son utilizables. Sin embargo, será necesaria una optimización cuidadosa de las condiciones de PCR. Debido a que la información de salida de este protocolo es enorme, la alfabetización bioinformática ayudaría a encontrar la estructura de la red de anticuerpos.
Eso llevaría a un sin preparación a una comprensión profunda del sistema inmunológico.
