يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الكيمياء الحيوية، مثل تعديل البروتينات البروتيوليكية، وكذلك توصيف مثبطات وبروتياس وببتيدات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالفحص السريع لنشاط البروتينات على الببتيدات ، مما يمثل جانب الانقسام من البروتين المعطى. الاستخدام هنا هو لدراسة البروتيسات التي تنشط الانصهار الفيروسي.
الخطوة الأولى في تصميم الببتيد هو الحصول على تسلسل البروتين الانصهار من الفائدة من قاعدة بيانات عامة مثل NCBI أو قاعدة بيانات مسببات الفيروسات. اختيار موقع الاعتراف protease المضي قدما في ببتيد الانصهار وتشمل اثنين إلى ثلاثة الأحماض الأمينية المنبع والمصب من هذا التسلسل. عند طلب الببتيد، وتعديله مع نقل الطاقة الرنين الفلوري أو الزوج فريت، مكا في نهاية المدى وDnp في المدى C.
خلال الفحص، مكا متحمس وتنبعث منها الطاقة الخفيفة التي يتم إخمادها من قبل Dnp طالما الزوج في محيط قريب من بعضها البعض. ومع ذلك ، إذا حدث الانقسام ، لن يتمكن Dnp من إخماد الانبعاثات التي يمكن قراءتها بعد ذلك من قبل قارئ لوحة الفلوريسانس. Resuspend الببتيد وفقا لتوصيات الشركات المصنعة عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا.
على سبيل المثال، إعادة التركيز في 70٪ الإيثانول إلى تركيز نهائي من ميليمولار واحد. إذا لم يُعيد التبُتِيد بشكل جيد جداً عن طريق الأنابيب، ضع الأنبوب الذي يحتوي على الببتيد والمذيب في حمام صوتنة حتى يتم إعادة الاعتماد عليه بالكامل. الاستغناء عن 100 ميكروليتر aliquots من الببتيد في ضوء تخمد أو أنابيب مقاومة لحماية الببتيد من التبييض.
تخزين aliquots في ناقص 20 درجة مئوية. ابدأ هذا الإجراء عن طريق تشغيل قارئ اللوحة والانتظار حتى يتم الانتهاء من الاختبار الذاتي. بعد ذلك، افتح برنامج التشغيل على الكمبيوتر المرفق وتأكد من توصيله بقارئ اللوحة.
فتح الإعداد درجة الحرارة وتعيينه إلى درجة الحرارة المطلوبة للحصول على الأداء الأمثل للبروتياز، وهو 30 درجة مئوية، في هذه الحالة. لإعداد التجربة، انقر فوق إعداد أداة التحكم، واختر الحركة، ثم حدد الفلوريسنسي. أدخل طول موجي مثير من 330 نانومتر و طول موجة انبعاث من 390 نانومتر.
إلغاء تحديد قطع السيارات وتحديد حساسية متوسطة / عادية. اختيار وقت تشغيل ساعة واحدة للمقاس واختيار قياس واحد كل 60 ثانية. تعيين خمس ثوان من خلط قبل القياس الأول، وثلاث ثوان قبل كل قياس.
وأخيراً، حدد الآبار للقراءة. إعداد مخازن الفحص المناسبة للبروتيس كما هو موضح في بروتوكول النص وتهدئة المخازن المؤقتة على الجليد. ضع البوليسترين الأسود الصلب غير المعالج أسفل 96-well على الجليد مع لوحة معدنية رقيقة تحت لدعم التبريد والاستقرار.
من الضروري استخدام لوحة سوداء كلوحة مُقيّمة، لمنع التسرب الفلوري من الآبار المجاورة. في الببتيد، وإعداد ثلاثة تكرارات التقنية لكل مقايسة، وحجم إجمالي قدره 100 ميكرولترات لكل عينة. Pipette الكمية المناسبة من المخزن المؤقت للمقايسة في كل بئر من لوحة المقايسة.
إضافة 0.5 ميكرولتررس من البروتياز إلى كل بئر. إلى ستة آبار، إضافة 0.5 ميكرولترات من العازلة بدلا من protease المعنية. ثلاثة من هذه ستكون ضوابط عمياء والثلاثة الأخرى ستكون ضوابط الببتيد.
إضافة خمسة ميكرولترات من الببتيد إلى تركيز نهائي من 50 ميكرومولار لكل بئر، باستثناء الضوابط الأعمى. إلى كل من الآبار الثلاثة السيطرة على المكفوفين، إضافة خمسة ميكرولترات من العازلة بدلا من الببتيد. إدراج لوحة في قارئ لوحة flourescents وانقر فوق ابدأ.
قبل بدء تحليل البيانات، احفظ ملف التجربة. انقر على التصدير، وتصدير الملف كملف txt. استيراد ملف txt إلى جدول بيانات.
ابدأ التحليل بإنشاء رسم بياني، ورسم وحدات الفلورسنت النسبية على المحور ص مقابل الوقت على المحور س لكل نسخة متماثلة تقنية لكل عينة. حدد نطاق البيانات حيث يكون الرسم البياني في نطاق خطي، والأقرب إلى بداية زيادة الفلوريسنس. رسم البيانات المحددة على الرسم البياني الثاني وإضافة خط اتجاه خطي.
في خيارات خط الاتجاه، حدد معادلة عرض على المخطط. المعادلة سوف تظهر V كحد أقصى، والذي يتوافق مع ميل خط الاتجاه. حساب متوسط الحد الأقصى V لكل عينة من النسخ المتماثلة التقنية الثلاثة.
بعد تكرار التجربة مرتين أكثر، للحصول على ثلاثة تكرارات بيولوجية، حساب الانحراف المعياري استناداً إلى البيانات من النسخ المتماثلة البيولوجية المستقلة الثلاثة. كشف مقايسة انشقاق فروين من فيروس كورونا التنفسي المتعددة الأنواع البشري ، موقع EMC/2012 S2 الرئيسي ، وسلالة HKU205 المزدوجة المتحولة المستمدة من الإبل ، إلى جانب متغيرات متحولة واحدة من EMC/2012 أن الببتيد EMC/2012 كان مشقوقًا بكفاءة ، في حين لم يحدث أي انشقاق تقريبًا من ببتيد S2 الرئيسي من HKU205. تم تخفيض الانقسام من EMC/2012 A-S المتحولة S2 الببتيد رئيس الوزراء بقوة, وكان هناك تقريبا أي انشقاق من EMC/2012 S إلى أنا تحور S2 الببتيد رئيس الوزراء.
وأظهرت آخر مقايسة انشقاق furin فقط الحد الأدنى من الانقسام من المغرب 213 S2 المستمدة من الجمال موقع رئيس الوزراء، مقارنة بفيروس كورونا كورونا كورونا كورونا البشرية، EMC/2012 S2 موقع رئيس الوزراء. وقد لوحظ انشقاق فورين لPtide S1/S2 اطياف، FECV I و 4 S1/S2، ولكن ليس في الببتيد S1/S2 تحور، FIPV أنا أسود S1/S2. وبالمثل، كان furin قادرة على اضماب الببتيد S2 الأولية، FECV الثاني 1683 S2 رئيس الوزراء، ولكن ليس تحور S2 الببتيدات رئيس الوزراء، FECV الأول و 4 S2 رئيس الوزراء، FIPV أنا أسود S2 رئيس الوزراء، وFIPV الثاني 1146 S2 رئيس الوزراء.
بعد هذا الإجراء، يمكن إجراء تحليل البقعة الغربية أو مقايسات الفلوروسين الأمينية، وذلك باستخدام البروتين كامل الطول من الفائدة للتحقق من انقسام البروتين، أو في هذه الحالة، إذا كان الانقسام النتائج في نسخة من fusogenic من بروتين الانصهار الفيروسي.
