Bu yöntem, yaşlanma ve kronik hastalıkların gelişimi sırasında serebral kan akımı regülasyonu ile ilgili olarak serebral vasküler fizyoloji alanında anahtar soruların cevap yardımcı olabilir. Bu tekniğin en önemli avantajı, fizyolojik koşullar altında doğal formda serebral arteriyel endotel hücre içi kalsiyum ve membran potansiyelinin eşzamanlı olarak ölçülmesine olanak sağlamasıdır. Fare beyin izole etmek için, mikroskop altında kafatası üzerinde deri ve saç kaldırın.
Ve soğuk kalsiyumiçermeyen PSS ile aşırı kan çıkarın. Daha sonra, standart diseksiyon makas sadece ipuçlarını kullanarak bir kesi olun. Oksipital kemikten başlayıp kafatasının burun kemiğine kadar uzanıyor.
Sonra kesi boyunca kafatasını dikkatlice açın, kaba uçlu çalgılar kullanarak ve beyni ortaya çıkarmak için bağ dokusunu ayırın. Yavaşça kan kaldırmak için bir kabın soğuk kalsiyumsuz PSS ile izole beyin yıkayın. Beyin ventral tarafı kadar serebral arterlerin izolasyonu için soğuk diseksiyon solüsyonu içeren bir odaya yerleştirin.
Serebral arterleri izole etmek için, soğuk diseksiyonu çözeltisi içinde iki paslanmaz çelik pim leri içine yerleştirerek izole beyni cam petri kabının altına kömürle aşılanmış silikon polimer kaplamaya yerleştirin. Daha sonra, cerrahi posterior iletişim ve baziler arterler yaklaşık 0.3 0.5 santimetre segmentleri posterior serebral arterler izole. Petri kabındaki diseksiyon çözeltisinde izole arka serebral arterleri güvence altına almak için paslanmaz çelik pimleri kullanın.
Sonra keskinleştirilmiş ince uçlu forceps kullanarak bağ dokusu kaldırarak dikkatle izole posterior serebral arterler temizleyin. Enzimatik sindirim için bir ila iki milimetrelik segmentlere bozulmamış arterler kesin. Bu işlemde, bir mikroskop, bir kamera ve bir oda ve mikromanipülörler tutan bir alüminyum sahne kullanarak triturasyon cihazı hazırlamak.
Sahneye ve numuneye bitişik bir pompa denetleyicisi ile bir mikroşiniş sabitlayın. Sonraki tamamen mineral yağ ile bir titrasyon pipet backfill ve microsyringe piston üzerinde sabit. Daha sonra pompa denetleyicisi ile mikroşiniş kullanarak hava kabarcıkları olmamasını sağlarken pipet içine dissociation çözeltisi yaklaşık 130 nanolitre çekin.
Daha sonra, 10 mililitrelik cam tüp enzimlerin gerekli konsantrasyonları ile ayrışma çözeltisi bir mililitre içine bozulmamış arteriyel segmentleri yerleştirin. Kısmi sindirim için 10 ila 12 dakika boyunca 34 santigrat derecede kuluçka. Sindirimden sonra, enzim çözeltisini beş mililitre taze dissosiasyon çözeltisi ile değiştirin.
Bir mililitrelik pipet kullanarak, oda sıcaklığında dissosilasyon çözeltisi içeren odaya bir segment aktarın. Daha sonra pipeti bölmedeki dissociation çözeltisine yerleştirin ve sindirilmiş kabın bir ucuna yakın bir yere yerleştirin. Hafif triturasyon için pompa denetleyicisinde saniyede iki ila beş nanolitre aralığında bir hız ayarlayın.
100 kez ilerlerken 200 kez büyütme geri çekilme ve bir endotel tüpü üretirken düz kas hücrelerini ayırmak için arteriyel segmenti çıkarmak. Gerekirse, endotel tüpünden ayrı ayrı adventitia ve iç elastik lamina ayırmak için ince uçlu forceps dikkatle kullanın. Tüm düz kas hücrelerinin ayrıştırılmış olduğunu ve sadece endotel hücrelerinin sağlam tüp olarak kaldığını doğrulayın.
Mikromanipülatörler kullanarak, borosilikat cam sabitleme pipetleri kullanarak süperfüzyon odasının cam kapak fişinde endotel tüpün her iki ucunu sabitlayın. Ayrık adventitia ve düz kas hücrelerini odadan temizle. Ve iki azı daha kalsiyum klorür PSS ile dissosyation çözeltisi değiştirin.
Güvenli endotel tüpü ile mobil platformu süperfüzyon ve deneysel teçhizatın mikroskobuna aktarın. Daha sonra deney sırasında PSS ve ilgili ilaç çözümlerinin sürekli teslimatı için altı temiz 50 mililitrelik rezervuar kullanın. Akış beslemesini vakum emmeyle eşleştirirken akış hızını laminer akışı kadar tutarlı olarak manuel olarak ayarlamak için sıra içi akış kontrol valfini kullanın.
PsS'i arka plan verilerini ve boya yüklemesini kaydetmeden önce en az beş dakika boyunca endotel tüpünün süperfüzyonu için hazneye teslim edin. Hücre içi kalsiyum konsantrasyonu ile aynı anda membran potansiyelini ölçmek için, keskin bir elektrot çekin ve fura-2 boya yüklü hücrelerden kaydetmek için iki molar potasyum klorür ile geri doldurun. Boya transferi ile hücre içi kaplini incelemek için mikroelektrotı iki molar potasyum klorürde çözünmüş %0.1 propidium iyodür ile doldurun.
Sonraki yer bir mikromanipülatör ile güvenli bir elektrometre baş aşamasına bağlı pipet tutucu klorür ile kaplı gümüş bir tel üzerinde elektrot. Dört kat hedefi incelerken elektrotun ucunu odadaki akan PSS'ye kısa bir süre konumlandırmak için mikromanipülörü kullanın. Daha sonra, topraklanmış banyo potansiyeli ile tutarlı olarak sıfıra dinlenme membran potansiyeli ayarlayın.
İstenirse, ses perdesini potansiyel kayıtlarla ilişkilendirmek için elektrometrelere bağlı duyulabilir taban çizgisi monitörleri kullanın. Daha sonra, 40 kat objektif kullanarak büyütme artırmak 400 kez ve endotel tüpü hücre nin hemen üzerinde elektrot ucu konum. Fotometri yazılımını kullanarak fotometrik pencereyi yaklaşık 50 ila 80 endotel hücresine odaklanmak için ayarlayın.
Daha sonra elektrodu mikromanipülatör kullanarak endotel tüpü hücrelerinden birine nazikçe yerleştirin ve istirahat membranı potansiyelinin dengelenmesine en az iki dakika bekleyin. Dinlenme membranı potansiyeli beklenen değerde sabit olduğunda, ışığın yokluğunda floresan arabirimindeki fotoçarpan tüpünü açın ve 510 nanometrede floresan emisyonunu toplarken 340 ve 380 nanometrede heyecan verici Fura-2 ile hücre içi kalsiyum konsantrasyonunu elde etmeye başlayın. Membran potansiyeli ve hücre içi kalsiyum konsantrasyonu eşzamanlı ölçümler ilerler, ilaçların uygulanmasından önce sabit bir laminar akış hızında PSS ile endotel tüpsüperfüzyonu için yaklaşık beş dakika bekleyin.
PSS'de hazırlanan ilacı sabit bir akış hızında süperfüzyon odasına uygulayın. İlaç tedavisi sırasında F340/F380 oranlarındaki membran potansiyeli eş zamanlı olarak ölçülür. Deney yapıldıktan sonra, elektrot hücreden çekilin.
Daha sonra membran potansiyeli ve hücre içi kalsiyum konsantrasyonu ile ilgili kayıtları durdurun ve dosyaları veri analizine kaydedin. Bu bir fare serebral arteriyel endotel tüpü bir diferansiyel girişim kontrast görüntü, fotometrik pencerede deney için ayarlanmış 40 kat objektif kullanarak. Keskin bir elektrot, görüntünün üst kısmında gösterildiği gibi bir hücreiçine yerleştirilir.
Burada 100 mikromolar ATP yanıt f340/F380 oranı ve membran potansiyeli eşzamanlı ölçüm için ham iz örnekleridir. Bu işlemin ardından, konfokal floresan mikroskopi gibi diğer yöntemler, örnek olarak endotel kalsiyumunun mikroetki alanı sinyali ve reaktif oksijen türleri ile ilgili ek soruları cevaplamak amacıyla gerçekleştirilebilir. Genel olarak bu teknik, kan ve lenf atik dolaşımda vasküler fonksiyon ve yaşlanmayı keşfetmek için hücresel fizyoloji araştırmaları için önünü açmak için devam edecektir.
