Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la fisiología vascular cerebral en lo que se refiere a la regulación del flujo sanguíneo cerebral durante el envejecimiento y el desarrollo de enfermedades crónicas. La principal ventaja de esta técnica es que permite la medición simultánea del calcio intracelular y el potencial de membrana del endotelio arterial cerebral en su forma nativa en condiciones fisiológicas. Para aislar el cerebro del ratón, bajo el microscopio eliminar la piel y el cabello sobre el cráneo.
Y elimina la sangre excesiva con PSS sin calcio frío. A continuación, haga una incisión usando sólo las puntas de las tijeras de disección estándar. Comenzando desde el hueso occipital y extendiéndose a través del hueso nasal del cráneo.
Luego abre su cráneo cuidadosamente a lo largo de la incisión, usando fórceps de punta gruesa y separa el tejido conectivo para exponer el cerebro. Lave suavemente el cerebro aislado con PSS frío sin calcio en un vaso de precipitados para extraer la sangre. Coloque el lado ventral cerebral hacia arriba en una cámara que contenga solución de disección fría para el aislamiento de las arterias cerebrales.
Para aislar las arterias cerebrales, asegure el cerebro aislado en solución de disección en frío insertando dos pasadores de acero inoxidable a través de él, en un recubrimiento de polímero de silicio infundido al carbón en la parte inferior de una placa Petri de vidrio. Posteriormente, aísle quirúrgicamente las arterias cerebrales posteriores alrededor de 0,3 a 0,5 centímetros de segmentos de las arterias comunicantes posteriores y basilar. Utilice pasadores de acero inoxidable para asegurar ambas arterias cerebrales posteriores aisladas en la solución de disección en la placa Petri.
Luego limpie cuidadosamente las arterias cerebrales posteriores aisladas eliminando el tejido conectivo usando fórceps afilados de punta fina. Corta las arterias intactas en segmentos de uno a dos milímetros para una digestión enzimática. En este procedimiento, prepare el aparato de trituración con un microscopio, una cámara y una etapa de aluminio que sostenga una cámara y micromanipuladores.
Asegure una microsinga con un controlador de bomba adyacente al escenario y a la muestra. A continuación, rellene completamente una pipeta de valoración con aceite mineral y fíjela sobre el pistón de microsyringe. A continuación, el uso de la microsyringe con el controlador de la bomba retirar alrededor de 130 nanolitros de solución de disociación en la pipeta, garantizando la ausencia de burbujas de aire.
Posteriormente, coloque segmentos arteriales intactos en un mililitro de solución de disociación con las concentraciones necesarias de enzimas en un tubo de vidrio de 10 mililitros. Incubar a 34 grados centígrados durante 10 a 12 minutos para la digestión parcial. Después de la digestión, reemplace la solución enzimática por cinco mililitros de solución de disociación fresca.
Con una pipeta de un mililitro, transfiera un segmento a la cámara que contenga la solución de disociación a temperatura ambiente. A continuación, coloque la pipeta en la solución de disociación en la cámara y colóquela cerca de un extremo del recipiente digerido. Establezca una velocidad dentro del rango de dos a cinco nanolitros por segundo en el controlador de la bomba para una trituración suave.
Mientras se ve a través de 100 veces a 200 veces aumento retirar y expulsar el segmento arterial para disociar las células musculares lisas mientras se produce un tubo endotelial. Si es necesario, utilice cuidadosamente fórceps de punta fina para separar la adventitia disociada y la lámina elástica interna del tubo endotelial. Confirme que todas las células musculares lisas están disociadas y que sólo las células endoteliales permanecen como tubo intacto.
Usando micromanipuladores, asegure cada extremo del tubo endotelial en el resbalón de la cubierta de vidrio de la cámara de superfusión utilizando pipetas de fijación de vidrio borosilicato. Lavar la adventitia disociada y las células musculares lisas de la cámara. Y reemplace la solución de disociación por dos molares más cloruro de calcio PSS.
Transfiera la plataforma móvil con tubo endotelial asegurado al microscopio de superfusión y plataforma experimental. A continuación, utilice seis depósitos limpios de 50 mililitros para la entrega continua de PSS y las respectivas soluciones farmacológicas durante el experimento. Utilice la válvula de control de flujo en línea para ajustar manualmente el caudal tan consistente como el flujo de laminación mientras coincide con la alimentación de flujo con la aspiración al vacío.
Entregar PSS a la cámara para la superfusión del tubo endotelial durante al menos cinco minutos antes de registrar los datos de fondo y la carga del tinte. Para medir el potencial de la membrana simultáneamente con la concentración de calcio intracelular, tire de un electrodo afilado y vuelva a llenarlo con dos cloruros de potasio molar para registrar desde las células cargadas con tinte fura-2. Para estudiar el acoplamiento intracelular mediante transferencia de tinte, rellene el microelectrodo con 0,1%, yoduro de propidio disuelto en dos cloruros de potasio molar.
A continuación, coloque el electrodo sobre un alambre de plata recubierto con cloruro en el soporte de pipeta unido a una etapa de cabeza de electrometámetro asegurada con un micromaniprógrafo. Utilice el micromaniprógrafo para colocar brevemente la punta del electrodo en el PSS que fluye en la cámara, mientras se visualiza a través del objetivo de cuatro veces. Posteriormente, establezca el potencial de la membrana en reposo en cero como consistente con el potencial de baño conectado a tierra.
Si lo desea, utilice monitores de línea base audibles vinculados a electrometros para asociar el tono de sonido con posibles grabaciones. Después, aumente el aumento a 400 veces usando un objetivo de 40 veces y coloque la punta del electrodo justo sobre la célula del tubo endotelial. Ajuste la ventana fotométrica utilizando el software de fotometría para centrarse en aproximadamente 50 a 80 celdas endoteliales.
A continuación, coloque suavemente el electrodo en una de las células del tubo endotelial utilizando el micromaniprógrafo y espere al menos dos minutos para que el potencial de la membrana en reposo se estabilice. Una vez que el potencial de la membrana en reposo sea estable en su valor esperado, encienda el tubo fotomultiplicador en la interfaz de fluorescencia en ausencia de luz y comience la adquisición de la concentración de calcio intracelular por emocionante Fura-2 alternativamente a 340 y 380 nanómetros mientras recoge la emisión de florescencia a 510 nanómetros. Una vez establecidas las mediciones simultáneas del potencial de membrana y la concentración de calcio intracelular, permita unos cinco minutos para la superfusión del tubo endotelial con PSS a un caudal laminar constante antes de la aplicación de fármacos.
Aplique el medicamento preparado en PSS a la cámara de superfusión a un caudal constante. Durante el tratamiento farmacológico medir el potencial de membrana en las proporciones F340/F380 simultáneamente. Una vez hecho el experimento, retire el electrodo de la célula.
A continuación, detenga las grabaciones respectivas del potencial de membrana y la concentración de calcio intracelular y guarde los archivos para el análisis de datos. Se trata de una imagen de contraste de interferencia diferencial de un tubo endotelial arterial cerebral de ratón, ajustado para el experimento en ventana fotométrica utilizando un objetivo de 40 veces. Un electrodo afilado se coloca en una celda, como se muestra en la parte superior de la imagen.
Estos son los ejemplos de trazas en bruto para la medición simultánea de la relación F340/F380 y el potencial de membrana en respuesta a 100 micromolarES ATP. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la microscopía fluorescente confocal, con el fin de responder preguntas adicionales con respecto a la señalización de microdominio de calcio endotelial, y especies reactivas de oxígeno, como ejemplos. En general, esta técnica seguirá allanando el camino para que las investigaciones en fisiología celular exploren la función vascular y el envejecimiento en la sangre y la circulación linfática.
