שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הפיזיולוגיה של כלי הדם המוחיים בכל הנוגע לוויסות זרימת הדם המוחי במהלך ההזדקנות וההתפתחות של מחלות כרוניות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת מדידה בו זמנית של סידן תאי ופוטנציאל קרום של אנדותל עורקי מוחי בצורתו המקורית בתנאים פיזיולוגיים. כדי לבודד את מוח העכבר, מתחת למיקרוסקופ להסיר את העור והשיער מעל הגולגולת.
ולהסיר דם מוגזם עם PSS ללא סידן קר. לאחר מכן, בצע חתך באמצעות רק את קצות מספריים ניתוח סטנדרטי. החל מעצם העורף ונרחב דרך עצם האף של הגולגולת.
ואז לפתוח את הגולגולת בזהירות לאורך החתך, באמצעות מדפים גסים ולהפריד את רקמת החיבור כדי לחשוף את המוח. לשטוף בעדינות את המוח המבודד עם PSS ללא סידן קר במקו כדי להסיר את הדם. מניחים את הצד הגחוני במוח בתא המכיל פתרון ניתוח קר לבידוד של עורקים מוחיים.
כדי לבודד את העורקים המוחיים, לאבטח את המוח המבודד בתתבר ניתוח קר על ידי החדרת שני סיכות נירוסטה דרכו, לתוך ציפוי פולימר סיליקון חדורים בפחם בתחתית צלחת פטרי זכוכית. לאחר מכן, לבודד בניתוח את העורקים המוחיים האחוריים על 0.3 כדי 0.5 ס"מ קטעים מן העורקים האחוריים תקשורת בזילאר. השתמש סיכות נירוסטה כדי לאבטח את שני העורקים המוחיים האחוריים מבודדים בתת פתרון הניתוח בצלחת פטרי.
לאחר מכן נקו את העורקים המוחיים האחוריים המבודדים בזהירות על ידי הסרת רקמת חיבור באמצעות מדפים מחודדים בעלי קצה דק. חותכים את העורקים שלמים למקטע אחד עד שני מילימטרים לעיכול אנזימטי. בהליך זה, הכינו את מנגנון הטריטורציה באמצעות מיקרוסקופ, מצלמה ושלב אלומיניום המחזיק תא ומיקרומניפולטורים.
אבטחו מיקרו-רינג עם בקר משאבה צמוד לבמה ולדגימה. לאחר מכן מלאו מחדש פיפטה עם שמן מינרלי ואבטחו אותה מעל בוכנה מיקרו-סירינג. לאחר מכן באמצעות microsyringe עם בקר המשאבה למשוך כ 130 nanoliters של פתרון דיסוציאציה לתוך פיפטה תוך הבטחת היעדר בועות אוויר.
לאחר מכן, מניחים מקטעי עורקים שלמים לתוך מיליליטר אחד של פתרון דיסוציאציה עם ריכוזים נדרשים של אנזימים בצינור זכוכית 10 מיליליטר. דגירה ב 34 מעלות צלזיוס במשך 10 עד 12 דקות לעיכול חלקי. לאחר העיכול, החלף את פתרון האנזים בחמישה מיליליטר של פתרון דיסוציאציה טרי.
באמצעות פיפיאט מיליליטר אחד, להעביר קטע אחד לתוך התא המכיל פתרון דיסוציאציה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן מניחים את הפיפסה בתת פתרון הדיסוציאציה בתא וממקם אותה קרוב לקצה אחד של הכלי המתעכל. הגדר קצב בטווח של שניים עד חמישה nanoliters לשנייה על בקר המשאבה עבור טריטורציה עדינה.
תוך כדי צפייה דרך 100 פעמים עד 200 פעמים הגדלה לסגת ולפלט את קטע העורקים כדי לנטרל תאי שריר חלקים תוך הפקת צינור אנדותל. במידת הצורך, השתמשו בזהירות במקלות עדינות כדי להפריד בין הרפתקנות ניתוקת לבין למינה אלסטית פנימית מהצינור ה אנדותל. אשר כי כל תאי השריר החלקים נותק, כי רק תאים אנדותל להישאר כמו צינור שלם.
באמצעות מיקרומניפולטורים, לאבטח כל קצה של הצינור אנדותל על החלקת כיסוי הזכוכית של תא עירוי באמצעות פיפטים הצמדת זכוכית borosilicate. לשטוף את ההרפתקה ניתוק ותאי שריר חלקים מהתא. ולהחליף את פתרון דיסוציאציה עם שני טוחנות יותר סידן כלורי PSS.
העבר את הפלטפורמה הניידת עם צינור אנדותל מאובטח למיקרוסקופ של סופרפוזיה ומתקן ניסיוני. לאחר מכן השתמש שישה מאגרים נקיים 50 מיליליטר עבור אספקה רציפה של PSS ופתרונות סמים בהתאמה במהלך הניסוי. השתמש שסתום בקרת זרימה בשורה כדי להגדיר באופן ידני את קצב הזרימה עקבי כמו זרימת למינר תוך התאמת הזנת זרימה יניקה ואקום.
ספק PSS לתא עבור עירוי העל של הצינור ה אנדותל לפחות חמש דקות לפני הקלטת נתוני הרקע וטעינת צבע. כדי למדוד את פוטנציאל הממברנה בו זמנית עם ריכוז סידן תאי, משוך אלקטרודה חדה ומילוי אחורי שלה עם שני אשלגן כלורי טוחן כדי להקליט מתאים עמוסים צבע fura-2. כדי לחקור את הצימוד תאי באמצעות העברת צבע, backfill את microelectrode עם 0.1% פרופידיום יודיד מומס בשני אשלגן כלורי טוחן.
במקום הבא האלקטרודה מעל חוט כסף מצופה כלוריד במחזיק פיפטה מחובר לשלב ראש אלקטרומטר מאובטח עם מיקרומניפולטור. השתמש micromanipulator כדי למקם בקצרה את קצה האלקטרודה לתוך PSS זורם בתא, תוך צפייה דרך המטרה ארבע פעמים. לאחר מכן, להגדיר את פוטנציאל קרום מנוחה לאפס עולה בקנה אחד עם פוטנציאל אמבטיה מקורקע.
אם תרצה, השתמש בצגים בסיסיים נשמעים המקושרים לאלקטרומטרים כדי לשייך צליל עם הקלטות פוטנציאליות. לאחר מכן, להגדיל את ההגדלה ל 400 פעמים באמצעות מטרה 40 פעמים ולמקם את קצה האלקטרודה רק מעל התא של הצינור אנדותל. התאם את החלון הפוטומטרי באמצעות תוכנת הפוטומטריה כדי להתמקד בכ- 50 עד 80 תאים אנדותל.
ואז בעדינות למקם את האלקטרודה לתוך אחד התאים של הצינור אנדותל באמצעות micromanipulator ולחכות לפחות שתי דקות עבור פוטנציאל קרום מנוחה להתייצב. לאחר מנוחת פוטנציאל הממברנה יציבה בערך הצפוי שלה, להפעיל את הצינור photomultiplier על ממשק פלואורסצנטי בהיעדר אור ולהתחיל רכישת ריכוז סידן תאיים על ידי מרגש Fura-2 לסירוגין ב 340 ו 380 ננומטר תוך איסוף פליטת פלורציה ב 510 ננומטר. לאחר מדידות בו זמנית של פוטנציאל קרום וריכוז סידן תאיים הוקמו, לאפשר כחמש דקות עבור עירוי העל של צינור אנדותל עם PSS בקצב זרימה למינארית קבוע לפני היישום של תרופות.
החל את התרופה מוכנה PSS לתא עירוי על בקצב זרימה קבוע. במהלך הטיפול התרופתי למדוד את פוטנציאל הממברנה ביחסי F340/F380 בו זמנית. ברגע שהניסוי נעשה, למשוך את האלקטרודה מהתא.
ואז להפסיק הקלטות בהתאמה של פוטנציאל קרום ריכוז סידן תאי ולשמור את הקבצים לניתוח נתונים. זוהי תמונת ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית של צינור אנדותל עורקי מוחי של העכבר, מותאם לניסוי בחלון פוטומטרי באמצעות מטרה 40 פעמים. אלקטרודה חדה ממוקמת בתא, כפי שמוצג בחלק העליון של התמונה.
להלן הדוגמאות של עקבות גולמיים למדידה בו זמנית של יחס F340/F380 ופוטנציאל קרום בתגובה ל- ATP של 100 מיקרומולרים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקאלית, על מנת לענות על שאלות נוספות לגבי איתות מיקרו-דומיין של סידן אנדותל, ו מיני חמצן תגובתי, כדוגמאות. באופן כללי טכניקה זו תמשיך לסלול את הדרך למחקרים בפיזיולוגיה התאית כדי לחקור את תפקוד כלי הדם והזדקנות במחזור הדם והלימפה.
