تقنيات zymographic الحالية الكشف عن عدد محدود من proteases. يستخدم التصوير الببتيد الفلوري الببتيدات الفلورية الببتيدات الفلورية كركيزة قابلة للتحلل مما يتيح قياس مجموعة أكبر من البروتياز. الميزة الرئيسية لهذا الأسلوب هو انها تصميم وحدات.
تسلسل الببتيد الفلورسنت يحدد التي يتم الكشف عن البروتياز ويمكن بسهولة أن يتم تبديل الببتيد الفلوري مع الببتيد من تسلسل مختلف، والقدرة على الكشف عن البروتياز الأخرى. يمكن أن تساعد هذه التقنية في إعلام تصميم الببتيدات'use كموارب قابلة للتحلل في المواد الحيوية المهندسة مثل تلك المستخدمة في توصيل الأدوية أو تطبيقات هندسة الأنسجة. ويمكن أن يؤدي إدماج هذا الببتيد في هذه التقنية إلى تحديد البروتيات التي تفرز الأنسجة المسؤولة عن التحلل الحيوي.
إن عرض هذه التقنية مهم من أجل تصور النهج متعدد الطبقات الذي هو فريد من نوعه مقارنة مع تقنيات zymography الأخرى. ومن أجل إظهار هذه التقنية، فإن أميا ديشموخ، وهي طالبة دراسات عليا من مختبري. للبدء، إعداد 10٪ polyacrylamide حل هلام حل كما هو موضح في جدول واحد من بروتوكول النص.
مباشرة قبل صب الجل، إضافة TEMED و APS. ثم، ملء وفارغة 1.5 ملليمتر ميني هلام كاسيت في منتصف الطريق مع حل هلام حل. إضافة طبقة رقيقة من الايزوبروبانول إلى الجزء العلوي من هلام البولي أكريلاميد لإنتاج هلام مستوى ومنع فقاعات.
استخدم محلول بقايا البوليكريلاميد لتتبع تقدم تفاعل البلمرة. عندما يكون البولي أكرريلاميد في الأنبوب قد توطدت تماما رد الفعل هو كامل. في حين أن أول حل هلام طبقة البلمرة، استرداد مجموعة Azido-PEG3-Maleimide من التخزين في 20 درجة مئوية والسماح للمكونات للوصول إلى درجة حرارة الغرفة.
ثم، حل مكونات قارورة اثنين في حجم الشركة المصنعة الموصى بها من DMSO. ودوة لمدة 30 ثانية لضمان خلط السوائل بشكل جيد. نقل محتويات قارورة واحدة إلى نظيفة وجافة 100 ملليلتر جولة أسفل قارورة التي تحتوي على شريط ضجة.
على الفور إدراج سدادة الحاجز المطاطي مع الحجاب الحاجز الذي يمكن ثقب مع حقنة في فم القارورة. بعد ذلك، أدخل إبر حقنة قياس 18 في الحجاب الحاجز. قم بتوصيل إحدى إبر الحقن بخزان غاز خامل والسماح للغاز بملء قارورة القاع المستديرة لمدة ثلاث دقائق.
ثم، أغلق الغاز الخامل وفصله عن الإبرة. باستخدام حقنة، حقن المحتويات الكاملة من قارورة اثنين في قارورة. إزالة كل من الإبر والحقنة.
السماح للمكونات لخلط لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أثناء التحريك. بعد هذا إزالة سدادة الحاجز المطاطي ونقل محتويات أنبوب جهاز طرد مركزي نظيف خمسة ملليلتر. مرة واحدة أول حل طبقة هلام قد بولمرة صب قبالة طبقة ايزوبروبانول.
Pipet ملليلتر واحد من المياه دي المتأينة على رأس الجل ومن ثم صب الماء قبالة لشطف هلام. استرداد الببتيد الفلورسنت ثيول وظيفية من التخزين في 80 درجة مئوية. السماح لها أن تذوب في درجة حرارة الغرفة.
إعداد حل هلام حل 10٪ تحتوي على جزيء رابط Azido-PEG3-Maleimide والببتيد الفلورسنت كما هو مبين في جدول واحد من بروتوكول النص. مباشرة قبل صب الجل إضافة TMED و APS. بعد ذلك، تعبئة نصف الجزء المتبقي من الكاسيت هلام مع حل الببتيد هلام حل.
إضافة طبقة رقيقة من الايزوبروبانول إلى الجزء العلوي من هلام البولي أكريلاميد لإنتاج هلام مستوى ومنع فقاعات. استخدم محلول بقايا البوليكريلاميد لتتبع تقدم تفاعل البلمرة. بعد اكتمال التفاعل، صب قبالة طبقة ايزوبروبانول.
Pipet ملليلتر واحد من المياه دي المتأينة على رأس الجل ومن ثم صب الماء قبالة لشطف هلام. إذا لم يكن استخدام المواد الهلامية على الفور، وتخزينها عن طريق غمرها في مربع من البلاستيك مليئة 100 ملليلتر من 1x PBS في أربع درجات مئوية. التفاف مربع في رقائق الألومنيوم لمنع photobleaching.
أولاً، إعداد حل هلام التراص 5٪ كما هو موضح في جدول واحد من بروتوكول النص. مباشرة قبل صب الجل إضافة TMED و APS. املأ الجزء الفارغ المتبقي من الكاسيت الهلامي بمحلول هلام التراص.
قم بإدخال مشط هلام 1.5 ملليمتر بسرعة في طبقة هلام التراص مع التأكد من عدم بقاء أي فقاعات محاصرة تحت الآبار. استخدم محلول بقايا البوليكريلاميد لتتبع تقدم تفاعل البلمرة. عندما يكون رد الفعل كاملاً، قم بإزالة المشط والشرائط من الجزء الخلفي من الكاسيت الجل.
للبدء، قم بحل العينات في المخزن المؤقت النموذجي التقليدي لـ zymography. إضافة 400 ملليلتر os 1X tris الجليسين SDS تشغيل المخزن المؤقت لجهاز هلام. تحميل ما يصل إلى 35 ميكرولترات من عينة في بئر.
تشغيل العينات في 120 فولت في أربع درجات مئوية لمدة ساعة ونصف أو حتى معايير الوزن الجزيئية تشير إلى أن البروتياز من الاهتمام هي ضمن طبقة هلام الببتيد حل. بعد ذلك، قم بإزالة المواد الهلامية من الكاسيت البلاستيكي. غسل المواد الهلامية ثلاث مرات في إعادة naturing العازلة في درجة حرارة الغرفة تحت التحريض لطيف.
مع كل غسل، تدوم 10 دقائق. نقل المواد الهلامية إلى محلول التخزين المؤقت المتطور لمدة 15 دقيقة. ثم استبدال الحل مع عازلة النامية الطازجة واحتضان في 37 درجة مئوية تحت التحريض لطيف لمدة 24 ساعة.
بعد ذلك، استخدم جهاز تصوير ماسح ضوئي هلامي فلوري مع الإثارة المناسبة ومرشحات الانبعاثات لصورة المواد الهلامية. في هذه الدراسة إلى الببتيدات الفلورية التحلل يتم دمجها في المواد الهلامية البولي أكرريلاميد. QGIW هو الكولاجين واحد مشتق تسلسل مصممة للكشف عن الكولاجين الخلوية، في حين LACW هو التسلسل الذي تم تحسينه للكشف عن MMP-14 و MMP-11.
يكشف التصوير الفلوري عن العديد من النطاقات داخل جل الببتيد LACW ، في حين لا يظهر سوى نطاق واحد في المواد الهلامية QGIW. عند مقارنتها بزيموغرافي الجيلاتين، فإن جلات الـ LACW قادرة على اكتشاف نطاقات أكثر بروتوية، مما يدل على قدرة zymography الببتيد على الكشف عن مجموعة أوسع من البروتياز الموجودة داخل العينات البيولوجية من الطرق التقليدية باستخدام ركائز أصلية. ثم يتم احتضان خلايا zymography الببتيد في عازلة التنمية التي تحتوي إما GM6001، وهو مثبط MMP الطيف الواسع، أو E64، وهو مثبط cathepsin العام.
علاج المواد الهلامية الببتيد LACW مع GM6001، يقلل من شدة العصابات. في حين أن العلاج مع E64 ليس له تأثير ملحوظ. ينتج عن علاج المواد الهلامية الببتيد QGIQ مع GM6001 الاستئصال الكامل للعصابات التي شوهدت سابقًا.
في حين أن E64 ليس له أي تأثير. يتم إجراء zymography الجيلاتين باستخدام تنقية، تنشيط MMP-9 لمقارنة حساسية zymography الببتيد إلى معيار الذهب الحالي. المواد الهلامية LACW قادرة على الكشف عن أصغر تركيزات MMP-9.
تتطلب البروتياسات شروطًا محددة لإعادة الطبيعة وتصبح نشطة. إعداد حلول المخزن المؤقت بعناية لضمان أن التكوين و PH صحيحة. ويمكن استكمال هذه الطريقة بتقنيات قائمة للتحقق من الهوية وإجراء مزيد من التحليل للبروتياتيات المقاسة.
وهذا يشمل غرب النشاف، PCR في الوقت الحقيقي، وقياس الطيف الشامل. كن حذرا عند التعامل مع البولي أكريلاميد. ويعتبر حل غير اقوياء العصبية وينبغي دائماً ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة عند التعامل معها.
